洋地黃毒苷的合成及基于抗腫瘤活性的糖基修飾研究進展

符登憲，廖智文，曾靜，萬謙

（華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院，湖北 武漢 430030）

1 洋地黃毒苷及其抗腫瘤活性

強心苷（cardiac glycoside）是一類具選擇性強心作用的化合物，在動植物中均有分布。洋地黃毒苷（digitoxin，1）和地高辛（digoxin，2）均屬于強心苷類。強心苷的結構中通常以甾體母核為苷元，其C17 位碳原子與不飽和內酯環(huán)相連，C3 位碳原子與糖基相連[1-2]（見圖1）。強心苷類藥物發(fā)揮作用的機制通常被認為是通過抑制心肌細胞膜Na+/K+-ATPase 的活性，使細胞內的Na+增加、K+減少，最終使得心肌細胞內Ca2+水平增加，從而發(fā)揮正性肌力作用[3]。自1967年Shiratori 課題組[4]報道洋地黃毒苷等多種強心苷類化合物對腫瘤細胞的生長具有抑制作用以來，強心苷類藥物的抗腫瘤活性也逐漸引起廣泛重視，科學家們也對強心苷的抗腫瘤活性和作用機制進行了大量的探索[2,5-9]。

從洋地黃（Digitalis purpurea）中分離得到的洋地黃毒苷，是目前臨床上治療心力衰竭常用的強心苷類藥物。洋地黃毒苷同樣具有良好的抗腫瘤活性。已發(fā)現洋地黃毒苷對前列腺癌PC3、DU145和LNCaP 細胞株，乳腺癌MCF-7 細胞株，腎腺癌TK-10 細胞株，黑色素瘤UACC-62 細胞株，白血病K-562 細胞株，肺癌A549、NCI-H460 細胞株均具有良好的抑制活性[10-12]；近年來，也發(fā)現洋地黃毒苷對膠質母細胞瘤[13]、腎細胞癌[14]、肝癌[15]具有一定治療作用。另外，洋地黃毒苷的結構類似物地高辛對前列腺癌PC3、DU145 和LNCaP 細胞株，宮頸癌Hela 細胞株，肺癌A549、NCI-H460細胞株也顯示出顯著的抑制作用[10-12]。目前被廣泛認可的洋地黃毒苷類化合物抗腫瘤作用機制可能是：其與腫瘤細胞Na+/K+-ATPase 亞基結合，進而影響后續(xù)的信號轉導和細胞代謝，最終發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用[16]。Lopez-Lazaro[17]、Newman等[10]、Prassas 等[8]、陳 果 等[18]、陳 大 朋 等[19]、Pongrakhananon[20]、Slingerland 等[21]與Schneider等[11]對洋地黃毒苷的抗腫瘤活性及其作用機制研究進展進行了詳細綜述。本文主要介紹近年來對洋地黃毒苷的合成以及針對其抗腫瘤活性進行的糖基結構修飾和構效關系研究的相關進展。

圖1 強心苷的基本結構及洋地黃毒苷和地高辛結構Figure 1 Structure of cardiac glycoside, digitoxin and digoxin

2 洋地黃毒苷的全合成研究

強心苷類天然產物的重要生理活性引起了合成化學家廣泛的興趣。自Wiesner 等[22-23]于1985年首次報道洋地黃毒苷的全合成以來，McDonald 等[24-25]、Zhou 等[26-27]、Tanaka 等[28]相繼開展了洋地黃毒苷的全合成研究。2012年，Heasley[29]對強心苷與相關天然產物的化學合成包括上述工作進行了總結和綜述，羅列了歷年科學工作者們在甾體母核和相關天然產物全合成中取得的進展。此后，Ma等[30]和Baryal等[31]又分別報道了2 種洋地黃毒苷的新的合成方案。

