響應(yīng)面法優(yōu)化寧夏‘赤霞珠’皮渣中原花青素提取工藝

王海波，關(guān)玉嵩，徐飛

（武漢生物工程學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究中心，湖北武漢430415）

原花青素是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮混合物，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成［1-3］，其抗自由基的氧化能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍［4］。同時具有消炎抗菌、清除人體多余有害的自由基、預(yù)防心腦血管疾病的能力，原花青素還有抗癌、抗腫瘤、抗衰老的功效［5-8］。原花青素在自然界的分布廣泛，其中葡萄是原花青素的重要來源之一，其研究也最深入、最廣泛。

國內(nèi)外葡萄和葡萄籽是提取原花青素的主要原料之一，而葡萄皮渣是葡萄經(jīng)發(fā)酵釀酒之后的過濾殘渣，主要由葡萄皮和葡萄籽組成，含有大量的多酚類物質(zhì)［9-10］。目前，大量的葡萄皮渣資源被當(dāng)作廢棄物處理，或者直接做成簡單的飼料賣給農(nóng)戶，易造成環(huán)境污染，再次生物利用度也較低，不符合目前生物資源循環(huán)利用的發(fā)展理念［11-12］。本試驗以寧夏‘赤霞珠’葡萄經(jīng)釀酒以后的皮渣為研究對象，采用超聲波破碎法再聯(lián)合果膠酶和纖維素酶的作用提取原花青素［13-14］，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行了響應(yīng)面試驗和分析［15-17］，以期改進葡萄皮渣原花青素的提取工藝條件，從而為釀酒葡萄皮渣的綜合開發(fā)利用及原花青素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 試驗方法

1.1 葡萄皮渣的處理

寧夏‘赤霞珠’葡萄經(jīng)釀酒壓榨分離后的皮渣放入50℃烘箱中烘干。用中草藥粉碎機（型號FW117，天津泰斯特儀器有限公司）進行粉碎，經(jīng)40目篩過篩，以沸程30～60℃石油醚采用索氏提取的方法進行脫脂處理，然后50℃烘干［18］。

1.2 原花青素的標準曲線制定

精確稱取原花青素標準品0.03 g，取95%的乙醇溶解定容于100 mL容量瓶中為原花青素標樣。原花青素的測定及標準曲線的制作按照文獻［19］的方法進行，制作的標準曲線見圖1。從圖1可知，標準曲線方程為y=8.991 7x+0.001 9，其中R2=0.999 1，表明原花青素濃度在0.1～0.8 mg/mL之間存在較好的線性關(guān)系，可用于后期待測樣品的濃度分析。

圖1原花青素標準曲線Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

1.3 葡萄皮渣中原花青素的提取和含量測定

稱取0.5 g葡萄皮渣粉末按一定的料液比加入提取劑，在一定溫度下浸提一段時間后將提取液按3 000 r/min離心10 min。取上清液加入乙醇進行稀釋后加入6 mL鹽酸正丁醇溶液和0.2 mL的0.2%硫酸亞鐵氨，輕微震蕩搖勻，放入94℃的水浴鍋中反應(yīng)40 min，冷卻后于546 nm下測吸光值，將結(jié)果代入標準曲線方程中換算出待測樣濃度。葡萄皮渣粉末中原花青素含量（M）的計算公式為：M（mg/g）=C·n·V/m，其中，C為提取液中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；n為稀釋總倍數(shù)；V為提取液的體積，mL；m為每次提取時所取的葡萄籽粉末質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗

1.4.1 乙醇濃度對原花青素提取的影響稱取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，分別用40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇浸提。浸提溫度50℃，時間40 min。按照1.3中的顯色方法進行吸光度的測定，計算葡萄皮渣中原花青素的含量。每個試驗平行3次，此步驟下同。

1.4.2 料液比對原花青素提取的影響稱取0.5 g葡萄皮渣粉末，分別選擇1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，乙醇濃度為60%，溫度50℃，時間40 min。

1.4.3 復(fù)合酶的添加量對原花青素提取的影響稱取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，乙醇濃度為60%，取0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1）分別加入燒杯中，溫度50℃，時間40 min。

1.4.4 pH值對原花青素提取的影響稱取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，乙醇濃度為60%，加入0.4%的復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，溫度50℃，時間40 min。

1.4.5 溫度對原花青素提取的影響稱取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，乙醇濃度60%，加入0.4%的復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH值為4.5，溫度分別選取40、45、50、55、60、65℃，時間40 min。

1.4.6 時間對原花青素提取的影響稱取0.5 g葡萄皮渣粉末按料液比1∶20混合，乙醇濃度60%，加入0.4%的復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH值為4.5，溫度60℃，提取時間分別選取40、60、80、120、140 min。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

以原花青素的含量為響應(yīng)值，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面分析試驗，以獲得最佳提取條件。以物料比（A）、復(fù)合酶添加量（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）為自變量，試驗設(shè)計見表1。以Design-expert8.06分析軟件為輔助手段，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，采用Excel2010軟件對單因素試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸和方差分析，確定模型和因素的顯著性。

表1響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design experiment of response surface

