奶牛脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究

羅惠娜 樊全寶 江文康 趙明明 王靜靜 羅冬章 王丙云

摘要：【目的】建立奶牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AD-MSCs）體外分離培養(yǎng)體系，并進(jìn)行增殖能力檢測(cè)、分化能力鑒定及生物學(xué)特性研究，為推廣AD-MSCs在畜牧生產(chǎn)及其疾病治療等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。【方法】通過(guò)I型膠原酶消化法分離奶牛AD-MSCs并進(jìn)行代傳培養(yǎng)，繪制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生長(zhǎng)曲線及測(cè)定其群體倍增時(shí)間，分別采用流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物;使用干細(xì)胞成骨/成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基進(jìn)行奶牛AD-MSCs成骨成脂誘導(dǎo)分化，經(jīng)茜素紅和油紅O染色后鑒定其成骨成脂分化能力;并檢測(cè)凍存奶牛AD-MSCs復(fù)蘇后的存活率?！窘Y(jié)果】分離及傳代培養(yǎng)獲得的奶牛AD-MSCs在體外培養(yǎng)條件下呈長(zhǎng)梭形，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其生長(zhǎng)曲線呈典型的S形，符合Logistic生長(zhǎng)規(guī)律。奶牛AD-MSCs高表達(dá)MSCs表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90和CD105，但不表達(dá)白細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45;分別使用干細(xì)胞成骨/成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)的奶牛AD-MSCs經(jīng)茜素紅和油紅O染色后，顯微鏡下可觀察到大量的鈣結(jié)節(jié)和紅色脂肪滴。凍存6個(gè)月后進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，奶牛AD-MSCs的存活率高達(dá)96%;復(fù)蘇奶牛AD-MSCs培養(yǎng)4 h內(nèi)貼壁，呈典型的長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)72 h細(xì)胞融合達(dá)80%～90%?！窘Y(jié)論】通過(guò)I型膠原酶消化法從奶牛腹部脂肪組織分離獲得的奶牛AD-MSCs具有良好的體外增殖能力及多向分化潛能，為畜牧生產(chǎn)研究及奶牛疾病治療提供了一種良好的種子細(xì)胞來(lái)源。

關(guān)鍵詞： 奶牛;脂肪;間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）;生物學(xué)特性;體外增殖能力;分化潛能

Abstract：【Objective】This study aimed to establish in vitro culture system for dairy cow adipose-derived mesenchymal stem cells（AD-MSCs） and conduct proliferation ability detection， differentiation ability identification and the biological characteristics of these cells， provide a theoretical basis for promoting the application of AD-MSCs in animal husban-dry production and disease treatment. 【Method】Collagenase type I digestion method was applied to separate dairy cow AD-MSCs and then sub-cultured in vitro，and then plotted the growth curves，determined its population doubling time of P3， P6 and P9 generation of AD-MSCs. Membrane markers of the cells were identified by flow cytometric analysis and RT-PCR. The ability of osteogenic/adipogenic differentiation was detected by alizarin red stainingand oil red O， then livability of AD-MSCs in cryopreserved cow milk after resuscitation. 【Result】The results revealed that the cultured dairy cow AD-MSCs presented typical long spindle shape， strong refractivity and fine growth status. The growth curve showed a typical S shape， which was in line with the law of Logistic growth curve. The MSCs surface markers CD44， CD73， CD90 and CD105 were highly expressed， while white blood cell surface marker CD45 was rarely detected. After being stained with alizarin red and oil red O using stem cell osteogenic/adipogenic differentiation-inducing complete media， a large number of calcium nodules and red fat droplets were observed under the microscope. After 6 months of cryopreservation， the cells were recovered and the cell survival rate was as high as 96%. The recovered AD-MSCs adhered to the wall after 4 h of culture and showed a typical long spindle shape with good growth status. The AD-MSCs were confluent by 80%-90% after 72 h of culture. 【Conclusion】The AD-MSCs of cows isolated from the abdomen adipose tissue of cows by type I collagenase digestion method have good in vitro proliferation ability and multi-directional differentiation potential， which provides a good seed cell source for animal husbandry production research and cow disease treatment.

