UPLC-MS/MS法同時測定中成藥和保健食品中非法添加治療高尿酸血癥類藥物

陳宇 盧森華 龐小蓮

摘要：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測中成藥和保健食品中非法添加的7種治療高尿酸血癥類藥物的方法。色譜柱為ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.2%甲酸水溶液-乙腈（流速為 0.3 mL/min）為流動相梯度洗脫;質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行定性定量分析。結(jié)果表明，7種治療高尿酸血癥類藥物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0. 995，在低、中、高3個加標(biāo)水平下的平均回收率為95.49%～104.87%，RSD為1.40%～3.44%，檢出限為0.01～0.30 μg/kg，定量限為 0.04～1.00 μg/kg，6批樣品中有1批樣品檢出了非法添加的化學(xué)物質(zhì)。該方法前處理簡單，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于中成藥和保健食品中7種治療高尿酸血癥類藥物的同時快速定性定量分析。

關(guān)鍵詞： UPLC-MS/MS;中成藥;保健食品;非法添加;高尿酸血癥藥物

Abstract： To establish a method for simultaneous detection of 7 hyperuricemia drugs for treatment illegally added to Chinese patent medicines and health foods by UPLC-MS/MS.The samples were extracted from samples with mobile phase，the column was a ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），a gradient elution with the mobile phase of 0.2% formic acid aqueous solution and acetonitrile solution at a flow rate of 0.3 mL/min. The compounds were detected by electrospray ion source in positive mode with multiple reaction monitoring （MRM） mode.The results showed that all the 7 hyperuricemia drugs for treatment with showed good linearity in their reasonable ranges ，and the correlation coefficients? were greater than 0.995.The average recoveries of low， medium and high concentrations ranged between 95.49% and 104.87%，and the relative standard deviations were 1.40%～3.44%. The LODs were 0.01～0.30 μg/kg and LOQs were 0.04～1.00 μg/kg.Illegal added chemical drugs were found in 1 of the 6 tested practical samples. With the advantages of simple pre-processed，high sensitivity? and accurate results，the method can be used in determination of 7 hyperuricemia drugs for treatment in Chinese patent medicine and health foods.

Key words： UPLC-MS/MS; Chinese patent medicine; health food; illegal addition; hyperuricemia drugs

高尿酸血癥是以體內(nèi)嘌呤代謝紊亂、血尿酸增高為主要特征的病癥，中國的患病率在8.4%～13.3% [1]，并呈逐年上升和年輕化趨勢，不僅可誘發(fā)痛風(fēng)、尿石癥、慢性腎病等疾病，還與肥胖、高血壓、高血糖和血脂紊亂等代謝綜合征密切相關(guān)，痛風(fēng)是其最常見的誘發(fā)疾病，目前中國的痛風(fēng)患病率在1%～3%[2]。研究表明，不法商家為了追求利益在產(chǎn)品中非法添加化學(xué)藥物。普遍認(rèn)為中成藥具有毒副作用小，長期服用可降低高尿酸血癥引起的慢性病風(fēng)險，有些保健食品也打著純天然的旗號宣稱能降尿酸治痛風(fēng)，不法商家利用患者信任中藥、保健食品又急于治病的心理，在中成藥、保健食品中非法添加治療高尿酸血癥或止痛的化學(xué)藥物牟取暴利，但長期服用或超劑量服用含有化學(xué)藥物的中成藥或保健食品會對身體造成嚴(yán)重毒副作用或延誤治療時機，并發(fā)其他慢性病甚至?xí)＜吧黐3-5]。目前，針對中成藥和保健食品中非法添加劑的檢測方法主要有液相色譜法和串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用法[6-19]?？雇达L(fēng)類、風(fēng)濕類非法添加劑大多是以消炎止痛類藥物為主，張秋炎等[12]報道了非法添加丙磺舒、非布司他等9種尿酸調(diào)節(jié)類藥物的LC/MS/MS方法，但是常用來緩解痛風(fēng)癥狀的秋水仙堿和促尿酸排泄的苯溴馬隆未見報道。本試驗建立了同時測定中成藥和保健食品中非法添加秋水仙堿、苯溴馬隆、非布司他、丙磺舒、地塞米松、醋酸潑尼松、吲哚美辛等7種治療高尿酸血癥類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），可為食品藥品監(jiān)管部門日常監(jiān)管提供技術(shù)支撐，打擊不法商家在中成藥和保健食品中非法添加治療高尿酸血癥類藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥

對照品：苯溴馬?。⊿tandford Chemicals，批號AL180726-25，含量98.13%）、丙磺舒（Standford Chemicals，批號為AL181019-01，含量98.07%）、非布司他（Standford Chemicals，批號為YT180112-06，含量99.95%）、地塞米松（Dr.EhrenstorferGembH，批號為100941，含量98.90%）、吲哚美辛（中國食品藥品檢定研究院，批號為100258-200904，含量99.90%）、醋酸潑尼松（中國食品藥品檢定研究院，批號為100012-201407，含量99.50%）、秋水仙堿（中國食品藥品檢定研究院，批號為101176-201202，含量93.60%）;乙腈（色譜純，美國Fisher公司）、甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