2011年，Ma 等[30]運用他們研發(fā)的金催化俞氏糖基化方法[32-36]順利地在洋地黃毒苷元（3）上進行了糖基砌塊的組裝，通過九步反應以52%的總收率實現了洋地黃毒苷的構建（見圖2）。在該合成工作中，以洋地黃毒苷元為原料，3 根糖苷鍵的構建都以端基離去基為鄰炔基苯甲酸酯的洋地黃毒糖（4）為供體，以三苯基膦金（Ⅰ）三氟甲磺酸鹽（Ph3PAuOTf）為催化劑。其中，供體4 以甲基吡喃葡萄糖苷為起始原料制備，其糖環(huán)C3、C4 位上具有較大立體位阻的叔丁基二苯基硅基（TBDPS）保護基，使得供體4 在進行糖基化時可以表現出良好的β-立體選擇性。糖基的組裝過程從洋地黃毒苷元的糖基化開始，通過從還原端向非還原端的連續(xù)糖基化實現：通過俞氏糖基化獲得的化合物5 經由脫保護和C3 位羥基選擇性乙?；Ｗo即得受體6，后續(xù)的二糖糖苷7 和三糖糖苷8 均可依此法進行制備。3 個糖的引入都利用相同的轉化過程，很大程度上提高了合成的便利性和有效性。

2013年，Baryal 等[31]報 道 了 一 種Re（Ⅴ）催化的立體選擇性合成β-洋地黃毒糖鏈（β-digitoxoside）的方法（見圖3）。該方法以大位阻基團保護的6-脫氧-D-阿洛糖烯糖（6-deoxy-D-allal，9）為底物，在金屬Re（Ⅴ）的催化下與受體10 直接發(fā)生烯糖糖基化，合成了二糖11。由于1，3-二直立鍵效應，該方法可以獲得中等到優(yōu)良的β-選擇性。應用這一方法，Baryal 等首先合成了二糖（12）和三糖（13）。進一步應用還原鋰化-消除反應順利將三糖轉化為烯糖（14）。但接下來烯糖14 的糖基化并沒有再次應用Re（Ⅴ）催化的立體選擇性糖基化方法引入洋地黃毒苷元，而是用了經典的三苯基膦氫溴酸鹽（PPh3· HBr）催化的方法，以中等的產率獲得了目標產物15，但遺憾的是，即使引入大位阻的叔丁基二甲基硅基（TBS）保護基，該步驟的糖基化選擇性也不太理想。

圖2 金催化的俞氏糖基化用于洋地黃毒苷的合成Figure 2 Assembly of digitoxin by gold(I)-catalyzed Yu glycosylation

圖3 利用Re（Ⅴ）催化的糖基化策略合成洋地黃毒苷Figure 3 Synthesis of digitoxin by Re(V)-catalyzed glycosylation

3 洋地黃毒苷的糖基修飾及改造

盡管洋地黃毒苷和地高辛具有廣泛的抗腫瘤活性，但它們也有強心苷類藥物常見的毒性大、治療窗口窄等嚴重問題。為了尋找活性高、毒性低且能有效擴展治療窗口的強心苷類抗腫瘤藥物，近年來，藥物化學家們對洋地黃毒苷類化合物進行了大量的結構修飾和改造研究，并對其構效關系進行了探討。洋地黃毒苷的苷元部分被認為是藥效基團，對藥理活性起著關鍵的作用，因而針對苷元部分的結構改造對活性的變化起著直接的影響。但是苷元的改造通常都較為困難，因而報道不多，且大多以天然甾體的替換和細微的結構變化為主。Michalak 等[37]在2017年對強心苷類的苷元母核結構的合成和改造進行了總結和綜述。另一方面，天然產物和藥物的糖基化修飾往往能有效改變母體分子的理化活性，因而利用糖基隨機化和糖基多樣化的手段針對天然產物和藥物進行糖基化修飾也成為了新藥開發(fā)的有效手段。本文主要介紹利用化學方法對洋地黃毒苷的糖基部分進行的修飾和相應的構效關系研究。