Key words： dairy cow;adipose;mesenchymal stem cells（MSCs）;biological characteristics; in vitro proliferation ability; differentiation potential

0 引言

【研究意義】間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一種理想的組織工程種子細(xì)胞，具有自我更新及分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及其他胚層細(xì)胞的潛能（Samsonraj et al.，2017;劉超等，2019），在多種組織損傷修復(fù)與再生方面發(fā)揮著重要作用（Cosenza et al.，2017;Gao et al.，2017;Wang et al.，2017;Zheng et al.，2017;Radwan and Mohamed，2018），是目前應(yīng)用最廣泛的成體干細(xì)胞之一。此外，MSCs在體外易于培養(yǎng)，擴(kuò)增迅速，可分化為多種類(lèi)型的細(xì)胞。因此，加強(qiáng)MSCs生物學(xué)特性研究具有重要的臨床應(yīng)用及科學(xué)研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】骨髓和脂肪組織是MSCs的主要來(lái)源，其中來(lái)源于脂肪組織的MSCs（AD-MSCs）具有來(lái)源豐富、易獲得、增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)（Wilson et al.，2019）。近年來(lái)，MSCs一直是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，有關(guān)MSCs的體外培養(yǎng)體系、分化潛能、生物學(xué)特性及其應(yīng)用等已得到深入認(rèn)識(shí)。Palumbo等（2018）研究表明，MSCs可通過(guò)細(xì)胞間直接接觸和旁分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)其他細(xì)胞的增殖或遷移，加速傷口愈合及其他組織的修復(fù);羅冬章等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，與臍帶、羊膜、骨髓來(lái)源的MSCs相比，AD-MSCs的體外擴(kuò)增能力更強(qiáng)，群體倍增時(shí)間最短，具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。此外，已有大量臨床試驗(yàn)證實(shí)，MSCs對(duì)自身免疫性疾病及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等多種疾病有良好的治療效果（Buehrer and Cheatham，2013），也可通過(guò)MSCs建立大動(dòng)物模型用于人類(lèi)和動(dòng)物的常見(jiàn)疾病研究，同時(shí)在提高家畜繁殖力及改造家畜遺傳性狀等方面均具有重要意義（Hill et al.，2019）。有研究表明，通過(guò)回輸經(jīng)藥物修飾的MSCs可替換或修復(fù)受損的奶牛乳腺組織，并且可增強(qiáng)機(jī)體的自身免疫以對(duì)抗乳房?jī)?nèi)感染（Peroni and Borjesson，2011;Gao et al.，2014）。在獸醫(yī)臨床學(xué)方面，干細(xì)胞治療大家畜骨關(guān)節(jié)炎的療效已得到初步證實(shí)，其機(jī)理在于MSCs具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，能通過(guò)細(xì)胞間相互作用及多種因子分泌來(lái)調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)局部?jī)?nèi)環(huán)境和活化內(nèi)源性祖細(xì)胞，從而發(fā)揮修復(fù)受損軟骨的作用（Glenn and Whartenby，2014）。MSCs還可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)，培育具有抵抗多種疾病的畜群和研制動(dòng)物生物反應(yīng)器，促使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人源α-乳白蛋白等（Donovan et al.，2005;Yang et al.，2011）。【本研究切入點(diǎn)】奶牛作為重要的畜產(chǎn)品來(lái)源動(dòng)物，在畜牧業(yè)中扮演著重要角色，而MSCs在奶牛遺傳育種、品種改良、抗病研究、奶品質(zhì)調(diào)控、體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景（Singh et al.，2010;Capuco et al.，2012;H?eussler et al.，2013），但目前國(guó)內(nèi)有關(guān)MSCs的研究主要集中在人類(lèi)及豬（張慶美等，2015）、犬（Endo et al.，2019）等動(dòng)物上，針對(duì)奶牛MSCs的研究相對(duì)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以奶牛腹部脂肪中的AD-MSCs為研究對(duì)象，通過(guò)膠原酶消化法分離奶牛AD-MSCs，并進(jìn)行增殖能力檢測(cè)、分化能力鑒定及生物學(xué)特性研究，以期為推廣AD-MSCs在畜牧生產(chǎn)及其疾病治療等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

