人工合成糖疫苗的研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)

李格非，熊德彩，葉新山

（北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物與仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191）

自18 世紀(jì)末英國(guó)醫(yī)生愛德華詹納開始接種牛痘起，疫苗作為最重要的防病和治病手段，在應(yīng)對(duì)傳染性疾?。ɡ缣旎ā⒓顾杌屹|(zhì)炎、乙肝等）的威脅中起到了關(guān)鍵性的作用，同時(shí)也展現(xiàn)出對(duì)一系列重大疾病[如腫瘤、獲得性免疫缺陷綜合征（艾滋病，AIDS）等]的治療潛力。為了應(yīng)對(duì)新出現(xiàn)的和不斷變異的病原微生物對(duì)人類健康的威脅，需要我們不斷開發(fā)新型疫苗。近年來，隨著糖合成化學(xué)和糖化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展，糖類在免疫過程中的作用越來越受到關(guān)注[1]。多種糖類亞單位疫苗包括多糖疫苗和糖蛋白疫苗等也被陸續(xù)開發(fā)出來，并顯示出低毒副作用、高安全性等優(yōu)勢(shì)[2]。尤其在應(yīng)對(duì)細(xì)菌性腦膜炎和肺炎的全球性爆發(fā)上，抗菌性糖蛋白疫苗成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)史上的最成功的案例之一。本文將根據(jù)不同的病原微生物種類，結(jié)合近3年內(nèi)最新的研究成果和本課題組的部分工作，介紹相關(guān)糖疫苗的研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)，以期為新型疫苗的開發(fā)提供思路。

1 針對(duì)細(xì)菌感染的多糖疫苗

部分革蘭陰性菌和多數(shù)革蘭陽性菌表面都覆蓋著一層莢膜結(jié)構(gòu)，它主要由帶負(fù)電荷的酸性多糖構(gòu)成，也是重要的保護(hù)性抗原。早期的莢膜多糖疫苗主要通過細(xì)菌培養(yǎng)和純化的方式制成。然而在1970年以前，抗生素的快速發(fā)展在一定程度上限制了多糖疫苗的廣泛應(yīng)用和深入研究。近年來，隨著越來越多的耐藥菌株出現(xiàn)，糖疫苗在抗菌領(lǐng)域的作用才重新受到重視[3]。預(yù)計(jì)到2020年，全球的糖復(fù)合物疫苗市場(chǎng)將達(dá)到100 億美元。根據(jù)中國(guó)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)，目前臨床上的細(xì)菌多糖疫苗主要有流腦疫苗、b 型流感嗜血桿菌多糖疫苗、傷寒Vi 疫苗和肺炎鏈球菌多糖疫苗（PPV）等（見表1）。

表1 國(guó)內(nèi)抗細(xì)菌感染多糖疫苗的臨床進(jìn)展Table 1 Clinical progress of polysaccharide vaccines against bacterial infectious diseases

臨床研究結(jié)果表明，這類直接提取的細(xì)菌莢膜多糖疫苗雖然安全有效，但是本質(zhì)上還屬于T 細(xì)胞非依賴性抗原[7]，由于在人體免疫系統(tǒng)中無法與抗原呈遞細(xì)胞作用，只能激活B 細(xì)胞，無記憶細(xì)胞形成，因此對(duì)嬰幼兒和有免疫缺陷的成人的免疫效果不佳[8]。為了增強(qiáng)多糖疫苗的免疫效果，目前的方案是將天然莢膜多糖與蛋白載體結(jié)合，或?qū)ζ溥M(jìn)行部分化學(xué)修飾（例如磺酸化、乙酰化等），使其變?yōu)門 細(xì)胞依賴性抗原，以提高免疫原性。需要選擇對(duì)人體無毒性、不引起過敏反應(yīng)并能增強(qiáng)多糖免疫效用的蛋白質(zhì)作為載體，例如白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素等。同時(shí)，某些糖蛋白疫苗還可以作為二聯(lián)疫苗使用，如b 型流感嗜血桿菌多糖與白喉類毒素結(jié)合疫苗可以獲得對(duì)2 種疾病的免疫力。

