血清外泌體miR-148a聯(lián)合miR-106a檢測用于胃癌篩查的研究探討

許超 曾勁韜 黃良祥 王弢 渠香云 董肇楠 賈云莉 馬雪情 曾長青

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第5位，死亡率居第2位，嚴(yán)重威脅著人類健康［1］。由于胃癌發(fā)病隱匿，很多患者在確診時(shí)已經(jīng)處于胃癌進(jìn)展期，預(yù)后較差［2］。因此，探尋胃癌早期診斷標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)，對于降低患者死亡率、改善生存預(yù)后具有重要意義。Trams等［3］在20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)外泌體，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［4-5］。外泌體包裹的miRNA具有更好的生物穩(wěn)定性，目前已成為一類新的腫瘤生物標(biāo)志物［6-7］。本研究旨在探尋合適的外泌體miRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物，輔助臨床進(jìn)行胃癌篩查。

首先，對于已有的文獻(xiàn)、資料報(bào)道中胃癌相關(guān)的miRNA 標(biāo)志物進(jìn)行調(diào)研匯總，篩選出在胃癌研究中（上調(diào)和下調(diào)靶標(biāo)）的miR-375/miR-106a/miR-148a/miR-21/Let-7a 作為候選標(biāo)志物。然后采用qPCR 平臺(tái)的外泌體miRNA 定量檢測（SLEXO-PCR）技術(shù)，從候選標(biāo)志物中篩選出了與胃癌發(fā)生、發(fā)展有較大相關(guān)性的外泌體miRNA鑒別診斷組合。

初步臨床樣本評價(jià)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-106a、miR-148a、miR-375檢測區(qū)分胃癌效果相對較好。采用組織樣本對候選miRNA靶標(biāo)檢測驗(yàn)證。結(jié)果顯示，miR-148a/miR-106a聯(lián)合檢測具有顯著優(yōu)勢。進(jìn)一步進(jìn)行更大范圍的組織學(xué)及血清外泌體檢測進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2017年9月至2018年9月在福建省立醫(yī)院診治的初診胃癌術(shù)后標(biāo)本共37 對（胃癌組織及癌旁組織）進(jìn)行組織學(xué)miRNA 檢測。選取初診胃癌患者83例為胃癌組，選取同期在本院行胃鏡檢查，病理為良性病變的患者78例為對照組。對上述兩組進(jìn)行血清外泌體miRNA檢測。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）胃癌組：①均經(jīng)內(nèi)鏡及手術(shù)病理確診；②入院前均未接受任何腫瘤相關(guān)性手術(shù)、放化療及其他腫瘤相關(guān)治療；③無合并其他腫瘤；④無心、肝、腎等其他器官功能障礙者。2）對照組：①經(jīng)胃鏡檢査，未見明顯異常，病理為良性病變；②無胃部腫瘤或其他臟器腫瘤病史；③無心、肝、腎等其他器官功能障礙者。入選患者均知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：1）孕期及哺乳期患者；2）RNA類病毒感染者，如甲肝、丙肝、丁肝、戊肝肝炎病毒，流感病毒等。

1.2 方法

1.2.1 組織學(xué)檢測 1）剪切組織，充分勻漿；每次使用前，剪刀酒精過火，DEPC 處理水洗4 次；剪切下1份組織之前，做同樣處理；2）采用Trizol 法進(jìn)行組織miRNA 提?。?）在NanoDrop 2000 上分析RNA 濃度、純度；4）將組織miRNA濃度以50 ng/μL進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；5）組織miRNA 檢測（同血清外泌體miRNA 檢測類似，不同的是組織miRNA 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 產(chǎn)物濃度過高，需要統(tǒng)一稀釋1 000倍后再進(jìn)行檢測）。