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對原花青素提取的影響從圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，原花青素的含量逐漸增加，其中當(dāng)乙醇濃度為60%時原花青素的含量最高，為8.41 mg/g。但是，當(dāng)乙醇濃度大于60%時，得率開始快速下降，表明60%乙醇濃度為葡萄皮渣中原花青素提取的有利條件。

圖2乙醇濃度對原花青素含量的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the yield of proanthocyanidins

2.1.2 料液比對原花青素提取的影響從圖3可以看出，當(dāng)料液比逐漸增大時，原花青素的含量呈逐漸上升的趨勢。當(dāng)料液比為1∶20時，葡萄皮渣中原花青素含量最高，為12.66 mg/g，是料液比1∶5時的兩倍。但是，隨著料液比繼續(xù)增加，原花青素含量開始緩慢下降。表明料液比為1∶20有利于葡萄皮渣中原花青素的提取。

圖3料液比對原花青素含量的影響Fig.3 The effect of material-liquid ratio on the yield of proanthocyanidins

2.1.3 復(fù)合酶添加量對原花青素提取的影響隨著復(fù)合酶添加量的增大，原花青素的含量呈快速上升并快速下降的趨勢（圖4）。其中，當(dāng)復(fù)合酶添加量為0.4%時，葡萄皮渣中原花青素的含量最高，為14.94 mg/g。當(dāng)復(fù)合酶添加量為1.2%時，葡萄皮渣中原花青素的含量為9.33 mg/g。結(jié)果表明復(fù)合酶添加量為0.4%時有利于原花青素的提取。

圖4復(fù)合酶添加量對原花青素含量的影響Fig.4 The effect of complex enzyme amount on the yield of proanthocyanidins

2.1.4 pH值對原花青素提取的影響原花青素提取對pH值較為敏感。總體而言，較低pH值（pH＜5.0）條件下原花青素的含量明顯比較高pH值（pH＞5.0）條件下含量高（見圖5）。值得注意的是，當(dāng)pH=4.5時，葡萄皮渣中原花青素的含量最高（15.22 mg/g）。當(dāng)pH=6時，葡萄皮渣中原花青素的含量最低（9.78 mg/g）。表明pH 4.5為原花青素提取的有利條件。

圖5 pH值對原花青素含量的影響Fig.5 The effect of pH value on the yield of proanthocyanidins

2.1.5 溫度對原花青素提取的影響隨著浸提溫度的不斷升高，原花青素的含量也隨之上升，其中在60℃時葡萄皮渣中原花青素含量最高，為21.23 mg/g（見圖6）。但當(dāng)浸提溫度繼續(xù)升高時，原花青素的含量開始下降。這些數(shù)據(jù)表明60℃有利于原花青素的提取。

圖6提取溫度對原花青素含量的影響Fig.6 The effect of extraction temperature on the yield of proanthocyanidins

2.1.6 時間對原花青素提取的影響隨著浸提時間的延長，原花青素的含量呈先上升后下降的趨勢（見圖7）。其中，當(dāng)浸提時間達到80 min時，葡萄皮渣中原花青素的含量最高（22.11 mg/g）。當(dāng)浸提時間增加到160 min時，原花青素含量反而降至最低（20.02 mg/g），表明80 min的浸提時間更有利于原花青素的提取。

圖7提取時間對原花青素含量的影響Fig.7 The effect of extraction time on the yield of proanthocyanidins

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

通過單因素試驗結(jié)果可知，料液比、復(fù)合酶添加量、提取溫度、提取時間對葡萄皮渣中原花青素的含量影響較為明顯，據(jù)此設(shè)計的4因素3水平響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface optimization test

通過Design-expert8.06軟件進行多元回歸擬合分析得到4個因素與原花青素含量之間的二次多項式模型為

式中，M為原花青素含量預(yù)測值。

二次多項式模型的方差分析見表3，由表3可知各因素與響應(yīng)值之間關(guān)系的顯著性，該模型的P＜0.000 1表明此模型具有高度的顯著性。失擬性P=0.177 9（＞0.05），失擬性具有不顯著性。R2=0.960 1說明響應(yīng)值的變化有96.01%來自源于所選變量，RAdj2=0.920 1說明建立的模型能夠解釋92.01%的響應(yīng)值變化，表明建立的模型為有效模型，適用于分析和預(yù)測原花青素的含量。各因素對原花青素的含量影響由大到小依次為C（提取溫度）＞D（提取時間）＞A（料液比）＞B（復(fù)合酶添加量）。

圖8為A、B、C、D交互影響3D圖及等高線圖，從圖8A～8F可知，當(dāng)料液比（A）和復(fù)合酶添加量（B）取值較小，提取溫度（C）和提取時間（D）取值較大時，效應(yīng)面曲線較陡，說明此時的A、B、C、D對原花青素的提取含量較為顯著，反之則不顯著。分析圖8G～8L可知，當(dāng)料液比（A）和復(fù)合酶添加量（B）取值較小，提取溫度（C）和提取時間（D）取值較大時等高線密度大，對原花青素的提取含量較為顯著，反之則不顯著。與響應(yīng)面得出的規(guī)律一致。觀察等高線圖內(nèi)圈均為橢圓形說明各因素之間交互作用影響顯著，通過響應(yīng)面對葡萄皮渣中原花青素得率的解析得出原花青素最佳提取工藝條件為料液比1∶19.91、復(fù)合酶添加量0.4%、提取溫度59.77℃、提取時間80.42 min，此時葡萄皮渣中原花青素的含量最大理論值為22.935 1 mg/g。