3.1 鈀催化糖基化和糖基化后修飾

O,Doherty 團隊[38-42]在洋地黃毒苷及其衍生物的抗腫瘤活性的構效關系研究工作中取得了一系列研究進展。他們應用糖的從頭合成法（de novocarbohydrate synthetic methodology）[43-45]和 糖 基 化后修飾（post-glycosylational modification）的策略，不僅完成了洋地黃毒苷全合成，也構建了一個包含不同糖結構單元的洋地黃毒苷類似物庫（見圖4）。該策略首先利用鈀催化的糖基化策略，立體選擇性地在α，β-不飽和吡喃酮（16）的C1 位引入洋地黃毒苷苷元得到化合物17，進一步對化合物17 的α，β-不飽和酮單元的羰基和碳碳雙鍵進行選擇性還原、環(huán)氧化或雙羥基化等官能團化操作，多樣性地引入各種糖基結構，得到化合物18a～18z。除了單糖外，重復應用該策略，也可以合成二糖和三糖的類似物。這些具備不同構型、不同取代形式和不同氧化程度的各種糖基取代基的洋地黃毒苷衍生物的合成，極大地推動了O,Doherty 等對洋地黃毒苷及其衍生物抗腫瘤活性構效關系的研究工作。運用該鈀催化的糖基化和糖基化后修飾的合成策略，Elbaz 等[46]也于2012年合成了洋地黃毒苷的單糖衍生物18a，并對其抗腫瘤活性進行了較深入和細致的研究。

3.2 有機硼催化的區(qū)域選擇性糖基化

2013年，Beale 等[47]利用他們開發(fā)的有機硼（20）催化的區(qū)域選擇性糖基化方法，實現了洋地黃毒苷C4'''羥基的區(qū)域選擇性糖基化（見圖5）。該課題組以全乙?；腃1 溴代糖19 為糖基供體，在有機硼催化劑20 和氧化銀的體系中與洋地黃毒苷反應，以較好的產率和1，2-反式選擇性得到各種四糖或五糖單元的洋地黃毒苷類似物（21a～21f）。其中，糖基化大多選擇性地在位于平伏鍵的C4'''位發(fā)生，只有少數例外。但由于已經發(fā)現洋地黃毒苷的單糖類似物活性遠強于多糖類似物，因而對這些化合物的抗腫瘤活性研究意義可能不大，目前也未見這些衍生物抗腫瘤活性研究的報道。

圖4 利用鈀催化糖基化及糖基化后修飾策略合成洋地黃毒苷類似物Figure 4 Synthesis of digitoxin analogues based on Pd-catalyzed glycosylation and post-glycosylational modification

圖5 應用有機硼催化劑對洋地黃毒苷進行區(qū)域選擇性糖基化Figure 5 Regioselective glycosylation of digitoxin using organoboron-catalyst

3.3 金催化糖基化用于洋地黃毒苷的3-氨基糖修飾

3-氨基糖在抗癌藥物和天然產物中廣泛存在，其對此類化合物的抗腫瘤活性也具有重要的作用[48-51]。萬謙及曾靜等認為對洋地黃毒苷苷元進行3-氨基糖的修飾有可能提高化合物抗腫瘤活性并降低其毒性。該團隊已利用3-氨基糖的多樣化合成策略獲得了多種天然的3-氨基糖及其衍生物[52]。在該工作基礎上，他們進一步以端基離去基為鄰炔基苯甲酸酯的3-氨基糖（22）為糖基供體，應用金催化的俞氏糖基化方法完成了洋地黃毒苷元的3-氨基糖修飾，獲得了系列產物23a～23e[53]（見圖6）。在該方法中，盡管糖基化沒有表現出明顯的選擇性，但是利用α-和β-異構體很容易分離的特點，同時獲得了α-和β-構型的產物，有效地擴展了類似物庫的多樣性。應用該方法，萬謙和曾靜團隊也對地高辛進行了3-氨基糖的修飾[53]。相關的抗腫瘤活性研究也在進行中。

圖6 洋地黃毒苷和地高辛的3-氨基糖修飾Figure 6 Structural modification of digitoxin and digoxin by 3-aminosugar

3.4 甲基羥胺-擬糖基化（MeON-neoglycosylation）：洋地黃毒苷氮苷衍生物的合成

考慮到糖基化修飾的復雜性和挑戰(zhàn)性，2005年，Langenhan 等[54]報 道 了 一 種 通 過 一 步反應在天然糖苷類藥物苷元上引入糖基取代基的方法，他們將這種方法稱為“擬糖基隨機化（neoglycorandomization）”。該方法的核心在于利用還原糖24 和含O-甲基羥胺的苷元（25）縮合構建N-糖苷鍵，避免了糖基化反應的端基離去基的引入及活化，簡化了糖基化反應的過程?；跀M糖基化的方法，O,Doherty 及其團隊在2010年合成了洋地黃毒苷的單糖、二糖及三糖氮苷衍生物（26a ～26c），并對洋地黃毒苷氧苷和氮苷衍生物的抗腫瘤活性進行了對比[38]。

