TGF-β1通過調(diào)控脂肪酸合酶促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲*

劉勇剛 黃俊勇 梁基韻 李曦 羅美華

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，中國每年胃癌新發(fā)人數(shù)約占全球胃癌新發(fā)人數(shù)的40%以上，全球胃癌死亡率居惡性腫瘤第2 位［1］。由于早期癥狀隱匿，大部分患者診斷時(shí)已屬于中晚期，局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致治療效果及預(yù)后較差，5年生存率低于20%［2］。研究表明，異常的脂肪代謝與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）是人體內(nèi)唯一能在細(xì)胞內(nèi)合成的長鏈脂肪酸蛋白，屬脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，是聯(lián)系脂質(zhì)合成與腫瘤發(fā)生的重要紐帶［3］。已有研究證實(shí)，F(xiàn)ASN 在胃癌中高表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及化療耐藥相關(guān)［4］。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）認(rèn)為是在正常生理狀態(tài)下、癌癥以及其他病理狀態(tài)下誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）形成最重要的因子，已證實(shí)能促進(jìn)多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移［5］。目前，有關(guān)TGF-β1 通過影響脂肪代謝途徑導(dǎo)致胃癌的發(fā)展研究鮮有報(bào)道，本研究將探討TGF-β1 通過調(diào)控FASN 對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院2016年1月至2018年12月存檔的胃癌手術(shù)切除的石蠟標(biāo)本54例，所有患者術(shù)前均未接受放化療及免疫治療。

1.1.2 主要試劑 免疫組織化學(xué)試劑盒購自上海國源生物技術(shù)有限公司，TGF-β1一抗、FASN一抗購自美國CST公司，鼠抗人、兔抗人GAPDH抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TGF-β1過表達(dá)質(zhì)粒及空載體對(duì)照、siTGF-β1、siFASN及無效對(duì)照均購自上海吉瑪基因公司。Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 所用胃癌細(xì)胞系MGC803、BGC823均購自中國科學(xué)院上海生物工程研究中心。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 將切片依次經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)、清洗、封閉后，將TGF-β1、FASN 一抗抗體以1:50比例進(jìn)行4℃冰箱過夜孵育，PBS液清洗3次后，室溫進(jìn)行二抗孵育，30 min之后使用DAB顯色，蘇木素溶液復(fù)染，脫水透明后封片，重復(fù)晾干后進(jìn)行分析。所有染色結(jié)果均由兩位病理科醫(yī)師單獨(dú)評(píng)估判定，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜呈褐色染色的腫瘤細(xì)胞視為陽性。強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0、弱陽性為1 分、陽性為2 分、強(qiáng)陽性為3 分；陽性腫瘤細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1%～50%為1分、51%～75%為2分、≥76%為3分，將每個(gè)樣本的得分相乘得到最終評(píng)分。評(píng)分≥6分定義為高表達(dá)，評(píng)分<6分定義為低表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 胃癌細(xì)胞系MGC803、BGC823均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。取2 mL處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔2×103個(gè)細(xì)胞），正常培養(yǎng)12 h后采用Li?pofectamine 3000 將3 μg 的質(zhì)粒DNA 或者200 pmoL siRNA 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，6 h 后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot 法檢測蛋白表達(dá)水平 將蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%牛血清蛋白（BSA）室溫封閉1 h 后使用說明書推薦一抗?jié)舛?℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h 后ECL發(fā)光顯示結(jié)果。使用Image pro Plus 圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析。計(jì)算目的因子與內(nèi)參GAPDH 的灰度值比值，該值代表目的檢測因子蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 Real-time PCR檢測基因表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μL cDNA采用SYBR Green法進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR所用引物序列：FASN：F5'-CGACAGCACCA GCTTCGCCA-3，R5'-CACGCTGGCCTGCAGCTTCT-3'；GAPDH：F5'-CGACCACTITGTCAAGCTCA-3'，R5'-CC CTGTTGCTGTAGCC-AAAT-3'。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化后鋪于6孔板，轉(zhuǎn)染對(duì)照片段及干擾片段24 h 后，用10 μL 槍頭均勻劃痕，2.5%胎牛血清的RIPM 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于劃痕后0、48 h對(duì)劃痕進(jìn)行拍照。通過測量殘留劃痕寬度，比較各組細(xì)胞劃痕愈合情況，計(jì)算劃痕修復(fù)率。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 采用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，用200 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液滴入Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中孵育48 h，取出、固定、染色，顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照并計(jì)算出侵襲細(xì)胞數(shù)。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示，采用t檢驗(yàn)比較組間差異，應(yīng)用Pearson correlation 分析TGF-β1 與FASN 在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1、FASN 蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性

