一起疑似攝入飲食感染霍亂疫情病原體的實驗室快速檢測

進一步提高實驗室技術(shù)水平，多種檢測方法并用，切實發(fā)揮實驗室檢測在疫情快速準確處置中的重要作用。方法 在應用傳統(tǒng)微生物學鑒定方法的同時，運用實時熒光PCR法和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀進行快速鑒定。結(jié)果 此次疑似霍亂疫情被排除，導致患者發(fā)病的致病性微生物最終鑒定為副溶血性弧菌，血清型為O3：K6型，毒力基因為tlh+、tdh+、trh-，藥物敏感實驗均為敏感。結(jié)論 實驗室多重檢測技術(shù)并用，快速準確高效地為流行病學調(diào)查和醫(yī)療機構(gòu)治療提供了強有力的技術(shù)支撐。

霍亂是由攝入的食物或水受到霍亂弧菌污染而引起的一種急性腹瀉性傳染病，在《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定中屬于甲類傳染病之一，可導致人類急性感染性腹瀉，主要由O1 群和O139群霍亂弧菌引起。病發(fā)高峰期主要發(fā)生在夏季，傳播途徑主要是糞—口傳播，人感染后嚴重者能在數(shù)小時內(nèi)造成腹瀉脫水甚至死亡[1-3]。因此，對于霍亂的快速應對、精準處置、有效控制是控制疫情蔓延的必要手段。其中，實驗室對病原體的快速準確鑒定，是疫情處置的關(guān)鍵支撐。

疫情的發(fā)生及經(jīng)過

2019年8月22日早8點，淄博市疾病預防控制中心接到所轄沂源縣疾病預防控制中心電話，沂源縣醫(yī)院8月21日晚接診一名水樣便腹瀉病人，經(jīng)霍亂快診試劑檢測，報告O139群快診弱陽性?？h醫(yī)院立即報告縣疾控中心，縣疾控中心立即組織專業(yè)人員趕赴現(xiàn)場，進行調(diào)查處置，指導縣醫(yī)院按照腸道傳染病進行隔離治療并采集病人標本，帶回縣疾控進行檢驗。8月22日早7點，挑取可疑菌落進行快診檢驗，仍然顯示O1群弱陽性。隨即，沂源縣疾控中心立即報告淄博市疾控中心，并派專人專車將病人糞便及相應增菌液、分離平板上送市疾控中心進行復核檢驗。

實驗室檢測復核

實驗材料

3%NaCl堿性蛋白胨水（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）、4 號瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）、弧菌顯色培養(yǎng)基（科瑪嘉）、TCBS瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）、霍亂弧菌ctxAB核酸熒光PCR法檢測試劑盒（深圳生科原）、副溶血性弧菌三重核酸熒光PCR法檢測試劑盒（深圳生科原）、副溶血性弧菌診斷血清（日本生科研）、革蘭氏陰性菌藥敏測試板（德國Thermo Fisher）、熒光定量PCR儀（ABI7500）、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）。

標本種類及數(shù)量

復核標本3份（患者糞便堿性蛋白胨水增菌液1份、患者糞便分離弧菌顯色平板和4號瓊脂平板各1個），患者糞便1份。

檢測方法

霍亂弧菌參照衛(wèi)生部《霍亂防治手冊》第六版(2013年)[4]進行；副溶血性弧菌參照GB4789.7-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》[5]。

增菌：取病人糞便接種于3%NaCl堿性蛋白胨水中于37℃增菌6～8h。

分離培養(yǎng)：取病人糞便和復核標本（糞便堿胨水增菌液）分別劃線接種于弧菌顯色平板、TCBS瓊脂平板和4號瓊脂平板，于37℃培養(yǎng)18～24h。上送的復核標本（患者糞便分離平板）繼續(xù)于37℃進行培養(yǎng)。

氧化酶試驗：挑取分離平板生長的菌落進行氧化酶試驗，在1～2min內(nèi)試紙變?yōu)樽仙袨檠趸冈囼炾栃?，不變色判為陰性。陽性的菌落劃線3%NaCl TSA平板進行純培養(yǎng)。