奶牛脂肪組織由廣東省佛山市南海區(qū)獅山江仔奶牛場(chǎng)提供，取自30日齡荷斯坦小公牛。DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗和0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自以色列Biologi-cal Industries（BI）公司，0.1% I型膠原酶購(gòu)自Sigma公司，干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基和干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基購(gòu)自Cyagen公司，RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，CD90、CD45、CD105和CD44抗體購(gòu)自Abcam公司。主要儀器設(shè)備有超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）、超速低溫離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）、PCR儀（Thermofisher公司）及流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 I型膠原酶消化法分離奶牛AD-MSCs及傳代培養(yǎng) 手術(shù)采集奶牛腹部脂肪組織，置于裝有10%青鏈霉素雙抗的組織保護(hù)液中，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，75%酒精噴灑離心管后轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，后續(xù)操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行?；蝿?dòng)離心管以清洗脂肪組織表面的血細(xì)胞2～3次，以含10%青鏈霉素雙抗的PBS浸泡5 min后轉(zhuǎn)移至100 mm的培養(yǎng)皿中，無(wú)菌手術(shù)剪將組織剪碎成1 mm3，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，0.1%（1 mg/mL）I型膠原酶37 ℃下消化2～3 h，直至肉眼無(wú)明顯可見(jiàn)組織塊。組織塊與膠原酶體積比1∶3。經(jīng)100目細(xì)胞篩過(guò)濾后1000 r/min離心5 min，棄上清液;以完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107 Cells/mL，轉(zhuǎn)移至60 mm培養(yǎng)皿，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)體系含DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后，首次半量更換培養(yǎng)基除去大部分血細(xì)胞，以后每3 d更換一次培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，此時(shí)為P0代奶牛AD-MSCs。待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為P1代奶牛AD-MSCs，以此類(lèi)推，依次進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。

1. 2. 2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線制作及群體倍增時(shí)間測(cè)定 分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P2、P5和P8代奶牛AD-MSCs，按5×104 Cells/mL的密度接種于24孔板中，每孔0.5 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隨后每天隨機(jī)消化3孔細(xì)胞，按細(xì)胞—臺(tái)盼藍(lán)體積分?jǐn)?shù)比1∶1混勻，Counstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。持續(xù)8 d，取平均值，繪制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生長(zhǎng)曲線。

根據(jù)對(duì)數(shù)增殖期計(jì)算群體倍增時(shí)間，Patterson公式為DT=t×[lg2/（lgNt-lgNo）]。式中，t為培養(yǎng)時(shí)間，No為首次記錄的細(xì)胞數(shù)，Nt為培養(yǎng) t 時(shí)間后的細(xì)胞數(shù)。采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較以單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)。