采用免疫組織化學(xué)法檢測54 例胃癌組織中TGF-β1 及FASN 蛋白的表達(dá)情況，將同一胃癌組織進(jìn)行連續(xù)病理切片，發(fā)現(xiàn)在TGF-β1 高表達(dá)的組織中，F(xiàn)ASN 蛋白也呈高表達(dá)（圖1）。對(duì)54 例胃癌組織中TGF-β1 及FASN 蛋白表達(dá)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析（表1）發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 與FASN 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.476，P<0.05）。

2.2 TGF-β1正向調(diào)控胃癌細(xì)胞內(nèi)FASN的表達(dá)

對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC823、MGC803 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TGF-β1 過表達(dá)，采用Western blot 及Real-time PCR分別檢測FASN 的蛋白及mRNA 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TGF-β1 過表達(dá)后FASN 的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05，圖2A、B）。同樣，沉默TGF-β1 表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)FASN的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05，圖2C、D）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測胃癌組織中TGF-β及FASN的表達(dá)情況

2.3 FASN參與TGF-β1介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞體外遷移及侵襲

胃癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)TGF-β1 能增強(qiáng)細(xì)胞的遷移及侵襲能力，而通過瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染FASN siRNA，West?ern blot 驗(yàn)證FASN siRNA 沉默效果（P<0.05，圖3A）。共轉(zhuǎn)染FASN siRNA 后，能減弱TGF-β1 引起的Ncadherin蛋白表達(dá)、增強(qiáng)E-cadherin蛋白表達(dá)，劃痕及Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示能明顯減弱TGF-β1 所上調(diào)的細(xì)胞遷移及侵襲能力（P<0.05，圖3B），劃痕實(shí)驗(yàn)顯示能明顯減弱TGF-β1 所上調(diào)的細(xì)胞遷移能力（P<0.05，圖3C、D），Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示能明顯減弱TGF-β1 所上調(diào)的細(xì)胞侵襲能力（P<0.05，圖3E、F）。

表1 TGF-β1與FASN在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 （n=54）

圖2 TGF-β1正向調(diào)控胃癌細(xì)胞內(nèi)FASN的表達(dá)

圖3 FASN參與TGF-β1介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞體外遷移及侵襲

3 討論

胃癌是全球高發(fā)病率及高死亡率的消化道惡性腫瘤。近年來，盡管手術(shù)及內(nèi)科治療方法不斷改善，但胃癌的死亡率卻居高不下［6］。侵襲轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是胃癌患者預(yù)后不良的主要因素之一［7］，但其具體機(jī)制尚未明確。因此，探究相關(guān)的機(jī)制并尋找胃癌新的預(yù)后分子及治療靶點(diǎn)具有非常重要的意義。

腫瘤細(xì)胞增殖迅速，侵襲及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，其惡性生物學(xué)行為依賴于充足的物質(zhì)和能量代謝基礎(chǔ)。正常生理?xiàng)l件下，脂肪酸主要來源于外源性膳食，可基本滿足人體需要。而在腫瘤環(huán)境下，外源性脂肪酸無法滿足其生長供給，腫瘤細(xì)胞即利用內(nèi)源性脂肪酸進(jìn)行其結(jié)構(gòu)的生成及能量代謝。其中，F(xiàn)ASN 在內(nèi)源性脂肪酸的合成途徑中起關(guān)鍵性的作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8］。對(duì)比相應(yīng)正常組織，F(xiàn)ASN在多種人類腫瘤組織中普遍存在表達(dá)異常，為腫瘤組織提供充分的內(nèi)源性脂肪酸，以實(shí)現(xiàn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。已有研究證明，F(xiàn)ASN 在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種腫瘤中處于高表達(dá)水平，且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［9-13］。例如在結(jié)直腸癌患者血清中，F(xiàn)ASN 水平明顯高于健康人群，對(duì)其與臨床病理特征的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 可作為評(píng)估臨床分期及預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子［14］。在乳腺癌患者中，F(xiàn)ASN 陽性患者5年無病生存率僅為51.3%，而陰性患者則高達(dá)89%。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 能通過PI3k/Akt信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移［15］。在腎透明細(xì)胞癌組織中，分析了48 例腫瘤組織免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 與缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypox?ia-inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)呈正相關(guān)，并可促進(jìn)HIF-1α所介導(dǎo)的腫瘤侵襲作用［16］。在胃癌中，研究者通過分析167 例胃癌組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 在胃癌中高表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，與患者的總生存率及復(fù)發(fā)率密切相關(guān)，可能作為預(yù)測胃癌轉(zhuǎn)移及生存的重要因子之一［17］。