1.2.2 血清學(xué)檢測 1）取外周血5 mL，分離血清；2）血清外泌體提取試劑盒（ExoQuick exosome precipitation solution）購自美國SBI公司。外泌體miRNA提取試劑盒（miRNeasy Mini Kit）購自德國Qiagen公司。胃癌外泌體miRNA（RT-qPCR）檢測試劑盒購自江蘇為真生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司。3）用ExoQuick exosome pre?cipitation solution提取試劑盒提取血清外泌體待裂解。本研究通過透射電鏡、Western blot和NTA對提取的血漿外泌體特性進(jìn)行鑒定。在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)血清外泌體為一側(cè)凹陷的半球形（圖1）；CD81和Alix蛋白分別為定位于外泌體膜上和膜內(nèi)的蛋白標(biāo)志物，經(jīng)Western blot曝光后成功顯現(xiàn)（圖2，3）；NTA示外泌體粒徑約105 nm，濃度約4.3E+11（粒子/mL）（圖4）。4）使用miRNeasy Mini Kit提取純化RNA，NanoDrop 2000檢測RNA濃度，記錄濃度、A260/230、A260/280值。5）逆轉(zhuǎn)錄及qPCR上機(jī)檢測（以miR-106a為例）：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，包括2×miR-106a RTMix 10 μL，無核酸酶水8 μL，miRNA模板2 μL（循環(huán)參數(shù)：42℃，30 min；85℃，5 min；4℃，hold）。反應(yīng)產(chǎn)物cDNA稀釋10倍作為后續(xù)PCR反應(yīng)模板。PCR體系為20 μL，包括2×miR-106a PCR Mix 10 μL，無核酸酶水8 μL，cDNA 模板2 μL（循環(huán)參數(shù)：37℃，5 min；94℃，5 min；94℃，15 s和60℃，60 s共50個(gè)循環(huán)；50℃，30 s）。

需注意的是所有miRNA標(biāo)志物和GAPDH反應(yīng)體系類似，逆轉(zhuǎn)錄熱循環(huán)條件及PCR熱循環(huán)條件相同，可同時(shí)同板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR檢測。miR-106a的相關(guān)引物：（miRNA 序列標(biāo)準(zhǔn)品）has-miR-106a AAAAGUGC UUACAGUGCAGGUAG，（逆轉(zhuǎn)錄）Stem-Loop RT Primer：5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCAT CCTACCTG-3'，（PCR上游引物）Forward primer：5'-GAG GTCAGGGAAAAGTGCTTACAGTGCA-3'，（通用下游引物）Reverse primer：5'-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCA A-3'，（PCR探針）probe：5'-FAM-TTTCCTCATCCTAC CTG-MGB3'。miR-148a的相關(guān)引物：（miRNA序列標(biāo)準(zhǔn)品）has-miR-148a-3p UCAGUGCACUACAGAACU UUGU，（逆轉(zhuǎn)錄）Stem-Loop RT Primer：5'-GATGAGGA GTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCACAAAGT-3'，（PCR上游引物）Forward primer：5'-GAGGTCAGGGT CAGTGCACTACAGAAC-3'，（PCR探針）probe：5'-FAMTTTCCTCATCACAAAGT-MGB3'，（通用下游引物）Reve rse primer：5'-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)PCR上機(jī)數(shù)據(jù)獲得GAPDH質(zhì)控結(jié)果，判讀樣本質(zhì)量是否符合要求。采用miRNA（miR-106a、miR-148a）標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋檢測，用以檢測體系線性范圍、定量限、檢測下限及臨床樣本檢測擴(kuò)增效率評價(jià)。根據(jù)PCR上機(jī)數(shù)據(jù)獲得miRNA（miR-106a、miR-148a）標(biāo)志物的檢測CP值和表達(dá)量（拷貝量/μL）。根據(jù)相對定量公式計(jì)算檢測結(jié)果△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a），檢測結(jié)果（相對定量）=2-△△CP。將檢測結(jié)果與臨床樣本（病理診斷）對比統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 17.0軟件、MedCalc V15.2做出ROC曲線，得出cut-off值，計(jì)算符合率。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)（用表示）或Mann-Whitney U檢驗(yàn)［采用M（P25，P75）表示］，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 外泌體電鏡觀察