1. 2. 3 表面標(biāo)志物鑒定 采用流式細(xì)胞儀鑒定奶牛AD-MSCs表面標(biāo)志物CD44、CD45、CD90和CD105的表達(dá)情況。消化P3代奶牛AD-MSCs，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105 Cells/mL，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，1000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS清洗細(xì)胞，重復(fù)離心，連續(xù)洗滌2次;分別加入CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-PE和CD105-FITC一抗稀釋液50 μL，常溫孵育30 min后以PBS清洗細(xì)胞，離心棄上清液，加入50 μL PBS，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1. 2. 4 總RNA提取、cDNA合成及PCR檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)如表1，采用常規(guī)PCR檢測(cè)CD90、CD44、CD73、CD105和CD45等表面標(biāo)志物的相關(guān)基因。取P5代奶牛AD-MSCs，以RNA提取試劑盒提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1. 2. 5 成骨誘導(dǎo)分化 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代奶牛AD-MSCs，0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105 Cells/mL，接種于24孔板中，每孔0.5 mL。試驗(yàn)分為對(duì)照組和誘導(dǎo)組，每組3個(gè)重復(fù)。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)上清液，PBS清洗2遍，試驗(yàn)組加入干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS、青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松），對(duì)照組加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。每3 d更換一次培養(yǎng)液，直至誘導(dǎo)組出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)。40 g/L多聚甲醛固定30 min，茜素紅染液染色10 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1. 2. 6 成脂誘導(dǎo)分化 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代奶牛AD-MSCs，0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105 Cells/mL，接種于24孔板中，每孔0.5 mL。試驗(yàn)分為對(duì)照組和誘導(dǎo)組，每組3個(gè)重復(fù)。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)上清液，PBS清洗2遍，試驗(yàn)組加入干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基A液（含F(xiàn)BS、青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺、胰島素、IBMX、羅格列酮和地塞米松），對(duì)照組加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。誘導(dǎo)3 d后吸走24孔板中的A液，加入0.5 mL干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基B液，24 h后吸走B液，換回A液繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)。A液和B液交替作用3～5次，繼續(xù)用B液維持培養(yǎng)4～7 d直至脂滴變大變圓。誘導(dǎo)分化完成后，40 g/L多聚甲醛固定30 min，油紅O染色10 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1. 2. 7 奶牛AD-MSCs凍存及存活率檢測(cè) 凍存體系：凍存液為60% FBS+30% DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10% DMSO。取經(jīng)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫表型鑒定的P3代奶牛AD-MSCs，常規(guī)方法收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞，置于離心管中，1000 r/min離心5 min。棄上清液，收集沉淀，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入凍存液，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×106～1×107 Cells/mL，分裝至2 mL凍存管中，每管1.0 mL。置于程序降溫盒中，-80 ℃保存過(guò)夜，第2 d放入-196 ℃液氮保存。細(xì)胞復(fù)蘇：6個(gè)月后復(fù)蘇凍存細(xì)胞，37 ℃水浴鍋中快速溶解，離心后棄上清液，加入適量完全培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，取50 μL細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)按1∶1混合，細(xì)胞計(jì)數(shù)，死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，活細(xì)胞則無(wú)色，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率，重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）=活細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2. 1 奶牛AD-MSCs形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

經(jīng)0.1% I型膠原酶消化得到的原代細(xì)胞（P0代奶牛AD-MSCs），培養(yǎng)24 h時(shí)其表面覆蓋大量懸浮圓形的脂肪細(xì)胞和少許紅細(xì)胞，培養(yǎng)液表面呈油狀;培養(yǎng)至48 h時(shí)，通過(guò)半數(shù)更換培養(yǎng)基除去大多數(shù)雜質(zhì)細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞的貼壁狀態(tài)如圖1-A;原代培養(yǎng)至第4 d，細(xì)胞大量貼壁，形態(tài)呈典型的長(zhǎng)梭形，折光性強(qiáng)（圖1-B）;培養(yǎng)至第8 d，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%（圖1-C），即可傳代;傳代培養(yǎng)至P2代即可得到純化細(xì)胞，傳代細(xì)胞出現(xiàn)均勻分布的紡錘形，呈典型的漩渦狀生長(zhǎng)（圖1-D和圖1-E）;傳代培養(yǎng)至P8代后，細(xì)胞融合的時(shí)間較前面代次變長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)較不規(guī)整，折光性開(kāi)始下降（圖1-F），提示細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)老化。

2. 2 奶牛AD-MSCs的生長(zhǎng)曲線及其群體倍增時(shí)間

繪制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各生長(zhǎng)曲線均呈典型的S形（圖2），分別經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。不同代次細(xì)胞的增殖趨勢(shì)差異不明顯，均存在2 d的潛伏期，從第3 d開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7 d開(kāi)始呈緩慢增長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線逐漸趨于平緩。如圖3所示，隨著奶牛AD-MSCs代次的增加，細(xì)胞群體倍增時(shí)間也逐漸增加，P3代奶牛AD-MSCs的群體倍增時(shí)間為21.73±0.56 h，P6代奶牛AD-MSCs的群體倍增時(shí)間為23.41±0.77 h，P9代奶牛AD-MSCs的群體倍增時(shí)間為28.65±1.30 h，其中，P9代奶牛AD-MSCs的群體倍增時(shí)間極顯著長(zhǎng)于P3和P6代奶牛AD-MSCs，說(shuō)明隨著細(xì)胞代次的增加，其增殖能力減弱。