霍亂弧菌毒力基因檢測：取復核標本（糞便堿性蛋白胨水增菌液、糞便分離弧菌顯色平板和4號瓊脂平板上氧化酶陽性的可疑菌落）和患者糞便分別進行霍亂弧菌ctxAB毒力基因檢測，具體檢驗方法參照試劑盒說明書。結(jié)果判定以樣本檢測Ct值≤34.5為陽性、Ct值≥37.5或無Ct值為陰性、Ct值在34.5～37.5范圍則需對樣本進行重復檢測。結(jié)果說明見表1。

質(zhì)譜儀鑒定：挑取上送的復核標本（患者糞便劃線分離的平板生長的菌落）進行質(zhì)譜儀鑒定。

副溶血性弧菌血清學鑒定：參照GB4789.7-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》[5]。

副溶血性弧菌毒力基因檢測：在一個PCR反應體系中同時檢測副溶血性弧菌tlh、tdh、trh基因，具體檢驗方法參照試劑盒說明書。結(jié)果判定以樣本檢測Ct值≤36為陽性、Ct值≥39或無Ct值為陰性、Ct值在36～39范圍則需對樣本進行重復檢測。結(jié)果說明見表2。

副溶血性弧菌藥物敏感性實驗：采用微量肉湯稀釋法，按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）中推薦的弧菌藥敏實驗抗生素的選擇原則選取8種抗生素。

結(jié)果

復核標本初步快速鑒定：復核標本進行了相應的氧化酶實驗、霍亂弧菌ctxAB毒力基因檢測和質(zhì)譜儀鑒定，鑒定結(jié)果見表3。

菌落鑒定：挑取疑似的副溶血性弧菌經(jīng)3%NaCl TSA純化后的菌落，分別進行氧化酶實驗、質(zhì)譜儀鑒定和毒力基因檢測，結(jié)果見表4。

血清學鑒定：對鑒定確認的副溶血性弧菌進行血清學分型，結(jié)果均為O3：K6型。

耐藥檢測：利用微量肉湯稀釋法，經(jīng)商品化藥敏板鑒定，結(jié)果均為敏感。藥物名稱及濃度見表5。

討論

在此次疑似霍亂疫情中，為了快速確認是否是霍亂，我們首先將病人糞便和復核樣本（糞便初步增菌液、分離平板生長出的菌落）進行了霍亂弧菌毒力基因檢測，利用熒光PCR方法特異性強的優(yōu)勢，來進行輔助判定。經(jīng)過3個小時左右的實驗，熒光PCR結(jié)果顯示陰性。由于復核樣本培養(yǎng)時間短，生長出的菌落形態(tài)不十分典型，為了進一步確認到底是何種致病性微生物，我們分別挑取可疑菌落進行了飛行時間質(zhì)譜儀鑒定，鑒定結(jié)果均為副溶血性弧菌。副溶血性弧菌耐熱性直接溶血素(tdh)或者耐熱性直接溶血素相關(guān)溶血素(trh)是導致副溶血性弧菌致病的主要毒力因子[6-7]，而且O3:K6血清型是引起副溶血性弧菌感染爆發(fā)的優(yōu)勢血清型[8-9]。我們對鑒定的10株副溶血性弧菌進行純化，又分別進行了毒力基因檢測、血清學檢測和耐藥檢測，毒力基因結(jié)果為tlh陽性、tdh陽性、trh陰性，血清型為O3：K6型，耐藥檢測均為敏感，這也與陳玉貞在山東省副溶血性弧菌生物多態(tài)性和耐藥性研究[10]中相符。

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在疫情的處置中，實驗室的快速準確檢測是重中之重。首先，在對患者糞便進行增菌的同時，可以直接劃線分離選擇性平板，以此來節(jié)省18～24h。其次，在細菌鑒定的傳統(tǒng)方法中，同時運用特異性強的實時熒光PCR分子生物學技術(shù)來輔助鑒定，為傳統(tǒng)的生化鑒定指明了方向。再次，在獲得純化后新鮮生長的可疑菌落后，利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀對菌落進行鑒定，既省去了傳統(tǒng)生化鑒定的繁瑣步驟，又節(jié)約了24～48h的傳統(tǒng)生化鑒定時間，為疫情防控和流行病學調(diào)查搶得寶貴時間。在這次的疑似霍亂疫情處置中，檢驗人員爭分奪秒、思路明確、有條不紊，在最短的時間內(nèi)上報實驗結(jié)果，成功地為身在一線的流調(diào)人員流行病學調(diào)查和醫(yī)療機構(gòu)的準確用藥提供了可靠的技術(shù)支撐。

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