納米HNS、TATB 及LLM?105 的RAW264.7 巨噬細胞毒性及其機制

唐 燦，黃 兵，劉 柳，范美坤，周 陽

（1. 中國工程物理研究院化工材料研究所，四川 綿陽 621999；2. 西南交通大學(xué)地球科學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，四川 成都 611756）

1 引言

含能材料納米化以后表現(xiàn)出低壓長脈沖鈍感、高壓短脈沖敏感等獨特性能，以及在微型點火、起爆裝置及沖擊片雷管等方面展現(xiàn)出的廣闊應(yīng)用前景，受到了學(xué)者的關(guān)注［1-3］。但是，納米含能材料的生物安全問題卻鮮有報道。有資料顯示，梯恩梯（TNT）、黑索今（RDX）、泰安（PETN）等典型炸藥可以引起肝、腎、血液及神經(jīng)等組織器官毒性效應(yīng)，并有致癌、致畸、致突變的潛在風(fēng)險［4］。另外，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的超細納米顆粒一般比微米顆粒對人體健康造成危害更大［5］，且尺寸越小，顯示出生物毒性的傾向越大［6-7］。

納米化的TATB、HNS 和2，6?二氨基?3，5?二硝基吡嗪?1?氧化物（LLM?105）是含能材料領(lǐng)域最具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的炸藥之一，其中超細HNS 已經(jīng)在常規(guī)武器中得到了大量應(yīng)用［1］。但目前關(guān)于TATB、HNS和LLM?105 生物毒性報道較少。Jorgenson 等［8］研究了常規(guī)粒徑TATB 對大鼠和小鼠的急性經(jīng)口毒性，得出半數(shù)致死劑量（LD50）＞5 g·kg-1；同時還發(fā)現(xiàn)TATB對哺乳動物的皮膚和眼僅具有輕微且短暫的刺激作用。Yu 等［9］研究了LLM?105 對小鼠急性經(jīng)口毒性，發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡率為10%～20%，其最小致死劑量為10%；對新西蘭兔進行皮膚染毒，則未見異常。另外，大量研究已表明，納米材料的生物效應(yīng)與常規(guī)尺寸材料明顯不同，如微米銅粉被認為是無毒的，但納米銅則可以顯著引起哺乳動物（H4LLE 和HepG2）和魚類（PLHC?1 和RTH?149）細胞毒性［10］。Chen 等人［6］實驗得出納米氧化鋅的細胞毒性隨著粒徑的增加而降低，20，90，200 nm 的氧化鋅對HepG2 細胞的IC50分別為20.7，29.1，160 mg·L-1。Gandamalla 等［7］將 人 肺 細胞A549 暴露于不同粒徑二氧化鈦納米顆粒中，發(fā)現(xiàn)最小粒徑的顆粒引起的細胞毒性最大。以上研究表明材料的毒性與粒徑大小密切相關(guān)。遺憾的是，目前關(guān)于納米級TATB、HNS 和LLM?105 炸藥的毒性數(shù)據(jù)未見報道。

鑒于材料納米化后不容忽視的生物毒性問題以及納米炸藥的應(yīng)用潛力，其對環(huán)境和人類的影響引起了廣泛的關(guān)注［11-13］。本研究選取小鼠巨噬細胞系RAW264.7 細胞為受試對象，檢測納米級TATB、HNS和LLM?105 暴露后的細胞活性，獲得其細胞毒性與其暴露劑量之間的關(guān)系；并通過觀察細胞形態(tài)變化，表征乳酸脫氫酶、過氧化物歧化酶的活力、丙二醛含量的變化等，探究其對細胞的毒性作用機制。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器2.1.1 主要試劑

RAW264.7 巨噬細胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Ea?gle's Medium）、胰酶均購自Hyclone 公司；南美胎牛血清購自CLARK 公司；CCK?8 試劑盒購自Biosharp 公司；乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、丙二醛檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；納米級HNS、TATB、LLM?105 來自中國工程物理研究院化工材料研究所。

2.1.2 主要儀器

ULTRA55 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國賽斯儀器公司）；AE31 型倒置生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；MCO?15AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋電機國際貿(mào)易有限公司）；壓力蒸汽滅菌器（上海宜川儀表廠）；spectra max PLUS 384 型酶標(biāo)儀（美國Molecu?lar Devices 公司）。