另一方面，革蘭陰性菌表面特殊的脂多糖抗原也為糖疫苗的設(shè)計(jì)提供了可能性[9]。脂多糖的核心結(jié)構(gòu)由3～5 個(gè)單糖組成，再聚合成20～40 個(gè)重復(fù)單元的多糖結(jié)構(gòu)。脂多糖本身具有毒性，不能直接用于人體免疫。而通過水解得到的多糖片段由于相對(duì)分子質(zhì)量（10000～30000）較小，免疫應(yīng)答微弱，也起不到有效的保護(hù)效果。因此，目前還沒有以脂多糖為基礎(chǔ)的糖疫苗產(chǎn)品。然而針對(duì)沒有莢膜抗原結(jié)構(gòu)的革蘭陰性菌引發(fā)的感染，例如細(xì)菌性痢疾、副傷寒甲等，就需要利用人工合成的脂多糖制備疫苗。

1.1 傷寒疫苗

傷寒目前仍是每年引起2000 萬人次感染和20萬人死亡的嚴(yán)重腸道傳染病之一[10]。感染者經(jīng)糞-口途徑傳播傷寒沙門菌是其主要傳染途徑。由于注射型全菌疫苗存在嚴(yán)重的接種反應(yīng)，目前多使用Vi多糖疫苗（見圖1）進(jìn)行保護(hù)。但由于耐藥性菌株的增加，現(xiàn)有疫苗的免疫效果越發(fā)不理想。此外，多糖疫苗屬于T 細(xì)胞非依賴性抗原，不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，對(duì)2 歲以下嬰幼兒的免疫效果也不好[11]。為了增強(qiáng)Vi 多糖疫苗的免疫效果，多采用載體蛋白結(jié)合疫苗的改進(jìn)方式。至2019年，已經(jīng)有3 種Vi 多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗（Vi-TT vaccine）[12]獲批上市。另外還有2 種結(jié)合不同載體蛋白的疫苗——Vi-CRM197（Vi 多糖-白喉毒素突變體）[13]和Vi-DT（Vi 多糖-白喉類毒素）[14]也分別處于臨床Ⅰ期與Ⅱ期階段。這些結(jié)合了蛋白載體的多糖疫苗均展現(xiàn)出安全性和遠(yuǎn)高于Vi 多糖本身的免疫效果。最近，筆者所在課題組在Vi 糖抗原的構(gòu)效關(guān)系研究中也取得了一定進(jìn)展[15]。課題組利用化學(xué)合成手段制備了結(jié)構(gòu)均一的、重復(fù)單元數(shù)為5 →10 的Vi 糖抗原片段。通過體外anti-Vi 抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了六糖是最小的Vi 抗原表位。這一發(fā)現(xiàn)將有助于Vi 寡糖疫苗的開發(fā)。

圖1 傷寒Vi 糖抗原重復(fù)單元Figure 1 The repeating unit of the typhoid Vi polysaccharide vaccine

1.2 結(jié)核疫苗

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病。世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的《2018年全球結(jié)核病控制報(bào)告》顯示，中國(guó)的結(jié)核病患病人數(shù)居全球第2 位，屬于高負(fù)擔(dān)國(guó)家。目前，接種卡介苗依然是防治結(jié)核病的唯一手段。然而其免疫效果存在廣泛爭(zhēng)論，不但不能預(yù)防原發(fā)性感染和肺部潛伏感染，而且對(duì)于成人的免疫保護(hù)效果不佳。加之越來越多耐藥菌株的出現(xiàn)，急需更加安全有效的新疫苗。

