安康市花魔芋matK基因的克隆及分析

周曉帆 李靜 王瑞

摘要：以安康市花魔芋（Amorphophallus konjac）為材料提取基因組，對(duì)matK基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后送生物技術(shù)公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，安康市花魔芋matK基因全長(zhǎng)1 551 bp，預(yù)測(cè)編碼516個(gè)氨基酸;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，花魔芋與Amorphophallus? maxwellii、田陽(yáng)魔芋（Amorphophallus? corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus? krausei）的親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞：花魔芋（Amorphophallus konjac）;matK基因;序列分析;安康市

Abstract： The genome of the Amorphophallus konjac from Ankang city was extracted and the matK gene sequence was amplified. After confirmed by gel electrophoresis， amplified product was sequenced and analyzed. Results showed that the matK gene of Amorphophallus konjac from Ankang city was 1 551 bp in length and predicted to encode 516 amino acids. The phylogenetic tree showed that the Amorphophallus konjac had the closest relationship with Amorphophallus maxwellii， Amorphophallus corrugatus and Amorphophallus krausei.

Key words： Amorphophallus konjac; matK gene; sequence analysis; Ankang city

魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）為多年生天南星科草本植物，是世界上惟一能夠大量提供葡甘露聚糖的重要經(jīng)濟(jì)作物。目前已命名的魔芋種屬達(dá)200多個(gè)，中國(guó)已記載的魔芋屬種約20種[1]，廣泛分布在秦嶺大巴山、四川盆地、云貴高原、滇南和臺(tái)灣等地區(qū)[2]。當(dāng)前的魔芋種植是在傳統(tǒng)的栽培基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，地方品種之間的特性差異較大[3]，種質(zhì)資源性狀差異明顯，遺傳多樣性豐富[4]，為魔芋的分類及種質(zhì)資源鑒定帶來(lái)了一定困難。

近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)已成為檢測(cè)植物種質(zhì)資源多樣性和鑒定種質(zhì)親緣關(guān)系的重要工具，顯示出較好的應(yīng)用前景[5]。matK序列位于葉綠體基因組trnK基因的內(nèi)含子中，是葉綠體基因組蛋白編碼基因中進(jìn)化速率最快的基因之一，被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源的鑒定和親緣關(guān)系的研究[6-8]。位于秦巴腹地的陜西省安康市有著悠久的魔芋種植歷史[9]。本研究從安康市花魔芋（Amorphophallus konjac）中克隆得到matK基因的全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單的生物信息學(xué)分析，為魔芋的種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用花魔芋由安康學(xué)院保存，取新鮮葉片用去離子水沖洗干凈，吸水紙吸干后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠體DNA的提取? 參照Fulton等[10]的方法提取花魔芋的基因組，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃保存。

1.2.2 常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 根據(jù)NCBI公布的芋屬葉綠體基因組序列（GenBank 登錄號(hào)KY769273.1），用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)matK的引物，正向：5′-TGGAAAGATAGGAAGAAGA -3′，反向：5′-CTTAGATTAGATCCCGAAA-3′。 PCR擴(kuò)增體系：ddH2O 35 μL，10×緩沖液（buffer）5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，100 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L正向引物2 μL，10 μmol/L反向引物2 μL，5 U/μL Taq酶1 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，變性、退火、延伸3個(gè)階段34個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 測(cè)序及分析 PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)得的序列用BioEdit軟件進(jìn)行處理，在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網(wǎng)站進(jìn)行Blast 比對(duì)，用MEGA 7.0構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠分析顯示，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約1 800 bp（圖1），與預(yù)期相符。對(duì)測(cè)序結(jié)果分析得知該基因全長(zhǎng)1 551 bp，預(yù)測(cè)編碼516個(gè)氨基酸（圖2）。將該核苷酸序列在NCBI進(jìn)行Blastn，發(fā)現(xiàn)該序列與花魔芋matK基因序列（AF387398.1）有2個(gè)堿基的差異，序列相似性達(dá)99%。

2.2 matK基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以桑樹(shù)（Morus alba）為外類群，用Neighbor-joining法構(gòu)建魔芋屬matK基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖3）顯示，安康市花魔芋與Amorphophallus maxwellii、田陽(yáng)魔芋（Amorphophallus corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus krausei）的親緣關(guān)系最近。

3 討論

葉綠體基因與核基因組和線粒體基因組相比較為保守，matK序列的進(jìn)化速率快[11]，一般用于科內(nèi)和種間關(guān)系的研究。在植物界中，很難找到一個(gè)合適的DNA條形碼來(lái)區(qū)分所有的物種，在分子水平鑒別物種時(shí)可以采用序列組合的方式，一方面鑒別的準(zhǔn)確性高，另一方面可以分析物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。各國(guó)的研究學(xué)者們?cè)谥参顳NA條形碼的研究中提出過(guò)多種序列組合分析的方案[12]，中國(guó)學(xué)者認(rèn)為三序列組合matK+trnK-psbA+rbcL和兩序列組合matK+rbcL、matK+trnK-psbA、trnK-psbA+rbcL對(duì)芋族有較好的鑒定率，但是采用三序列組合識(shí)別準(zhǔn)確率低于兩序列組合[13]。

本研究克隆并分析了安康市花魔芋的matK序列，Neighbor-joining法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明安康市花魔芋與Amorphophallus maxwellii、田陽(yáng)魔芋（Amorphophallus corrugatus）和西盟魔芋（Amorphophallus krausei）有較近的親緣關(guān)系。鑒于單獨(dú)的matK序列對(duì)親緣關(guān)系鑒定存在一定的局限性，因此今后的研究中可以考慮采用多種序列組合的方式進(jìn)行。

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