6批樣品購自藥店或私人診所，均能治療痛風(fēng)或降低尿酸，分別是保健食品1批，枸杞螞蟻追風(fēng)膠囊（鄭州萬隆生物科技有限公司，批號無）;中成藥3批，復(fù)方風(fēng)濕寧膠囊（廣東羅浮山國藥股份有限公司，批號為L16K052）、追風(fēng)透骨膠囊（湖南德康制藥有限公司，批號為161003）、鹿川活絡(luò)膠囊（河北萬歲藥業(yè)有限公司，批號為160907），診所自制2批，保健藥酒、神效丸。

1.2 儀器

ACQUITY UPLC I-Class/TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源及Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)），美國Waters公司;3K15高速冷凍離心機，德國 SIGMA 公司;HYQ-3110型渦旋混勻器，美國精騏公司;XS-205Du型電子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;柱溫為40 ℃;流速為0.25 mL/min;進樣量為5 μL。流動相A為乙腈，流動相B為含0.2 %甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～1 min，55%A;1～5 min，55%A→15%A;5～5.5 min，15%A→55%A;5.5～7 min，55%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子（ESI）源，正離子模式;毛細(xì)管電壓為3.0 kV;離子源溫度為120 ℃;脫溶劑氣溫度300 ℃;RF透鏡電壓為0.5 V;脫溶劑氣流速為600 L/h;錐孔氣流速為50 L/h;采集模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）采集，監(jiān)測離子參數(shù)見表1，7種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提取離子（定量）質(zhì)譜見圖1。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的制備 精密稱取苯溴馬隆標(biāo)準(zhǔn)品10.49 mg、丙磺舒標(biāo)準(zhǔn)品11.04 mg、非布司他標(biāo)準(zhǔn)品10.45 mg、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品10.69 mg、醋酸潑尼松標(biāo)準(zhǔn)品10.27 mg、秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)品10.40 mg、吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)品11.53 mg，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇溶液適量，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，再從中精密量取0.1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

1.3.4 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密量取秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.4 mL、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品儲備液2.0 mL、醋酸潑尼松標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1.0 mL、丙磺舒標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.4 mL、吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.6 mL、非布司他標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.1 mL、苯溴馬隆標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.4 mL，置同一20 mL容量瓶中，用含0.2%甲酸的乙腈-水（45∶55）溶液定容至刻度，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（每1 mL溶液中含秋水仙堿0.194 68 μg，地塞米松1.057 2 μg，潑尼松0.510 95 μg，丙磺舒0.216 54 μg，吲哚美辛0.345 55 μg，非布司他0.052 225 μg，苯溴馬隆0.205 88 μg）。

1.3.5 供試品溶液的制備 取一次口服用量的樣品，置10 mL具塞離心管中，精密加入10 mL含0.2%甲酸的乙腈-水（45：55）溶液，渦旋混勻1 min，超聲10 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm有機微孔濾膜，取濾液待測。

1.3.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置10 mL容量瓶，用含0.2%甲酸的乙腈-水（45∶55）溶液定容至刻度。按“1.3.1”“1.3.2”色譜和質(zhì)譜條件測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

線性關(guān)系考察結(jié)果見圖2，以進樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各自的回歸方程和線性范圍，外標(biāo)法定量。以最低信噪比S/N =3和S/N=10分別計算7種治療高尿酸血癥類藥物的檢出限（LOD值）和定量限（LOQ值）。7種治療高尿酸血癥類藥物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度較高，相關(guān)系數(shù)均大于0. 995，檢出限為0.01～0.30 μg/kg，定量限為 0.04～1.00 μg/kg（表2）。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗 精密吸取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5.0 μL，連續(xù)進樣7次測定，秋水仙堿、地塞米松、醋酸潑尼松、丙磺舒、吲哚美辛、非布司他、苯溴馬隆7種治療高尿酸血癥類藥物響應(yīng)值的RSD分別為1.8%、1.0%、0.6%、0.8%、3.6%、1.6%、2.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取5.0 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別于0、1、2、4、6、12 h進樣，測定其響應(yīng)值并計算含量，秋水仙堿平均含量為11.574 ng/mL，RSD為1.3%，地塞米松平均含量為69.349 ng/mL，RSD為1.3%，醋酸潑尼松平均含量為33.734 ng/mL，RSD為1.1%，丙磺舒平均含量為13.351 ng/mL，RSD為1.6%，吲哚美辛平均含量為21.100 ng/mL，RSD為3.9%，非布司他平均含量為3.931 ng/mL，RSD為4.0%，苯溴馬隆平均含量為12.120 ng/mL，RSD為4.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 加樣回收試驗 精密稱定復(fù)方風(fēng)濕寧膠囊6份，每份約1.0 g，置10 mL具塞離心管中，在低、中、高3個加標(biāo)水平下分別進行加標(biāo)回收試驗，依次精密加入0.1、0.1、0.2、0.2、0.5、0.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加含0.2%甲酸的乙腈-水（45∶55）溶液，渦旋混勻1 min，超聲10 min，以10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機微孔濾膜，取濾液。分別進樣5 μL，記錄秋水仙堿、地塞米松、醋酸潑尼松、丙磺舒、吲哚美辛、非布司他、苯溴馬隆7種治療高尿酸血癥類藥物的響應(yīng)值并計算回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，在低、中、高3個加標(biāo)水平下的平均回收率為95.49%～104.87%，RSD為1.40%～3.44%，