圖2 外泌體特異性靶標(biāo)分析（CD81）

2 結(jié)果

2.1 組織差異性檢測結(jié)果

檢測37 對胃癌組織及癌旁組織中miR-148a 和miR-106a的CP值和表達(dá)量、通過相對定量公式計(jì)算2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］。與癌旁組織相比，癌組織中miR-148a 表達(dá)水平降低，miR-106a 表達(dá)水平升高，聯(lián)合檢測2-△△CP值降低（均P<0.05，圖5）。分別制作ROC曲線評價(jià)其對胃癌組織和癌旁組織的預(yù)測能力?；趍iR-148a表達(dá)量的ROC曲線，AUC 為0.779（95%CI：0.659～0.898，P<0.001）（圖6A）；基于miR-106a 表達(dá)量的ROC 曲線，AUC 為0.668（95%CI：0.545～0.791，P=0.013）（圖6B）；基于2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC 曲線，AUC為0.869（95%CI：0.777～0.960，P<0.001）（圖6C）?？梢? 種檢測指標(biāo)均可以用來鑒別胃癌組織和癌旁組織，其中2-△△CP的ROC曲線下面積最大。

通過MedCalc V15.2進(jìn)行3種檢測指標(biāo)的ROC曲線比較，提示miR-148a 和miR-106a 表達(dá)量的ROC 曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-148a表達(dá)量和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-106a表達(dá)量和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC曲線下面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖3 外泌體特異性靶標(biāo)分析（Alix1）

圖4 外泌體NTA分析

圖5 組織學(xué)差異性散點(diǎn)圖

2.2 血清外泌體差異性檢測結(jié)果

檢測83 例胃癌患者及78 例良性對照組血清外泌體中的miR-148a 和miR-106a 的CP 值和表達(dá)量、通過相對定量公式計(jì)算2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］。與對照組相比，胃癌患者中血清外泌體miR-106a 表達(dá)水平降低，聯(lián)合檢測2-△△CP值升高（均P<0.001，圖7A、7B），而血清外泌體miR-148a表達(dá)水平兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7C）。分別制作ROC曲線評價(jià)其對胃癌患者和良性對照組的預(yù)測能力?；趍iR-148a 表達(dá)量的ROC 曲線，AUC 為0.539（95%CI：0.448～0.629，P=0.395）（圖8A）；基于miR-106a 表達(dá)量的ROC 曲線，AUC 為0.749（95%CI：0.673～0.825，P<0.001）（圖8B）；基于2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC 曲線，AUC 為0.844（95%CI：0.782～0.905，P<0.001）（圖8C）。提示血清外泌體miR-106a 和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］均可以用來鑒別胃癌患者和對照組，其中聯(lián)合檢查2-△△CP的ROC曲線下面積最大。而血清外泌體miR-148a 的ROC 曲線下面積在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能鑒別胃癌患者和對照組。

通過MedCalc V15.2進(jìn)行血清外泌體miR-106a和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC曲線比較，miR-106a表達(dá)量和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC曲線下面積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024），提示血清外泌體miRNA聯(lián)合檢查優(yōu)于單獨(dú)檢測血清外泌體miR-106a。

2.3 血清外泌體聯(lián)合檢測2-△△CP值與臨床病理因素的關(guān)系

以2-△△CP值的cut-off 值作為分組指標(biāo)，將全部161例資料以2-△△CP值的cut-off值（0.315 3）作為分組指標(biāo)，分為2-△△CP高值組和2-△△CP低值組，對其臨床基本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)在年齡、性別、合并高血壓、合并糖尿病、合并心血管疾病、吸煙、飲酒方面無顯著性差異。表明上述因素對以聯(lián)合檢查2-△△CP值作為胃癌標(biāo)志物的判斷無影響（表1）。

以胃癌患者組中pT 分期（pT1～2、pT3～4）、pN分期（pN0～1、pN2～3）、腫瘤TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期），分化程度（中高分化、低分化）作為分組變量，腫瘤平均最大直徑（5 cm），對2-△△CP值進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。其中按pT分期分組，2-△△CP值具有顯著性差異，其中pT3～4組2-△△CP值低于pT1～2，其余分組水平2-△△CP值均無顯著性差異。而以pT 分期分組對血清外泌體miR-148a 和miR-106a 的表達(dá)量分別進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，無顯著性差異（表2）。

