結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者射頻消融術(shù)后小核仁RNA宿主基因15變化及意義

郭新宇，田鵬，張鵬，劉毅，劉健康

河南省人民醫(yī)院普外科，鄭州 450000

近年來，中國結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響人們的身體健康[1]。肝臟是結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最為常見的器官[2]。相關(guān)研究表明，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移后無治療生存期約5～12個月[3]，即使接受根治性切除術(shù)治療，仍有50%的患者因其他部位轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而死亡[4]。此外，結(jié)直腸癌患者發(fā)生多處轉(zhuǎn)移，很難通過根治性手術(shù)徹底切除。射頻消融術(shù)具有微創(chuàng)、安全及效果明顯等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)體腫瘤治療[5]。研究顯示，實(shí)體腫瘤患者經(jīng)射頻消融術(shù)治療后恢復(fù)較快，且并無嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥[6]。目前，與根治性切除術(shù)相比，越來越多的肝癌、非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體瘤患者更傾向于選擇射頻消融術(shù)治療。雖然射頻消融術(shù)可在一定程度上根治腫瘤，但仍有部分患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，最終死亡[7]。因此，及時了解結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后情況對后續(xù)治療意義重大，但目前缺乏靈敏度和特異度均較高的生物標(biāo)志物。

長鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）是一類調(diào)控基因表達(dá)的不編碼蛋白質(zhì)的RNA[8]。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的lncRNA被證實(shí)與人體疾病有關(guān)。多項(xiàng)研究證實(shí)，HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、母系印記表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）和小核仁RNA宿主基因15（small nucleolar RNA host gene 15，SNHG15）等多個lncRNA參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[9-12]。SNHG15可轉(zhuǎn)錄8種小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）。本研究通過比較治療前后血清SNHG15相對表達(dá)量的變化，分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者射頻消融術(shù)治療的預(yù)后評估提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年3月至2016年4月河南省人民醫(yī)院收治的58例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)腫瘤為結(jié)直腸癌，并經(jīng)影像及病理學(xué)等檢查確診為肝轉(zhuǎn)移；②接受射頻消融術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受放、化療、靶向治療、免疫治療及根治性手術(shù)治療等；②發(fā)生肝轉(zhuǎn)移以外的其他組織轉(zhuǎn)移；③合并自身免疫性疾病或血液系統(tǒng)疾病等；④臨床資料不完整。58例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中男42例，女16例；平均腫瘤直徑為（3.18±0.44）cm；腫瘤數(shù)目：單發(fā)43例，多發(fā)15例（2～3個，共計(jì)75個肝轉(zhuǎn)移瘤）；血管侵犯20例，無血管侵犯38例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 射頻消融術(shù) 術(shù)前檢測患者血常規(guī)、血生化、凝血時間等。術(shù)中監(jiān)測患者的血氧飽和度、血壓、脈搏和心率等?；颊咂脚P，消毒，鋪巾，1%利多卡因進(jìn)行局部麻醉。在計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）引導(dǎo)下將射頻消融針穿刺至腫瘤中央，選擇適宜射頻電壓進(jìn)行治療。治療后，觀察腫瘤是否完全消融，若腫瘤完全消融，調(diào)節(jié)為凝固模式，燒灼針道。術(shù)后給予鎮(zhèn)痛、抗感染及其他對癥治療等。

1.2.2 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測血清SNHG15miRNA 的相對表達(dá)量 抽取結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者肘部靜脈血10 ml，3500 r/min，離心15 min，提取上層清液于離心管中，低溫保存，待驗(yàn)。將Trizol試劑加入提取的血清中提取血清總RNA，若A260/A280為1.8～2.0，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)；提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，退火15 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct計(jì)算SNHG15miRNA的相對表達(dá)量。SNHG15正向引物 5'-GGTGACGGTCTCAAAGTGGA-3'，反向引物 5'-CAGAGTTGGGGTCTCTGCAA-3'；GAPDH正向引物5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

1.2.3 隨訪方法 采用復(fù)診、住院觀察及電話隨訪等方式于出院后1個月對患者開始隨訪，每月隨訪1次，隨訪4～36個月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)；結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的影響因素采用Cox多因素分析；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線及曲線下面積（area under curve，AUC）評估SNHG15對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的診斷效能；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG15miRNA 相對表達(dá)量的比較

射頻消融術(shù)治療前，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清SNHG15miRNA的相對表達(dá)量為（2.86±0.67），明顯高于射頻消融術(shù)治療后結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清SNHG15miRNA的相對表達(dá)量（1.77±0.45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.604，P＜0.01）。

2.2 預(yù)后情況的比較

58例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者1、2和3年的生存率分別為91.38%（53/58）、68.97%（40/58）和62.07%（36/58）。