在導(dǎo)致結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）中，存在多種類型的糖抗原結(jié)構(gòu)[16]，主要包括構(gòu)成細(xì)胞壁的阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）、 脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomanna，LAM） 以 及 由3 位 甲基化半乳糖和6 位甲基化葡萄糖組成的脂多糖（lipopolysaccharide），這些糖分子成為結(jié)核糖疫苗設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。Wang 等[17]通過化學(xué)糖基化方法合成了一系列LAM 的片段結(jié)構(gòu)，并將其結(jié)合到匙孔血藍(lán)載體蛋白（keyhole limpet hemocysnin，KLH）上（見圖2A）。初步免疫研究表明，這種糖蛋白可以誘發(fā)小鼠的相關(guān)抗體響應(yīng)，證實(shí)了LAM 寡糖在結(jié)核疫苗應(yīng)用中的理論可行性。隨后，他們又將免疫佐劑單磷?；|(zhì)A（monophosphoryl lipid A，MPLA）及其衍生物引入到LAM 型糖綴合物疫苗的設(shè)計(jì)中，并在腹膜注射了該疫苗的小鼠體內(nèi)檢測(cè)到強(qiáng)烈的IgG 抗體響應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了糖疫苗在結(jié)核疫苗開發(fā)中的巨大潛力[18]。另一方面，在結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的AG 抗原人工合成中，筆者所在課題組也取得了重大突破[19]。利用硫苷的預(yù)活化一釜合成策略，首次合成出含有92 個(gè)單糖結(jié)構(gòu)的分支AG 多糖抗原（見圖2B），這也為結(jié)核糖疫苗的開發(fā)打開了一個(gè)新的方向。近期，脂多糖抗原研究也取得了一定進(jìn)展。De 等[20]利用核磁、LC-MS 等技術(shù)詳細(xì)研究了結(jié)核分枝桿菌中分離的脂多糖結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其主要糖鏈?zhǔn)怯搔?(1→4)連接的6位甲基化葡萄糖單元組成，非還原端的糖單元6 位存在乙?；揎?，且這種乙?；瘜?duì)于T 細(xì)胞的活化起著至關(guān)重要的作用。這些發(fā)現(xiàn)為脂多糖基疫苗的設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖2 人工合成的結(jié)核疫苗多糖抗原Figure 2 Synthetic polysaccharide antigens of the vaccine for tuberculosis

2 艾滋病糖疫苗

AIDS 是由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的危害極大的傳染病。HIV 病毒主要攻擊人體的CD4+T淋巴細(xì)胞，使機(jī)體喪失免疫功能。從20 世紀(jì)80年代開始，美國(guó)就開始了HIV 疫苗的研制，但至今還沒有有效的疫苗出現(xiàn)。在HIV 入侵宿主細(xì)胞的過程中，首先要通過病毒表面的糖蛋白gp120 與細(xì)胞表面受體CD4 結(jié)合，同時(shí)gp120 也被認(rèn)為可以遮蔽HIV 表面的蛋白表位，進(jìn)而避免被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別[21]?；诖?，初代糖疫苗的設(shè)計(jì)方案就是合成gp120 的類似物來誘發(fā)體液免疫。由于gp120 蛋白表面的糖基化率很高，表明糖鏈在HIV 感染過程中發(fā)揮著重要作用，進(jìn)而可以利用這些特征糖鏈來設(shè)計(jì)新的抗HIV 疫苗。例如，能夠有效中和HIV的2G12 抗體，就是以HIV 表面gp120 上的甘露寡糖簇（oligomannose cluster）作為識(shí)別靶標(biāo)進(jìn)而發(fā)揮抗病毒活性的[22]。這些發(fā)現(xiàn)為抗HIV 糖疫苗的研究帶來了新的契機(jī)。Wang 等[23]通過模仿病毒表面高密度的糖鏈結(jié)構(gòu)，合成了樹枝狀的甘露寡糖簇（見圖3A），并通過糖基微陣列結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了這種人工合成的糖簇由于具有多價(jià)結(jié)合位點(diǎn)，可以有效在體外抑制gp120 與2G12 的結(jié)合，但卻無法在體內(nèi)誘導(dǎo)廣泛中和HIV-1 抗體（broadly neutralizing antibody，bnAb）的形成，說明只有高抗原性還不足以誘導(dǎo)免疫原性。針對(duì)抗原性與免疫原性之間的屏障，筆者所在課題組設(shè)計(jì)了聯(lián)合免疫策略[24]，利用具有相同抗原表位的糖復(fù)合物BSA-（Man）4（見圖3B）與重組gp120 共同免疫小鼠，可特異性地增強(qiáng)識(shí)別gp120 抗體中與（Man）4相關(guān)結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體成分。雖然整體上bnAb的抗體滴度沒有明顯增加，但這種能夠改變抗體響應(yīng)特異性的策略也為HIV 疫苗的設(shè)計(jì)提供了有價(jià)值的參考。此外，gp120 的第三可變區(qū)（V3 peptide）作為HIV-1 的主要免疫原區(qū)在疫苗設(shè)計(jì)中也備受關(guān)注。Gianvincenzo 等[25]利用合成的負(fù)電性糖基金納米粒子來調(diào)控V3 肽鏈的構(gòu)象，使其變?yōu)槟芘c中和抗體mAb 447-52D 有效結(jié)合的β折疊結(jié)構(gòu)（見圖3C），進(jìn)而誘發(fā)抗體對(duì)gp120的識(shí)別，達(dá)到免疫激活的效果。同時(shí)這種糖基納米粒子也被證實(shí)可以提高多肽抗原的酶解穩(wěn)定性，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫效果。這些發(fā)現(xiàn)為新型HIV 疫苗的設(shè)計(jì)提供了新的思路。

