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    IP6與INS輔助卡培他濱對(duì)結(jié)直腸癌小鼠炎癥因子及MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

    2020-08-10 10:04:00慈一帆王海桃劉曉涵陳沉李倩倩宋揚(yáng)
    精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:飲水量卡培原位

    慈一帆 王海桃,2 劉曉涵 陳沉 李倩倩 宋揚(yáng)

    (1 青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,山東 青島 266071; 2 青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

    結(jié)直腸癌(CRC)是世界上發(fā)病率排第三位的腫瘤[1]。據(jù)目前估計(jì),全世界每年大約新增100多萬例CRC患者[2]。CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、長期的過程[3],在腫瘤微環(huán)境中,各種促炎遞質(zhì)通過復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[4]?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)由腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞合成,在CRC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。其中MMP-2和MMP-9與細(xì)胞分化、凋亡、血管生成、免疫反應(yīng)和癌細(xì)胞生長有關(guān)[6]??ㄅ嗨麨I是臨床上治療CRC的常用藥物,通過干擾細(xì)胞DNA合成,發(fā)揮抗腫瘤作用,但應(yīng)用卡培他濱的部分患者容易發(fā)生腹瀉等副作用[7-9]。植酸(IP6)是一種天然抗氧化劑,存在于全谷類、堅(jiān)果類及豆類中[10],具有抗腫瘤作用[11]。肌醇(INS)是一種飽和的環(huán)狀多元醇,能協(xié)同IP6抑制CRC的發(fā)生和發(fā)展[12]。IP6與INS在正常飲食中大量存在,能安全有效地從胃腸道吸收[13],IP6與INS合用可以輔助治療乳腺癌、CRC,緩解傳統(tǒng)化學(xué)療法的副作用,提高患者生活質(zhì)量[14-17]。IP6+INS是否可以輔助卡培他濱抑制CRC生長,目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過盲腸壁下注射腫瘤細(xì)胞方法建立小鼠CRC原位移植模型,研究IP6+INS輔助卡培他濱對(duì)CRC干預(yù)作用及其機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物及飼養(yǎng)

    SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠100只,6~7周齡,購買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。在SPF級(jí)(無特定病原體)條件下,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,平均濕度(52±8)%,平均溫度(24±2)℃,AIN93M標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲水。該研究通過了青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審批(倫理編號(hào):QYFYWZLL25667)。

    1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

    鼠CRC細(xì)胞CT-26購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.15的胎牛血清以及10 g/L青鏈霉素(100 kU/L青霉素,0.1 g/L鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

    1.3 試劑

    IP6以及卡培他濱(上海麥克林生化科技有限公司),INS(上海源葉生物科技有限公司),ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司),D-熒光素蟲鉀鹽(北京索萊寶科技有限公司),TRNzol總RNA提取試劑(天根生化科技(北京)有限公司),PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser以及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)ROX plus(寶生物工程(大連)有限公司),Western blot相關(guān)試劑(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

    1.4 小鼠CRC原位移植模型的制備

    體外培養(yǎng)CRC細(xì)胞CT-26,首先用慢病毒轉(zhuǎn)染CT-26細(xì)胞,后用嘌呤霉素篩選出能穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的CT-26細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,用2.5 g/L胰蛋白酶消化重懸細(xì)胞,制備成1×109個(gè)細(xì)胞/L密度的細(xì)胞懸液備用。100只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以后,腹腔注射10 g/L的戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉,在小鼠左下腹做一長1.5 cm左右的縱切口,用1 mL注射器采集0.2 mL細(xì)胞懸液,注射到小鼠盲腸漿膜層下,注射完畢后小心退出注射器,確認(rèn)無出血后逐層關(guān)腹縫合。

    1.5 小鼠腫瘤生長情況觀察

    根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在造模后第3周對(duì)小鼠進(jìn)行活體成像檢測,觀察小鼠腫瘤生長情況。

    1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)