2. 3 奶牛AD-MSCs表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果

為確認(rèn)分離獲得的細(xì)胞即為奶牛AD-MSCs，對(duì)其進(jìn)行表面標(biāo)志物鑒定。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果如圖4所示，其中，紅色曲線為未加入一抗的奶牛AD-MSCs細(xì)胞對(duì)照組，綠色曲線為檢測(cè)樣本。P3代奶牛AD-MSCs高表達(dá)MSCs表面標(biāo)志物CD44、CD90和CD105，但不表達(dá)白細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45，即分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞符合AD-MSCs特性及鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

2. 4 RT-PCR鑒定結(jié)果

根據(jù)奶牛CD105、CD90、CD73、CD44及CD45基因序列分別設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物，對(duì)P5代奶牛AD-MSCs進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示分離培養(yǎng)獲得的奶牛AD-MSCs表達(dá)CD105、CD90、CD73和CD44等MSCs特異性基因，但不表達(dá)CD45基因（圖5），符合MSCs的特性及鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

2. 5 奶牛AD-MSCs的成骨成脂誘導(dǎo)鑒定結(jié)果

經(jīng)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)5 d后，奶牛AD-MSCs的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，其體積變大，鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿。至誘導(dǎo)第7 d，細(xì)胞堆積連接成片，呈鱗片狀（圖6-A）;誘導(dǎo)第10 d出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，以茜素紅進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色，顯微鏡觀察視野中可見(jiàn)大面積紅色致密結(jié)節(jié)（圖6-B）。經(jīng)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d后，大部分奶牛AD-MSCs的細(xì)胞形態(tài)呈卵圓形（圖6-C），胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多大小不一的脂質(zhì)顆粒，且脂肪滴隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變大，脂肪滴可被油紅O染成紅色（圖6-D）。

2. 6 奶牛AD-MSCs的凍存復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)果

復(fù)蘇液氮凍存6個(gè)月的奶牛AD-MSCs，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)顯示細(xì)胞存活率可達(dá)96%。復(fù)蘇的奶牛AD-MSCs培養(yǎng)4 h內(nèi)貼壁，呈典型的長(zhǎng)梭形（圖7），形態(tài)單一，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好;培養(yǎng)72 h細(xì)胞融合達(dá)80%～90%。凍存前后奶牛AD-MSCs的細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異。

3 討論

從脂肪組織提取細(xì)胞是當(dāng)前干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，自2001年Zuk等在吸脂術(shù)抽取的脂肪中發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞以來(lái)，AD-MSCs的研究逐漸深入。AD-MSCs的分離、培養(yǎng)及凍存等技術(shù)也越來(lái)越完善，其分離方法包括組織塊貼壁法、酶消化法和機(jī)械分離法等（Buehrer and Cheatham，2013;羅冬章等，2019）。目前，有關(guān)動(dòng)物AD-MSCs的研究主要集中在鼠、兔和豬等物種上，針對(duì)奶牛等大型家畜AD-MSCs的報(bào)道較少。王帥帥等（2019）采用胰蛋白酶消化法從3～4月齡初生犢牛腎周脂肪組織中分離獲得脂肪干細(xì)胞，并證實(shí)體外維持?jǐn)?shù)代培養(yǎng)后細(xì)胞仍保持良好生長(zhǎng)狀態(tài)。本研究采集奶牛腹部脂肪組織，使用I型膠原酶消化法分離培養(yǎng)獲得AD-MSCs。相對(duì)于胰蛋白酶，膠原酶較溫和，不受培養(yǎng)基中Ca2+、Mg2+及血清的抑制，且易于撐控濃度、溫度和時(shí)間，消化時(shí)不易對(duì)細(xì)胞造成損傷。本研究分離及傳代培養(yǎng)獲得的奶牛AD-MSCs呈長(zhǎng)梭形，其生長(zhǎng)曲線呈典型S形，符合Logistic生長(zhǎng)曲線規(guī)律。