2.3 SNHG15對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的診斷價(jià)值

經(jīng)射頻消融術(shù)治療3年后，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者生存36例，死亡22例，分別作為生存組和死亡組。生存組患者血清SNHG15miRNA相對表達(dá)量為（1.52±0.34），明顯低于死亡組患者的（2.17±0.30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.343，P＜0.01）。血清SNHG15診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的AUC為 0.924（95% CI：0.823～0.977），約登指數(shù)為0.722，其所對應(yīng)的最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為1.78、100.00%和72.22%。（圖1）

圖1 血清SNHG15診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的ROC曲線

2.4 SNHG15miRNA 相對表達(dá)量與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者3年預(yù)后的關(guān)系

以SNHG15miRNA相對表達(dá)量為1.78為臨界值，SNHG15miRNA相對表達(dá)量＞1.78結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者（n=40）的平均總生存時間為18.61個月（95% CI：14.24～22.98個月），低于SNHG15miRNA相對表達(dá)量≤1.78結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者（n=18）的平均總生存時間34.10個月（95% CI：32.47～35.73個月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.107，P＜0.05）。（圖2）

圖2 SNHG15miRNA相對表達(dá)量＞1.78（n=40）與SNHG15 miRNA相對表達(dá)量≤1.78（n=18）結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的生存曲線

2.5 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后影響因素的單因素和多因素分析

將可能影響結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的相關(guān)因素，如年齡、性別、腫瘤直徑、甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）水平、Child-Pugh分級、分化程度、腫瘤數(shù)目、血管侵犯情況及SNHG15miRNA相對表達(dá)量作為自變量，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的總生存時間作為因變量納入Cox單因素分析，結(jié)果顯示，AFP水平、分化程度、血管侵犯情況及SNHG15miRNA相對表達(dá)量可能與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后相關(guān)。將AFP水平、分化程度、血管侵犯情況及SNHG15miRNA相對表達(dá)量作為自變量，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的總生存時間作為因變量納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示，血管侵犯情況和SNHG15miRNA相對表達(dá)量與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者總生存時間密切相關(guān)。（表1）

表1 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后影響因素的Cox單因素和多因素分析

3 討論

SNHG15位于7p13染色體[13]，已被證實(shí)參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，如胃癌、骨肉瘤等[14-15]。近年來，越來越多的lncRNA被證實(shí)與腫瘤臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)[16-19]。研究顯示，胃癌患者SNHG15高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[20]。但關(guān)于SNHG15在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)情況，是否與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后相關(guān)仍不得而知。為此，本研究采用定量RT-PCR法檢測了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清SNHG15的相對表達(dá)量，分析其與患者預(yù)后的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，射頻消融術(shù)治療前，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清SNHG15miRNA的相對表達(dá)量高于治療后血清SNHG15miRNA的相對表達(dá)量，表明SNHG15可能與肝轉(zhuǎn)移瘤有關(guān)。本研究通過對58例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行跟蹤隨訪，了解其生存預(yù)后情況，并比較了不同預(yù)后患者血清SNHG15miRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)射頻消融術(shù)治療后，生存組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清SNHG15miRNA的相對表達(dá)量低于死亡組患者，推測SNHG15miRNA的相對表達(dá)量可能對評估結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后具有重要價(jià)值。為驗(yàn)證上述推斷，本研究采用ROC曲線評估SNHG15對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNHG15miRNA的相對表達(dá)量診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的AUC為0.924，表明SNHG15診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的效能較高，具有一定臨床參考價(jià)值。此外，本研究還分析了不同SNHG15miRNA相對表達(dá)量的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者生存時間，結(jié)果顯示，SNHG15miRNA相對表達(dá)量＞1.78的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者平均總生存時間為18.61個月，低于SNHG15miRNA相對表達(dá)量≤1.78的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的平均總生存時間。上述結(jié)果表明SNHG15的相對表達(dá)量可能與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的生存時間有關(guān)。本研究采用Cox單因素及多因素回歸分析進(jìn)一步探討結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的影響因素，結(jié)果顯示，血管侵犯情況和SNHG15miRNA相對表達(dá)量與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者總生存時間密切相關(guān)，SNHG15miRNA的相對表達(dá)量越高，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)越高。

綜上所述，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者射頻消融術(shù)后SNHG15miRNA的相對表達(dá)量降低，其相對表達(dá)量與射頻消融術(shù)治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后密切相關(guān)，檢測結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清SNHG15miRNA的相對表達(dá)量有助于評估患者的生存預(yù)后，為肝轉(zhuǎn)移瘤的靶向藥物研制提供了方向。本文雖證實(shí)SNHG15miRNA的相對表達(dá)量與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后密切相關(guān)，但因樣本量有限，仍需進(jìn)行大樣本、多中心研究，以避免樣本量小、個體差異及抽樣誤差所造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偶然性和隨機(jī)性。