    活體成像結(jié)果顯示,在造模后第3周,有69只造模小鼠出現(xiàn)腫瘤。剔除體質(zhì)量較輕和生長狀態(tài)差的成瘤小鼠,最終將48只成瘤小鼠納入實(shí)驗(yàn)研究。按IP6+INS(干預(yù)和不干預(yù))和卡培他濱(干預(yù)和不干預(yù))兩個(gè)因素及兩個(gè)因素的不同水平交叉組合分為4組,分別為模型組(A組)、卡培他濱組(B組)、IP6+INS組(C組)、卡培他濱+IP6+INS組(D組),4組小鼠分別用生理鹽水0.2 mL、60 mg/kg卡培他濱0.2 mL、80 mg/kg IP6和80 mg/kg INS共0.2 mL、60 mg/kg卡培他濱和80 mg/kg IP6及80 mg/kg INS共0.2 mL灌胃,每周灌胃5 d,連續(xù)灌胃6周。記錄小鼠進(jìn)食飲水量(每2 d記錄一次,計(jì)算各組小鼠日平均進(jìn)食飲水量),觀察小鼠一般生長狀態(tài)。各組小鼠日平均進(jìn)食飲水量=記錄的各組小鼠進(jìn)食飲水總量/(該組小鼠總數(shù)×2)。

    1.7 動(dòng)物處理及原位瘤組織稱質(zhì)量

    根據(jù)小鼠的生存狀態(tài)確定處死時(shí)間。于末次灌胃12 h(禁食禁水)后摘除眼球取血并處死小鼠,血液離心后取上清液于-80℃冰箱保存。取原位瘤組織稱質(zhì)量。

    1.8 小鼠血清中趨化因子CCL20、白細(xì)胞介素10(IL-10)、IL-12表達(dá)水平的檢測

    按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書操作,于酶標(biāo)儀中讀取波長450 nm處各孔吸光度,按稀釋標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中CCL20、IL-10、IL-12水平。

    1.9 小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的檢測

    取50 mg原位瘤組織,在預(yù)冷的研缽中將組織樣本研磨成粉末狀后加入Trizol,提取總RNA。使用NanoDrop?ND-2000測定RNA濃度和純度,然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR。PCR采用兩步法,條件如下,95 ℃預(yù)變性5 min;然后95 ℃變性30 s, 60 ℃退火/延伸34 s,共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。檢測原位瘤組織中目的mRNA的CT值,計(jì)算得到各組目的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(計(jì)算公式2-△△CT)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取均值。引物序列見表1。

    表1 RT-PCR引物序列和產(chǎn)物長度

    1.10 小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的檢測

    取約50 mg原位瘤組織,加入含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,提取腫瘤組織的總蛋白。采用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。測定完成后向各組蛋白中加入上樣緩沖液,混勻加熱,使蛋白變性。蛋白冷卻后加入到SDS-PAGE凝膠上電泳分離,將分離后的蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含脫脂奶粉的TBST封閉2 h后,漂洗3次,加入一抗孵育3~4 h,漂洗后重新加入二抗孵育2 h。在顯影儀中顯影,得到目的蛋白條帶。以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    1.11 統(tǒng)計(jì)分析

    2 結(jié) 果

    2.1 各組小鼠平均進(jìn)食飲水量的變化

    析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示,IP6+INS與卡培他濱無交互作用(P>0.05),IP6+INS干預(yù)可以升高腫瘤小鼠的日均進(jìn)食飲水量(F=10.627、18.053,P<0.05),卡培他濱干預(yù)對(duì)腫瘤小鼠日平均進(jìn)食飲水量無明顯影響(P>0.05)。見表2。

    表2 各組小鼠日均進(jìn)食量、飲水量比較

    2.2 活體成像結(jié)果

    活體成像結(jié)果顯示,造模3周后,小鼠原位組織區(qū)域出現(xiàn)顯影(圖1),有腫瘤生長。

    圖1 小鼠CRC原位移植模型建立3周時(shí)活體成像結(jié)果

    2.3 各組小鼠生存情況及原位瘤質(zhì)量比較

    實(shí)驗(yàn)期間A、B組各有4只和2只小鼠死亡,為惡病質(zhì)或原位腫瘤致腸梗阻所致。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)A、B、C、D組小鼠的原位瘤質(zhì)量分別為(5.90±0.41)、(2.55±0.41)、(3.53±0.96)、(1.71±0.58)g,經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示,IP6+INS與卡培他濱對(duì)原位瘤質(zhì)量有交互作用(F=13.772,P<0.05),當(dāng)有或無卡培他濱干預(yù)時(shí),IP6+INS對(duì)原位瘤質(zhì)量均具有明顯影響(F=8.868、62.123,P<0.05),當(dāng)有或無IP6+INS干預(yù)時(shí),卡培他濱對(duì)原位瘤質(zhì)量均有明顯影響(F=45.698、114.796,P<0.05)。