MSCs是一個(gè)異質(zhì)細(xì)胞群，至今尚未發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)志物，其鑒定方法主要是通過(guò)結(jié)合多方面因素進(jìn)行綜合判定，有關(guān)AD-MSCs的表面標(biāo)志物也尚無(wú)明確定論。2013年，國(guó)際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會(huì)（IFATS）宣布經(jīng)體外培養(yǎng)的AD-MSCs表型為CD31?/CD44+/CD45?/CD73+/CD90+/CD105+（Bourin et al.，2013）。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P4代奶牛AD-MSCs的表面標(biāo)志物CD44、CD45、CD90和CD105，并通過(guò)RT-PCR測(cè)定CD44、CD73、CD90和CD105基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，奶牛AD-MSCs高表達(dá)CD44、CD73、CD90和CD105特異性基因，但不表達(dá)CD45基因，與IFATS公布的結(jié)果一致。同時(shí)結(jié)合相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，奶牛AD-MSCs呈長(zhǎng)梭形、漩渦狀盤(pán)旋排列，類(lèi)似成纖維類(lèi)細(xì)胞形態(tài)特征，因此可判定分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞即為奶牛AD-MSCs。

已有研究證實(shí)，多種動(dòng)物的MSCs均可在體外誘導(dǎo)分化脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等（Vidal et al.，2012;羅冬章等，2019;Endo et al.，2019）。張慶美等（2015）使用地塞米松、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等試劑成功誘導(dǎo)豬骨髓MSCs向脂肪細(xì)胞分化;朱雪敏等（2015）以吲哚美辛為主要的誘導(dǎo)試劑，體外誘導(dǎo)南陽(yáng)牛骨髓MSCs 3～4 d后即可在顯微鏡下觀察到脂肪細(xì)胞小脂滴，同時(shí)使用β-巰基乙醇等誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞分化。本研究分別使用干細(xì)胞成骨/成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基進(jìn)行奶牛AD-MSCs成骨成脂誘導(dǎo)分化，經(jīng)茜素紅和油紅O染色后，顯微鏡下分別觀察到大量的鈣結(jié)節(jié)和紅色脂肪滴，說(shuō)明奶牛AD-MSCs具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的潛能，為今后的相關(guān)研究提供了一種前體種子細(xì)胞。

MSCs在體外多次傳代培養(yǎng)后常出現(xiàn)細(xì)胞老化、細(xì)胞分化及干性丟失等問(wèn)題（Redondo et al.，2018）。細(xì)胞凍存是干細(xì)胞基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容，在體外培養(yǎng)過(guò)程中，為避免細(xì)胞多次傳代，常在低代次將其凍存，使用時(shí)再進(jìn)行復(fù)蘇。AD-MSCs的凍存及復(fù)蘇可保證其在生產(chǎn)應(yīng)用的時(shí)效性、安全性及規(guī)模性，有效彌補(bǔ)AD-MSCs無(wú)法在體外持續(xù)擴(kuò)增傳代的劣勢(shì)。本研究將P3代奶牛AD-MSCs通過(guò)程序降溫盒進(jìn)行程序降溫，并置于-196 ℃液氮凍存，6個(gè)月后進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)顯示細(xì)胞存活率高達(dá)96%;復(fù)蘇奶牛AD-MSCs培養(yǎng)4 h內(nèi)貼壁，呈典型的長(zhǎng)梭形，形態(tài)單一，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好;培養(yǎng)72 h細(xì)胞融合達(dá)80%～90%。說(shuō)明采用本研究的凍存方法可較長(zhǎng)時(shí)間保持奶牛AD-MSCs的細(xì)胞活性，有利于其后續(xù)研究及應(yīng)用。

4 結(jié)論

通過(guò)I型膠原酶消化法從奶牛腹部脂肪組織分離獲得的奶牛AD-MSCs具有良好的體外增殖能力及多向分化潛能，為畜牧生產(chǎn)研究及奶牛疾病治療提供了一種良好的種子細(xì)胞來(lái)源。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）