2.2 實驗過程

2.2.1 粒子表征

取TATB、HNS、LLM?105 粉體于導(dǎo)電膠上，噴金處理后，掃描電鏡觀察。

2.2.2 CCK?8 法檢測細胞活性

取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度為6×104個·mL-1，接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入不同濃度培養(yǎng)基配制的HNS、TATB、LLM?105懸浮液，同時設(shè)置對照組。放入孵箱培養(yǎng)24 h 后，加200 μL 的CCK8 試劑，4 h 后測定450 nm 處的吸光度（D）。細胞存活率計算公式為：

式中，D0為調(diào)零組吸光度；D1為實驗組吸光度；D2對照組吸光度，單位均為L·（g·cm）-1。

2.2.3 形態(tài)學(xué)表征

取對數(shù)生長期的細胞，按照2.2.2 方法染毒24 h后，采用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態(tài)改變。

2.2.4 細胞培養(yǎng)液上清LDH 活性檢測

取對數(shù)生長期的細胞，按照2.2.2 方法染毒24 h后，收集細胞上清液，利用LDH 試劑盒測定LDH活力。

2.2.5 細胞氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

取對數(shù)生長期的細胞，按照2.2.2 方法染毒24 h后，收集細胞用于SOD 活力、MDA 含量檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.3 統(tǒng)計方法

本實驗所測細胞活性及相關(guān)酶活性均來自三組平行樣品，數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，并用單因素方差分析統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，P＜0.05 表示差異顯著；P＜0.01 表示差異極顯著。

3 結(jié)果與討論

3.1 材料表征

三種納米級炸藥的掃描電鏡結(jié)果如圖1 所示，可見HNS、TATB、LLM?105 的平均粒徑大小分別是200，60，150～200 nm；形狀分別為矩形棒狀、圓球形、近球形。

圖1 HNS、TATB、LLM?105 的掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of HNS，TATB and LLM?105 particles

3.2 細胞活性影響

體外細胞毒性實驗常用于預(yù)測化學(xué)材料對生物體的毒性情況［14］，常選取一些免疫細胞如巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞等作為受試對象。巨噬細胞具有吞噬、清除異物的功能，在生物體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的防御作用［15-16］，因此，研究納米顆粒對巨噬細胞的毒性效應(yīng)，對預(yù)測納米顆粒的毒性十分重要。

采用CCK?8 法測定了不同濃度下三種納米級炸藥染毒24 h 后的細胞活性，其結(jié)果列于表1。圖2 給出了細胞活性隨三種納米炸藥染毒濃度的演化關(guān)系?？梢园l(fā)現(xiàn)，RAW264.7 巨噬細胞活性隨三種炸藥濃度增加的變化趨勢相似，都呈現(xiàn)出明顯的劑量?效應(yīng)關(guān)系；但三者的毒性作用程度明顯不同。其中，LLM?105導(dǎo)致細胞活性下降最快，HNS 次之，TATB 最慢。例如，當(dāng)濃度為5 μg·mL-1時，LLM?105 染毒組的細胞存活率為（56.5±3.97）%，而TATB 組的細胞存活率為（93.7±6.66）%；當(dāng)濃度達到最大的250 μg·mL-1時，TATB 染 毒 組 的 細 胞 存 活 率 為（50.2±1.98）%，是LLM?105 組的細胞存活率（9.9±2.9）%的5～6 倍。依據(jù)圖2 的劑量?效應(yīng)關(guān)系，計算得出LLM?105、HNS、TATB 對RAW264.7 細 胞24 h 的 半 抑 制 濃 度（IC50）值分別為6.6，49.3，211.3 μg·mL-1，可知三種納米級炸藥對RAW264.7 細胞毒性強弱順序為LLM?105＞HNS＞TATB。目前最為廣泛接受的毒性機制包括 破 壞 細 胞 完 整 性［17］、氧 化 應(yīng) 激［18-20］、炎 癥 反應(yīng)［19-20］等，因此重點對細胞膜損傷和氧化應(yīng)激水平進行了討論。

表1 不同劑量水平上三種納米級炸藥對RAW264.7 細胞毒性比較（24 h 染毒，%）Table 1 The cytotoxicity comparison among three kinds of nano?scale explosives to RAW264.7 at different doses（24 h exposure，%）