圖3 用于HIV 疫苗研究的不同糖抗原設(shè)計(jì)方案Figure 3 Different design strategies as carbohydrate antigens for HIV vaccine

3 腫瘤糖疫苗

目前疫苗可預(yù)防的疾病仍以傳染病為主，非傳染性疾病的疫苗還處在探索階段。而針對(duì)腫瘤的糖疫苗主要是治療性疫苗。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞表面的糖鏈會(huì)發(fā)生過度唾液酸化和支化等變異。這些特殊的糖鏈結(jié)構(gòu)參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移等重要過程，因此也被稱為腫瘤相關(guān)糖抗原（tumor-associated carbohydrate antigen，TACA，見圖4）[26]。在機(jī)體內(nèi)，跨膜受體Dectin-1 可以在糖鏈刺激下，激發(fā)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而起到抗腫瘤的作用。早期臨床研究證實(shí)，對(duì)腫瘤病人注射糖疫苗來誘導(dǎo)相關(guān)抗體的產(chǎn)生，可以延長(zhǎng)生存期[27]。通過人工合成和改造這些糖抗原，就有望獲得用于腫瘤治療的糖疫苗。但是腫瘤細(xì)胞表面的糖抗原免疫原性較弱，只能與B 細(xì)胞作用并引起短暫無免疫記憶的IgM 抗體。因此，解決天然糖抗原的免疫耐受就成為腫瘤糖疫苗研究的關(guān)鍵問題[28]。

常用的解決方案是把糖抗原通過共價(jià)鍵結(jié)合到特定的載體上（見圖5A），從而實(shí)現(xiàn)從非T 細(xì)胞依賴（T-independent，TI）抗原到T 細(xì)胞依賴（T-dependent，TD）抗原的轉(zhuǎn)化。常見的載體蛋白有KLH、白喉毒素突變蛋白（CRM197），腦膜炎外膜蛋白（meningococcal outer membrane protein complex，OMPC），破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT） 和 白 喉 類 毒 素（diphtheria toxoid，DT）[29]。分別用于黑色素瘤和乳腺癌的KLH-GM2及KLH-STn 糖蛋白類治療性腫瘤疫苗已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段。納米粒子也是一種常用的糖抗原載體（見圖5B）。相較于生物大分子載體，納米尺度賦予這類糖疫苗一些獨(dú)特的性能，例如可以更容易地透過組織屏障，并能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞水平上的免疫調(diào)控[30]。其中，金納米粒子因其制備簡(jiǎn)單、可通過巰基進(jìn)行表面修飾等優(yōu)點(diǎn)，成為最常用的載體材料。通過對(duì)三氧化二鐵納米顆粒進(jìn)行表面鍍金，還可以得到具有磁性的腫瘤糖疫苗[31]。以外，一些特殊的載體也被用于抗腫瘤糖疫苗的制備。Reuven 等[32]用血紅細(xì)胞負(fù)載N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc），用于腫瘤的免疫治療（見圖5C）。這里，血紅細(xì)胞既展現(xiàn)出良好的生物相容性又能在體循環(huán)中保留較長(zhǎng)的時(shí)間，而Neu5Gc 作為一種非人源性的唾液酸分子，只出現(xiàn)在特定的腫瘤細(xì)胞上。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明這種糖疫苗可以在Neu5Gc 陽性腫瘤的荷瘤小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗Neu5Gc IgG 抗體，從而有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。另外，一些特殊結(jié)構(gòu)的高分子材料也被用于腫瘤疫苗的研究。Kuamer 等[33]將甘露糖結(jié)合到雙親性的高分子上，利用其自組裝得到了能有效激活抗原遞呈細(xì)胞的糖納米膠束（見圖5D）。此外，在最近的糖復(fù)合物疫苗研究中，外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）作為一種新興的載體，展現(xiàn)出無毒、固有佐劑特性等特點(diǎn)，也備受關(guān)注[34]。雖然相同的糖抗原在連接不同載體時(shí)會(huì)表現(xiàn)出完全不同的免疫行為，但考慮到載體本身的細(xì)胞毒性、生物相容性、代謝途徑等因素，目前獲批的糖綴合物疫苗都是以蛋白作為載體的[35]。因此，開發(fā)合適的連接臂和溫和有效的蛋白修飾策略依然是糖蛋白疫苗研究中的熱點(diǎn)[36]。