表3響應(yīng)曲面二次多項式模型的方差分析Tab.3 Variance analysis of the quadratic polynomial model of response surface

圖8 A，B，C，D交互影響3D圖及等高線圖Fig.8 A,B,C,D interaction 3D map and contour map

2.3 模型的驗證性試驗

以響應(yīng)面優(yōu)化試驗中的最佳工藝提取條件結(jié)合試驗條件，為方便操作則選擇乙醇濃度60%、復(fù)合酶添加量0.4%、料液比1∶20、pH 4.5、提取溫度60℃、提取時間80 min，根據(jù)上述條件進行3組驗證試驗，平均得率為22.914 mg/g，與最大理論值（22.935 1 mg/L）相接近，驗證了此模型的有效性。

3 結(jié)論與討論

此次試驗通過乙醇浸提法與復(fù)合酶添加法相結(jié)合對葡萄皮渣中原花青素的提取最佳條件進行研究，得到原花青素的最佳提取條件為：乙醇濃度60%、復(fù)合酶添加量0.4%、料液比1∶20、pH 4.5、提取溫度60℃、浸提時間80 min，此條件下的原花青素含量最大。采用單一的有機溶劑進行提取，提取率較低且能源損耗相對較高，此次試驗選用有機溶劑提取和酶提取結(jié)合試驗的方法，利用二者的相互促進作用顯著提高了葡萄籽原花青素提取率。

目前對于葡萄原花青素的研究、提取、利用主要集中于葡萄籽，方法主要有有機溶劑提取、微波輔助提取、超臨界二氧化碳萃取等，其中以有機溶劑提取應(yīng)用最為廣泛［20-21］。例如，李丹丹等［22］采用乙醇浸提的方法，葡萄籽中原花青素得率為1.58 mg/g。此外，一些研究者對葡萄釀酒皮渣中原花青素浸提進行了研究，方法也多為有機溶劑提取或者有機溶劑輔以微波、酶法等手段。例如，陳月英等［23］以乙醇加微波輔助的方法，葡萄皮渣中原花青素提取率為9.12 mg/g，后輔以酶法提取，提取率提高至11.02 mg/g［24］。

葡萄釀酒皮渣主要是葡萄皮和葡萄籽，其中含有大量的果膠類物質(zhì)和纖維素類物質(zhì)，果膠和纖維素對原花青素的溶出具有較大影響。本試驗采用的葡萄皮渣原料來自于寧夏的‘赤霞珠’葡萄經(jīng)釀酒后分離所得，試驗過程中采用了果膠酶和纖維素酶混合使用方法，使其分別作用于葡萄皮渣中的果膠和纖維素，促進原花青素充分溶出。在此基礎(chǔ)上輔以響應(yīng)面的方法進行分析論證，利用二者的相互促進作用，使得原花青素的提取率由最初的8.41 mg/g提高到22.91 mg/g，本改進方法對于提高寧夏‘赤霞珠’釀酒皮渣的提取率影響較為顯著，取得了較理想的試驗結(jié)果。

值得注意的是，本研究所得最佳工藝條件中乙醇濃度為60%，一般而言，乙醇濃度達到一定值時，一些雜質(zhì)親脂性強的成分浸出量增加，這些浸出物會與乙醇溶液結(jié)合，從而原花青素的溶解不完全，導(dǎo)致原花青素的提取率隨乙醇濃度升高而下降［25］。從試驗結(jié)果可以看出，除了乙醇濃度有一定限制外，復(fù)合酶的添加量也很重要。考慮到纖維素酶果膠酶可以使植物細胞壁破損，增加內(nèi)容物的釋放使得原花青素更快地溶出［26］，因此復(fù)合酶濃度增大，破壁作用也隨之增強，當(dāng)達到合適的限度時剛好完全溶解。但是，當(dāng)繼續(xù)增加酶濃度，底物濃度不能對復(fù)合酶達到飽和，酶解作用受到抑制，卻導(dǎo)致得率下降［27］。同樣，由于復(fù)合酶在發(fā)揮催化作用時需要適宜的pH值和溫度，因此當(dāng)pH和浸提溫度過高或過低時，復(fù)合酶的作用均受到抑制，隨之原花青素的得率也降低。當(dāng)然，本研究結(jié)果也表明浸提時間的選擇非常重要，可能是由于在一定溫度條件下時間過短會導(dǎo)致原花青素提取不夠充分，而時間過長會使得原花青素的結(jié)構(gòu)被破壞。

綜上，本研究利用葡萄皮渣原料這一常見廢料，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了原花青素提取工藝，使原花青素的得率有了較大提升，這為葡萄皮渣的有效利用奠定了基礎(chǔ)。