氨基糖的存在常?？梢越档退幬镅X屏障的透過性，因而有可能降低神經相關副作用。2015年，Zhang 等[55]利用擬糖基化方法合成了一系列洋地黃毒苷的氨基糖類氮苷衍生物，以對它們的抗腫瘤活性進行研究。如圖7 所示，以疊氮取代的葡萄糖或木糖作為糖基化供體，通過擬糖基化和鈀催化疊氮還原[56]兩步反應得到系列糖環(huán)的C2'、C3'、C4'或C6'位被疊氮/氨基取代的衍生物（26d～26p）。運用擬糖基化合成新型氮苷衍生物的方法[54]和Koenigs-Knorr 糖基化方法，Wang 等[57]和Li 等[58]也對地高辛的氧苷和新型氮苷衍生物進行了合成，以此來研究它們的抗腫瘤活性和構效關系，并得到了一些抗腫瘤活性優(yōu)于地高辛的衍生物。

圖7 擬糖苷化策略修飾洋地黃毒苷Figure 7 Modification of digitoxin by neoglycosylation strategy

3.5 含三氮唑和酰胺結構單元的洋地黃毒苷衍生物的合成

2019年，Boff 等[59]以洋地黃毒苷元為起始物，通過瓊斯試劑氧化、硼氫化鈉還原、對甲苯磺?；?、疊氮取代4 步反應得到了3-疊氮-3-脫氧洋地黃毒苷元（27），并以27 為起始物，合成了2 類洋地黃毒苷的衍生物。其中，他們運用點擊化學（click chemistry）的方法，將炔丙醇苷糖基供體（28）在五水硫酸銅和抗壞血酸鈉的作用下與27 進行糖基化偶聯[60]，繼而將偶聯產物29 進行脫乙?；玫窖苌?0（見圖8A）。與此同時，Boff 等也嘗試用非糖單元替換洋地黃毒糖單元：從27 出發(fā)，在三苯基膦作用下疊氮基團被還原成氨基[61-62]，得到化合物31，再與氯乙酰氯反應生成關鍵中間體32[62-63]；一方面，32 與乙醇胺反應生成衍生物33a，另一方面，中間體32 與碘化鉀反應生成碘代物，然后在N，N-二異丙基乙胺（DIPEA）作為堿的體系中與相應化合物反應即可一鍋法得到衍生物33b～33e（見圖8B）[64-65]。