圖6 組織學(xué)差異性ROC曲線圖

圖7 血清外泌體差異性散點(diǎn)圖

圖8 血清外泌體差異性ROC曲線圖

表1 臨床基本數(shù)據(jù) 例

表2 病理基本數(shù)據(jù)

3 討論

本研究在組織學(xué)水平中發(fā)現(xiàn)，miR-148a 在胃癌組織中下調(diào)，miR-106a 在胃癌組織中上調(diào)，證明了miR-148a 和miR-106a 區(qū)分胃癌組織的潛力。Saka?moto 等［8］發(fā)現(xiàn)miR-148a 在胃癌中表達(dá)下調(diào)，靶向MMP7，提示腫瘤侵襲性和預(yù)后不良。Shi等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-148a 通過調(diào)節(jié)DNMT1 的表達(dá)來抑制DNMT1通過Akt-NF-κB 途徑誘導(dǎo)抑癌基因的高甲基化，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Zhang 等［10］研究發(fā)現(xiàn)miR-148a 下調(diào)胃癌中TGF-β2 和Smad2 的表達(dá)，其中TGF-β 可作為致癌因子，參與增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移，Smad2 的過度表達(dá)與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與胃癌預(yù)后不良有關(guān)，miR-148a 可作為胃癌治療的潛在預(yù)測因子。Zhu等［11］研究發(fā)現(xiàn)miR-106a表達(dá)上調(diào)與胃癌轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，相關(guān)的研究［12-13］證實(shí)miR-106a 在胃癌組織中高表達(dá)，可能通過靶向Fas和TIMP，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。兩種指標(biāo)在癌組織和癌旁組織呈相反趨勢改變，2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］值可加大兩組的差異性，故鑒別癌組織和癌旁組織的ROC曲線下面積最大。

在血清外泌體水平，相比于對照組，miR-148a在胃癌組中有上調(diào)趨勢（差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），Ren等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a 在胃癌細(xì)胞的外泌體中有上調(diào)趨勢；相對于對照組，miR-106a在胃癌組中有下調(diào)趨勢。本研究結(jié)果與組織學(xué)水平的檢查結(jié)果相反。Ohshima等［15］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞可將有抑癌作用的let-7 miRNAs 以外泌體的形式分泌到細(xì)胞外。故推測胃癌組外泌體中miR-148a 呈上升趨勢，miR-106a呈下調(diào)趨勢，可能是腫瘤細(xì)胞將有抑癌作用的miR-148a 以外泌體的形式分泌出去，而保留有致癌作用的miR-106a。兩種指標(biāo)在胃癌組和對照組呈相反趨勢改變，2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］值可加大兩組的差異性，故鑒別胃癌組和對照組的ROC 曲線下面積最大。

聯(lián)合檢查2-△△CP值在血清外泌體水平和組織學(xué)水平呈相反趨勢，主要由計(jì)算因素導(dǎo)致。血清外泌體水平［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］為正值，組織學(xué)其為負(fù)值，經(jīng)2-△△CP變化后，數(shù)據(jù)變化呈相反趨勢。

臨床和病理相關(guān)因素分析中，血清外泌體聯(lián)合檢查2-△△CP值與腫瘤pT 分期相關(guān)，但以pT 分期分組對血清外泌體miR-148a 和miR-106a 的表達(dá)量分別進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，表明2-△△CP值與腫瘤pT分期的關(guān)聯(lián)可能無臨床意義。

綜上所述，本研究選取miR-148a及miR-106a進(jìn)行組織學(xué)定量檢測，分析兩種miRNA在癌組織及癌旁組織表達(dá)的差異性，并進(jìn)行血清外泌體檢測，對比胃癌組與對照組血清外泌體miRNAs的差異，發(fā)現(xiàn)血清外泌體聯(lián)合檢測2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］值可以作為胃癌篩查的手段。