2.3 樣品的測定

采用所建方法對6批次治療高尿酸血癥類藥物進行測定，每份取一次口服用量，按“1.3.5”方法制備供試品溶液，分別進樣5.0 μL，測定其響應(yīng)值并計算秋水仙堿、地塞米松、醋酸潑尼松、丙磺舒、吲哚美辛、非布司他、苯溴馬隆7種治療高尿酸血癥類藥物的含量，結(jié)果見表4。由表4可知，6批樣品中只有枸杞螞蟻追風(fēng)膠囊非法添加地塞米松，其他樣品均未檢出。

3 討論

本研究比較了0.1%、0.2%甲酸-乙腈體系與0.1%、0.2%甲酸-甲醇體系流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2%甲酸-乙腈體系作為流動相時，響應(yīng)較高，梯度洗脫程序能很好地將7種化合物分開。加入0.2%甲酸時化合物的離子化效率比0.1%時好，質(zhì)譜響應(yīng)值更高。收集到的6批樣品有藥酒、膠囊和丸劑，7種治療高尿酸血癥類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差別也較大，在提取過程中目標(biāo)成分的溶出和溶解度都不一樣。分別考察了甲醇、乙腈、甲醇-水（50∶50）、乙腈-水（50∶50）體系的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇、甲醇-水（50∶50）提取時基質(zhì)干擾較大，可能是甲醇體系將一些極性較大的物質(zhì)一并提取造成的;用乙腈提取時個別目標(biāo)化合物回收率過低，可能是在純有機相中溶解度太低所致，改用乙腈-水（50∶50）提取回收率明顯提高;考慮到與流動相初始比例相近，而且加入0.2%甲酸可明顯改善電離提高響應(yīng)值，因此選擇乙腈-0.2%甲酸水（45∶55）溶液為提取溶劑，回收率得到進一步提高。超聲提取時間分別考察了5、10、15、20、30 min，膠囊內(nèi)容物較快溶散，在5 min即提取完全，丸劑是剪成小塊后提取，10 min也溶散完全，本試驗選擇提取時間為10 min，實際檢測中不同的劑型樣品可適當(dāng)延長超聲提取時間。中成藥和保健食品中成分復(fù)雜、劑型多樣，質(zhì)譜分析尤其是電噴霧質(zhì)譜分析存在基質(zhì)效應(yīng)，主要是由于樣品基質(zhì)中存在磷脂質(zhì)、膽固醇及其脂和蛋白等內(nèi)源性物質(zhì)引起的[20]，影響方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。為消除或補償基質(zhì)效應(yīng)給定量帶來的偏差，可以用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)[21，22]，固相萃取凈化[23，24]，但是以上方法成本較大，本研究采用配制空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)。

研究建立了同時快速測定中成藥和保健食品中7種非法添加治療高尿酸血癥藥物的新方法，包含了臨床治療常用的藥秋水仙堿、苯溴馬隆、非布司他和丙磺舒。從收集到的6批次樣品檢測結(jié)果和文獻(xiàn)報道[6-12]的檢測結(jié)果觀察，目前用于高尿酸血癥的中成藥或保健食品非法添加主要還是以緩解痛風(fēng)癥狀的抗炎止痛藥物為主，由于效果明顯更容易獲得消費者的青睞，而隨著高尿酸血癥、痛風(fēng)診療技術(shù)和藥物應(yīng)用的發(fā)展[25]，對高尿酸血癥的降尿酸藥物應(yīng)用越來越廣泛，在今后的中成藥、保健食品監(jiān)管中有可能會遇到以降低尿酸水平為賣點的產(chǎn)品。本研究所建立方法前處理過程簡單，凈化效果好，專屬性強，目標(biāo)物回收率穩(wěn)定，分析速度快，可滿足實際樣品檢測的需要，可作為該類產(chǎn)品監(jiān)管的重要技術(shù)儲備，改變以往監(jiān)管技術(shù)落后于監(jiān)管需求的現(xiàn)狀。

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