圖4 代表性的腫瘤相關(guān)糖抗原結(jié)構(gòu)Figure 4 Representative structures of tumor associated carbohydrate antigens

圖5 用于抗腫瘤糖疫苗的不同載體Figure 5 Different carriers used for anti-tumor carbohydrate vaccines

除了利用載體效應(yīng)提高腫瘤糖疫苗的免疫原性之外，另一個(gè)解決方案是對(duì)天然糖抗原進(jìn)行適當(dāng)修飾，使其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面所表達(dá)的天然糖抗原，并且這種通過接種產(chǎn)生的抗體滴度需要超過人體針對(duì)天然糖抗原而產(chǎn)生的抗體滴度。基于以上考慮，筆者所在課題組在腫瘤糖疫苗的化學(xué)修飾中開展了一系列工作。2011年我們首次發(fā)現(xiàn)，通過氟原子的引入可以大幅度提高天然STn 抗原的免疫原性（見圖6），誘發(fā)小鼠產(chǎn)生高于原始KLH-STn 疫苗6 倍以上的IgG 抗體[37]。這一結(jié)果促使我們將該策略應(yīng)用到更多的腫瘤相關(guān)糖抗原的化學(xué)修飾中，包括GM3 抗原[38]、Thomsen-Friedenreich 抗原[39]和Tn 抗原類似物[40]。所有修飾后的糖疫苗均表現(xiàn)出高于本體的免疫原性，這為解決天然糖抗原的免疫耐受和抗腫瘤糖疫苗的開發(fā)提供了一條有效的途徑。最近，Chang 等[41]將STn抗原與T 輔助淋巴細(xì)胞表位（T-helper cell epitope）結(jié)合，制成了無需載體蛋白的自佐（self-adjuvanting）抗腫瘤糖疫苗。其中，唾液酸上N-丙?；脑斓腟Tn 可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生更具特異性的IgG 抗體，進(jìn)而更有效地識(shí)別腫瘤細(xì)胞表達(dá)的STn 抗原，提高了疫苗的抗腫瘤效力。此外，將多種腫瘤糖抗原連接到同一個(gè)載體蛋白上得到多價(jià)疫苗的方案也備受關(guān)注。O,Cearbhaill 等[42]開展了將5 價(jià)疫苗用于卵巢癌患者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，證實(shí)了多價(jià)疫苗的安全性，并獲得了與分別注射多種單價(jià)疫苗類似的免疫效果。

圖6 天然的和化學(xué)修飾的STn 糖疫苗Figure 6 Native and modified STn carbohydrate vaccine

雖然抗腫瘤糖疫苗的研究取得了很多成績(jī)，但是到目前為止，依然沒有一種獲FDA 批準(zhǔn)上市。抗腫瘤糖疫苗的臨床試驗(yàn)依然有很長(zhǎng)的路要走。

4 結(jié)語與展望

病原體表面糖抗原的深入研究以及新的糖基化方法極大地提高了糖疫苗的應(yīng)用前景。尤其在應(yīng)對(duì)艾滋病、腫瘤等重大威脅方面，糖疫苗提供了新的解決方案。但需要指出的是，絕大多數(shù)的多糖抗原在激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中不能利用CD4+T 細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的協(xié)同作用，只能作用于B 細(xì)胞，產(chǎn)生IgM 抗體。而且，機(jī)體對(duì)多糖產(chǎn)生免疫應(yīng)答需要完善的脾臟功能，脾臟邊緣區(qū)的B 淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是啟動(dòng)多糖免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[43]。然而對(duì)于脾臟發(fā)育不完全的嬰幼兒，這種由多糖刺激所引發(fā)的免疫應(yīng)答很有限，導(dǎo)致臨床使用的多糖疫苗對(duì)2 歲以下嬰幼兒的保護(hù)效果很不理想。如何克服低免疫應(yīng)答，是糖疫苗研發(fā)過程中急需解決的問題。目前，天然糖抗原的化學(xué)修飾和引入具有T 細(xì)胞依賴抗原特征的載體材料，都被證實(shí)可以促進(jìn)IgG 抗體的轉(zhuǎn)化和記憶性T 細(xì)胞的形成，進(jìn)而獲得理想的免疫保護(hù)效果。