圖2 不同染毒劑量三種納米級炸藥對RAW264.7 細胞活力的影響Fig.2 Effects of three kinds of nano?scale explosives on RAW264.7 cell viability

3.3 細胞形態(tài)學(xué)變化

采用倒置顯微鏡觀察RAW264.7 細胞的形態(tài)變化，結(jié)果如圖3 所示。對照組細胞形態(tài)呈圓形，有較小的足樣突起，細胞體積小，貼壁緊密，細胞密度較大，生長狀態(tài)良好（圖3a）。低濃度（5 μg·mL-1）TATB 與HNS 染毒組與對照組相比，細胞形態(tài)無顯著差異（圖3b 和3e），說明低濃度的TATB 與HNS 對細胞結(jié)構(gòu)功能損害較小，細胞形態(tài)變化不明顯，這與CCK?8 細胞活性結(jié)果一致；而LLM?105 染毒細胞的數(shù)量減少明顯（圖3h）。當(dāng)濃度達到10 μg·mL-1時，TATB 和HNS染毒細胞也開始出現(xiàn)細胞密度減小、細胞變長等變化（圖3f）；LLM?105 染毒組部分細胞偽足消失，細胞呈長梭形，細胞數(shù)量顯著減少（圖3i）；當(dāng)濃度達到100 μg·mL-1時，各染毒組細胞皺縮變圓，細胞密度降低，間隙變大。以毒性最大的LLM?105 染毒細胞為例，掃描電鏡觀察了LLM?105 最高濃度下RAW264.7 細胞的微觀結(jié)構(gòu)，可以清楚地看到細胞破碎及其碎片（圖4b），說明細胞膜受損嚴重?？傮w來看，細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果基本上與細胞活性檢測結(jié)果一致。

圖3 三種納米級炸藥染毒RAW264.7 細胞的形態(tài)變化（×400）Fig.3 Morphological changes of RAW264.7 cells infected with three kinds of nano?scale explosives（×400）

圖4 LLM?105 顆粒（250 μg·mL-1）染毒RAW264.7 細胞的形態(tài)變化（SEM）（a. 對照組，b. 250 μg·mL-1 LLM?105 染毒RAW264.7 細胞組）Fig.4 Morphological changes of RAW264.7 cells infected with nano?LLM?105 particles（SEM）（a. control group，b. 250 μg·mL-1 LLM?105 infected with RAW264.7 cells）

3.4 細胞膜滲透性影響

乳酸脫氫酶（LDH）是一種胞漿酶，當(dāng)細胞膜受損或通透性增加時可泄漏至細胞外，故細胞培養(yǎng)液上清中LDH 活性的大小可反映細胞膜的損傷程度［21］。本實驗測試的LDH 活性隨納米級炸藥濃度演化關(guān)系如圖5 所示。與對照組相比，染毒組的細胞上清液中LDH 活性均隨炸藥濃度增加而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明，染毒后RAW264.7 細胞膜損傷程度有劑量依賴性，與本實驗中細胞活性的檢測結(jié)果及細胞形態(tài)變化相符。實際上，通過損傷細胞膜導(dǎo)致細胞死亡是納米材料細胞毒性的常見機制。如Kang 等［17］發(fā)現(xiàn)碳納米管是通過直接損傷細胞膜并導(dǎo)致細胞代謝能力下降和核酸外泄引起的細胞死亡。Kim 等［22］發(fā)現(xiàn)小鼠前成骨細胞暴露于銀納米顆粒48 h 后，細胞上清液中LDH 活性顯著增加。由此可見，受試細胞與納米材料接觸后，細胞膜的完整性遭到破壞是細胞死亡的重要原因。

圖5 不同染毒劑量三種納米級炸藥對RAW264.7 細胞LDH 活力的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.5 Effects of three kinds of nano?scale explos on RAW264.7 cell LDH activity