4洋地黃毒苷及其衍生物的抗腫瘤活性和構效關系

在上述洋地黃毒苷各類衍生物的合成工作的基礎之上，研究人員對相應的衍生物的抗腫瘤活性進行了測試并對相應的構效關系進行了探究。通過他們的研究工作，洋地黃毒苷及其衍生物的抗腫瘤活性的構效關系逐步得到了進一步的闡明。1）甾體母核是洋地黃毒苷及其衍生物發(fā)揮藥理活性必需的藥效基團[66-67]。2）單糖衍生物表現出比二糖和三糖衍生物更高的活性[38-39]，如單糖氧苷衍生物18p和單糖氮苷衍生物26a 的抗腫瘤活性分別高于相應的二糖和三糖氧苷（1，18q）、氮苷（26b ～26c）衍生物。3）氧苷衍生物的抗腫瘤活性高于前文所述異頭位氮上有甲氧基取代的氮苷衍生物[38]，如氮苷衍生物26a～26c 的抗腫瘤活性弱于相應的氧苷1、18q 和18p。4）糖基部分為L-構型的衍生物較D-構型的衍生物而言表現出更高的誘導細胞凋亡的活性，且糖基部分D-/L-立體構型的變化對誘導細胞凋亡活性的影響較C2、C3 位的取代造成的影響更為顯著[39]，如和相應的L-構型衍生物18a、18f 相比，D-構型衍生物18j、18m 誘導細胞凋亡的活性顯著降低，同時18c 的活性顯著高于18j，而18a 和18f 具有相當的生物活性。5）在洋地黃毒苷的單糖苷衍生物中，C2'直立羥基對衍生物抗腫瘤活性影響較小[42]，如衍生物18w 和18f 的活性僅存在微小的差異，C3'羥基的存在對衍生物的抗腫瘤活性具有重要意義，但其立體化學（平伏羥基或直立羥基）對活性影響不大[42]，如衍生物18a 和18r 具有幾乎相同的抗腫瘤活性，而C3'脫氧的衍生物18w 和C3'羥基被更大的溴原子取代的衍生物18z 的抗腫瘤活性則更低。6）與C3'羥基相似，C4'羥基的存在對衍生物的抗腫瘤活性具有重要意義，但不同的是，C4'羥基的立體化學對衍生物的抗腫瘤活性的影響較之C3'羥基而言要大得多（平伏位羥基衍生物的活性比直立位羥基衍生物的活性高數倍）[42]，如衍生物18w 的活性比18s 高約10 倍，比18y 高4～8 倍。7）C5'烷基取代的洋地黃毒苷單糖苷衍生物的抗腫瘤活性具有空間導向性，隨著C5'取代基的空間位阻的增大，衍生物誘導NIC-H460 凋亡的活性也隨之大幅地降低[41]，如衍生物18a～18e、18f～18i，其抗腫瘤活性隨C5'取代基位阻的增大而降低。8）在洋地黃毒苷氮苷衍生物中，3S-氮苷衍生物與3R-氮苷衍生物相比具有更顯著的活性，同時擬糖苷-人類神經激肽A（neoglycoside-NKA）對接模型表明C3'-和C4'-氨基木糖取代的衍生物（26m～26p）具有更優(yōu)良的抗腫瘤活性，其中，C3'氨基或疊氮取代的衍生物活性最佳（活性：26o ≈ 26m），C4'氨基取代亦可顯著提高氮苷衍生物的抗腫瘤活性[55]，如衍生物26j 的活性約為26d 的80 倍。9）Semose 及其團隊[59]合成的兩類洋地黃毒苷衍生物中，33a 和33b 具有最強的細胞毒性，它們的IC50值近似于作為陽性對照的抗癌藥物紫杉醇，兩者的結構中具有獨特的羥基和乙醇胺基團，表明它們特殊的化學結構與其生物活性緊密相關；此外衍生物33a 和33b 的親脂性較之其他衍生物更低，這種親脂性特性在其與Na+，K+-ATP 酶的相互作用中發(fā)揮著重要的作用。在含三氮唑結構的衍生物中，三氮唑環(huán)上連接的甘露糖苷糖基單元上C1α-OH 和C2β-OH 的構型可能增強相應衍生物的活性，如衍生物30c 的活性高于30a、30b 和30d；同時相應糖苷衍生物糖基部分的羥基呈游離態(tài)時其抗腫瘤活性更高（相比乙酰基保護狀態(tài)而言），如衍生物30a～30d 的活性高于29a～29d。就含酰胺結構的衍生物而言，缺電子的羰基碳原子上連接的基團的空間位阻增大時，化合物活性降低，且在酰胺羰基α位存在負電子的原子可降低衍生物的IC50值（與洋地黃毒苷元相比）；如相比于33a 和33b，衍生物33c～33e 的活性顯著更低。我們將部分構效關系總結如下（見圖9）。

5 結語

洋地黃毒苷不僅具有優(yōu)異的強心作用，同時也具有良好的抗腫瘤應用前景，進一步的研究還發(fā)現其類似物具有抗巨細胞病毒活性[68-69]、降低眼內壓作用[70]、抗皰疹病毒活性[59]等生物學活性。由于洋地黃毒苷的毒性和狹窄的治療窗口，近來人們研究的重點從天然洋地黃毒苷的合成轉向具有更良好抗腫瘤活性的洋地黃毒苷衍生物的合成和相關的構效關系研究上，并取得了一系列具有指導意義的研究成果。洋地黃毒苷及其衍生物抗腫瘤活性的構效關系和作用機制仍未得到完全的闡明，有待更深入的探究。

圖8 含三氮唑和酰胺結構單元的洋地黃毒苷衍生物的合成Figure 8 Synthesis of digitoxin derivatives with special o-glycosyl trizol and amide fragments

圖9 洋地黃毒苷抗腫瘤活性的構效關系Figure 9 Structure-antitumor activity relationships of digitoxin