FASN 作為脂肪酸從頭合成唯一的關(guān)鍵酶，已經(jīng)成為癌癥診斷和治療的一個(gè)重要因子。研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤的多種惡性特征如轉(zhuǎn)移、抗藥性均可由EMT引起，腫瘤EMT 發(fā)生的機(jī)制研究將為腫瘤的治愈提供新的線索。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN 能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT 形成并促進(jìn)其浸潤和轉(zhuǎn)移［18］。但是，由于誘導(dǎo)EMT 的多種因子間存在相互作用和反饋調(diào)節(jié)，并形成了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，尋找有效調(diào)控EMT 的方法仍然存在諸多挑戰(zhàn)。近年來，越來越多的研究已證實(shí)，TGF-β1對(duì)中晚期腫瘤的促進(jìn)作用突出體現(xiàn)在其對(duì)，EMT的誘導(dǎo)和促進(jìn)功能上，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。目前，已知EMT 是在多個(gè)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外信號(hào)因子下調(diào)控進(jìn)行的，而TGF-β1已被證明是誘發(fā)EMT的一種經(jīng)典細(xì)胞外因子。前期課題組實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，TGF-β1能通過促進(jìn)EMT形成并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移［19］。有體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（A549P、H157P），在順鉑耐藥細(xì)胞株（H157CisR）內(nèi)，F(xiàn)ASN 呈高表達(dá)，并伴有EMT標(biāo)志物升高；在小鼠模型中，應(yīng)用FASN 抑制劑處理后，在耐藥株的腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)EMT標(biāo)志物表達(dá)水平明顯降低；實(shí)驗(yàn)證實(shí)可能存在FASN-TGF-β1-FASN 正向調(diào)控軸，并對(duì)非小細(xì)胞肺癌的順鉑耐藥起到關(guān)鍵作用［20］。

目前，針對(duì)腫瘤中TGF-β1 與FASN 的相關(guān)性研究比較缺乏，二者的相互作用對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移的研究鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中TGF-β1與FASN均高表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者呈正相關(guān)性。在胃癌細(xì)胞株MGC803、BGC823中，使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TGF-β1 過表達(dá)或siRNA 沉默后，檢測FASN在蛋白及基因水平均出現(xiàn)同向的變化，研究提示，TGF-β1能正向調(diào)控FASN的表達(dá)。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染FASN siRNA 后，能減弱TGF-β1引起的N-cadherin 蛋白表達(dá)、增強(qiáng)E-cad?herin 蛋白表達(dá)，劃痕及Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示能明顯減弱TGF-β1 所上調(diào)的細(xì)胞遷移及侵襲能力，表明FASN參與TGF-β1介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞體外遷移及侵襲過程。由此可見，TGF-β1 引起的FASN 表達(dá)上調(diào)是腫瘤發(fā)生EMT 的關(guān)鍵因素之一，從而引起腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。二者在細(xì)胞內(nèi)可能通過復(fù)雜的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)相互作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1能正向調(diào)控胃癌細(xì)胞中FASN的表達(dá)，且FASN在TGF-β1介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移及侵襲作用中發(fā)揮重要作用。然而，TGF-β1調(diào)控FASN表達(dá)具體機(jī)制尚未明確，有待于進(jìn)一步的研究闡明。