3.5 細胞氧化應(yīng)激水平

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生及對生物體的毒害作用是迄今最為普遍接受的一種納米材料致毒機制［23］。過氧化物歧化酶（SOD）是直接參與分解體內(nèi)ROS 的主要抗氧化酶，可使超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧氣。SOD 活性的變化通常說明機體內(nèi)積累了過量的ROS，氧化還原平衡態(tài)失衡，誘發(fā)了氧化應(yīng)激效應(yīng)［24］。過量的ROS 會攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，造成氧化損傷，產(chǎn)生丙二醛（MDA）等代謝產(chǎn)物并在細胞內(nèi)積累［25］。因此通過這兩種指標(biāo)的變化，可以說明細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。Jin［26］等發(fā)現(xiàn)隨TiO2納米顆粒濃度的增加，小鼠成纖維細胞中ROS 和LDH 的水平升高，而SOD 的活力下降。Ahamed［27］等發(fā)現(xiàn)Bi2O3納米顆粒能夠通過降低抗氧化劑含量（SOD）來調(diào)節(jié)細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)。也有研究指出細胞毒性與體內(nèi)誘發(fā)氧化應(yīng)激密切相關(guān)，如Zeng［28］等指出氧化應(yīng)激早期為了處理過量ROS，SOD的合成量會上升，而當(dāng)抗氧化酶系統(tǒng)沒有能力處理過量的ROS 時，SOD 的活力則會下降。

圖6 結(jié)果顯示，經(jīng)HNS 暴露24 h 后，染毒組的細胞SOD 活力無明顯差異，不具備統(tǒng)計學(xué)意義；而TATB與LLM?105 染毒組與對照相比，各組細胞中SOD 活力隨染毒劑量的增加而呈下降趨勢，而其中LLM?105 細胞中SOD 活力下降更為顯著。SOD 活力下則意味著ROS 的清除能力受到抑制，過量的自由基可氧化生物膜的不飽和脂肪酸，使細胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，從而降低細胞活性。正如圖7 所示，與對照組相比，LLM?105 染毒組可明顯引起細胞內(nèi)MDA 含量的升高，而TATB 和HNS 染毒組引起胞內(nèi)MDA 含量的變化不明顯。LLM?105 染毒組細胞MDA 含量的升高，表明細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，SOD 活力下降可能與自由基的增多使抗氧化酶迅速被消耗有關(guān)，這些結(jié)果說明LLM?105 造成細胞內(nèi)產(chǎn)生并積累了過量ROS，誘發(fā)了氧化應(yīng)激，進而造成了氧化損傷。TATB 雖然引起SOD活力的下降，但是并未導(dǎo)致MDA 含量的明顯增加，說明TATB 對SOD 活力有輕微的抑制作用，未造成顯著的氧化損傷。本次實驗過程中未檢測到HNS 染毒組引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，由此可以得出細胞膜完整性的破壞可能是HNS 導(dǎo)致細胞活性下降的主要原因。LLM?105對細胞的氧化損傷效應(yīng)明顯強于TATB 和HNS，可能與分子結(jié)構(gòu)中的配位氧有關(guān)系，但這需要進一步的驗證。

圖6 不同染毒劑量三種納米級炸藥對RAW264.7 細胞內(nèi)SOD 活性的影響Fig.6 Effects of three kinds of nano?scale explosives on SOD activity in RAW264.7 cells

圖7 不同染毒劑量三種納米級炸藥對RAW264.7 細胞內(nèi)MDA 含量的影響Fig.7 Effects of three kinds of nano?scale explosives on MDA content in RAW264.7 cells

4 結(jié)論與展望

（1）討 論 了 三 種 納 米 級 炸 藥HNS、TATB、LLM?105 對RAW 264.7 細胞的毒性效應(yīng)，在實驗濃度范圍和作用時間內(nèi)，納米級HNS、TATB、LLM?105 對RAW264.7 細胞24 h 染毒的半抑制濃度分別為49.3，211.3，6.6 μg·mL-1，表明三種納米級炸藥具有明顯的細胞毒性作用，且呈劑量?效應(yīng)關(guān)系。

（2）納米級HNS、TATB、LLM?105 導(dǎo)致細胞毒性的機制主要有兩方面，一是直接與細胞相互作用，可改變細胞形態(tài)，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致細胞死亡；二是納米TATB 和LLM?105 還可以引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而造成組織的氧化損傷，導(dǎo)致細胞死亡。

（3）僅探討了納米級HNS、TATB、LLM?105 的細胞尺度上的毒性效應(yīng)，但納米材料的毒性評價需要針對同一種模型微生物以及動物，探究其在細胞、微生物和動物水平上的毒性效應(yīng)；未來的研究應(yīng)繼續(xù)開展微生物以及動物水平的體內(nèi)毒性效應(yīng)實驗研究，以便全面判斷三種納米級炸藥的生物毒性。