    2.4 各組小鼠血清中CCL20、IL-10、IL-12表達(dá)水平比較

    析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示,IP6+INS與卡培他濱有交互作用(F=5.731~50.311,P<0.05);有或無卡培他濱干預(yù)時(shí),IP6+INS對(duì)小鼠血清中CCL20、IL-10和IL-12表達(dá)水平均具有明顯的影響(F=30.753~321.372,P<0.05);有或無IP6+INS干預(yù)時(shí),卡培他濱對(duì)小鼠血清中CCL20、IL-10以及IL-12表達(dá)水平均具有明顯的影響(F=20.578~757.673,P<0.05)。見表3。

    表3 各組小鼠血清中CCL20、IL-10和IL-12表達(dá)水平比較

    2.5 各組小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)情況比較

    析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示,IP6+INS與卡培他濱有交互作用(F=7.007~9.974,P<0.05);當(dāng)有或無卡培他濱干預(yù)時(shí),IP6+INS對(duì)小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白以及mRNA表達(dá)水平均有明顯的影響(F=7.330~82.807,P<0.05);當(dāng)有或者無IP6+INS干預(yù)時(shí),卡培他濱對(duì)小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)水平均有明顯的影響(F=10.687~80.808,P<0.05)。見表4。

    表4 各組小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)水平比較

    3 討 論

    本研究采用盲腸壁下注射腫瘤細(xì)胞的方法建立小鼠CRC原位移植模型,模型中小鼠的腫瘤發(fā)生率為69%,通過卡培他濱、IP6+INS、卡培他濱+IP6+INS 3種方式對(duì)腫瘤模型小鼠進(jìn)行干預(yù),結(jié)果表明3種干預(yù)方式均可以顯著降低小鼠的原位瘤質(zhì)量,其中卡培他濱+IP6+INS降低CRC原位瘤質(zhì)量的效果最為顯著,說明IP6+INS不僅可以抑制腫瘤的進(jìn)展,而且可以協(xié)同卡培他濱更好地發(fā)揮抗腫瘤的作用。

    CRC的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[18],炎癥細(xì)胞因子在免疫細(xì)胞的分化、成熟、增殖、激活、免疫調(diào)節(jié)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,參與多種生理和病理反應(yīng)[19]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,IL-10作為一種重要的免疫抑制因子,可以通過多種途徑抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[20]。IL-12是一種由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B淋巴母細(xì)胞在抗原刺激下自然產(chǎn)生的細(xì)胞因子,在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[21]。腫瘤細(xì)胞分泌的CCL20不僅可以影響免疫細(xì)胞的功能,還可以直接作用于腫瘤細(xì)胞,目前已有研究表明CCL20通過刺激CCR6/NF-kB信號(hào)和PI3K/AKT-ERK信號(hào)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[22-23]。本研究結(jié)果顯示,卡培他濱、IP6+INS、卡培他濱+IP6+INS 3種干預(yù)措施均可以顯著降低CRC小鼠血清中IL-10、CCL20表達(dá)水平,升高IL-12表達(dá)水平,以卡培他濱+IP6+INS效果最為顯著。

    研究顯示MMP可以影響免疫反應(yīng),并能促進(jìn)血管生成影響腫瘤進(jìn)展[5-6]。KATRIN等[6]研究發(fā)現(xiàn),MMP-2和MMP-9蛋白在惡性結(jié)腸黏膜中的表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn),卡培他濱、IP6+INS、卡培他濱+IP6+INS 3種干預(yù)措施均可以降低CRC小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá),以卡培他濱+IP6+INS的作用效果最佳。

    CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程,其中炎癥因子以及MMP在CRC發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[6,19]。本研究結(jié)果顯示,卡培他濱、IP6+INS、卡培他濱+IP6+INS均可以影響炎癥因子以及MMP的表達(dá),具體表現(xiàn)為降低CRC小鼠血清中IL-10和CCL20的表達(dá)水平,升高IL-12的表達(dá)水平;降低CRC小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9 mRNA以及蛋白的表達(dá)水平,其中以卡培他濱+IP6+INS作用效果最佳。

    綜上所述,IP6+INS可以輔助卡培他濱抑制BALB/c小鼠CRC的生長,其作用機(jī)制可能與影響炎癥因子及降低MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān),但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

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