當(dāng)前生物類新藥的比例已經(jīng)超過化學(xué)新藥，開啟了新藥研發(fā)的新時(shí)代，最主要的原因還是得益于基因工程和蛋白質(zhì)工程的快速發(fā)展，使得大規(guī)模制備生物產(chǎn)品成為可能。同樣，對(duì)于糖疫苗的發(fā)展與應(yīng)用，最大的瓶頸依然還是大規(guī)模的制備方法。只要解決結(jié)構(gòu)均一性糖鏈的獲得性問題，糖疫苗的發(fā)展必將突飛猛進(jìn)。目前，多數(shù)糖疫苗的獲得還是采用傳統(tǒng)的從培養(yǎng)微生物中直接分離提取的方式。這就不可避免地帶來抗原結(jié)構(gòu)不均一性、免疫耐受性等問題。同時(shí)，由于無法獲得結(jié)構(gòu)單一的糖鏈結(jié)構(gòu)，使得糖基疫苗的免疫學(xué)基礎(chǔ)研究步履維艱。區(qū)別于蛋白質(zhì)的生物合成過程，糖鏈的生物合成屬于非模板控制過程，因而我們無法在體外通過引入特定的基因序列獲得想要的糖鏈結(jié)構(gòu)，這就要求我們必須開發(fā)出有效的化學(xué)手段來大規(guī)模合成復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)。近些年一批新的糖基化方法（化學(xué)-酶法[44]）和先進(jìn)合成策略（預(yù)活化一釜合成[45]、自動(dòng)化合成[46]等）的出現(xiàn)必將加速糖疫苗的開發(fā)與應(yīng)用。

除了化學(xué)偶聯(lián)方法以外，近些年發(fā)展起來的生物偶聯(lián)策略即在大腸埃希菌（E.coli）中通過糖工程手段制備重組糖綴合物疫苗（protein glycan coupling technology，PGCT），也為規(guī)?；苽涮且呙缣峁┝肆硪粋€(gè)平臺(tái)[47]。相較于過程繁復(fù)的化學(xué)途徑，生物策略具有更高的經(jīng)濟(jì)性和制備效率。該方法一般分為3 個(gè)階段：首先在E.coli中表達(dá)出所需要的外源性糖鏈；其次是設(shè)計(jì)和表達(dá)載體蛋白；最后在宿主細(xì)胞中完成偶合。在此基礎(chǔ)上，Kightlinger 等[48]還報(bào)道了一種無細(xì)胞表達(dá)（cell-free）的體外生物平臺(tái)，用來構(gòu)筑N-連接（N-linked）目標(biāo)糖蛋白。在這個(gè)被稱為體外快速表達(dá)糖基化技術(shù)（glycosylation pathway assembly by rapidin vitromixing and expressing，GlycoPRIME）的方法中，糖蛋白組裝所需的全部原料包括目標(biāo)糖鏈?zhǔn)荏w、糖基轉(zhuǎn)移酶、載體蛋白等都先通過E.coli制備，再通過混合未經(jīng)分離的溶菌液進(jìn)行組裝得到目標(biāo)糖蛋白。該策略為糖蛋白的生物合成提供了另一條嶄新的途徑。

近期，在革蘭陰性菌中天然釋放的外膜囊泡（outer membrane vesicle，OVA）研究中提出的膜抗原通用模塊（generalized modules for membrane antigens，GMMA）[49]概念，被認(rèn)為是第3 代糖疫苗的制備基礎(chǔ)[50]。GMMA 可以簡(jiǎn)單描述為通過基因改造菌株（例如Shigella sonnei）高效產(chǎn)出外膜抗原顆粒（脂多糖），再經(jīng)過2 步簡(jiǎn)單的過濾純化得到糖疫苗。雖然該策略在糖疫苗的研究中還處在最初階段，但相較傳統(tǒng)的純化過程，GMMA 可以有效縮短糖抗原的純化步驟，大幅降低糖疫苗的制造成本。糖疫苗的發(fā)展歷程與趨勢(shì)見圖7。理活動(dòng)的影響，同樣是糖疫苗開發(fā)中必須解決的重大問題。

圖7 糖疫苗的發(fā)展歷程與趨勢(shì)[50]Figure 7 Historical and future development of carbohydrate vaccines

最后，糖疫苗的最終應(yīng)用還要通過嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)，推動(dòng)基礎(chǔ)研究中具有優(yōu)異抗原活性的糖復(fù)合物走向臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步探索其安全性及對(duì)正常生