miR-93在胃癌患者血清中的表達(dá)變化及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

張敏 莊偉 王敏 徐鳳玲 任傳濤

胃癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的一種消化道惡性腫瘤，發(fā)病與環(huán)境、飲食等因素有關(guān)，但至今其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。由于缺乏早期特異性表現(xiàn)，多數(shù)胃癌患者就診時(shí)己進(jìn)入中晚期，患者預(yù)后往往較差[1,2]。因此，尋找早期篩查胃癌的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于改善胃癌預(yù)后具有重要意義。有研究表明，miR-93參與了結(jié)腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-93在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等組織中起到促癌基因的作用，但目前有關(guān)miR-93在胃癌患者血清中表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的研究甚少[4,5]。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)檢測(cè)胃癌患者血清中的miR-93水平，并分析探討miR-93與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月至2016年5月在我院接受手術(shù)治療的胃癌患者88例，其中男59例，女29例;平均年齡(60.8±15.7)歲。選取同期來我院體檢的60例健康人為對(duì)照組，其中男41例，女19例;平均年齡(59.2±19.1)歲。2組年齡、性別比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確的術(shù)后病理診斷結(jié)果；②近期內(nèi)未曾接受過放化療或手術(shù)治療者；③病例資料及隨訪資料完整者；④患者均已簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官惡性腫瘤者；②合并有炎癥內(nèi)分泌代謝疾病及肝腎功能疾病者。

1.3 主要試劑及儀器 miRNeasy Serum/Plasma Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit均購自德國(guó)QIAGEN公司；LightCycle 96 熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；超低溫冰箱購自美國(guó)Thermo Scientific公司。miR-93及內(nèi)參U6引物購自廣州銳博生物公司。

1.4 檢測(cè)方法 受試者空腹采集靜脈血5 ml,3 500 r/min離心30 min，將上層上清液轉(zhuǎn)移至Eppendorf (EP)管中，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?yán)格按照miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒說明書提取總RNA，分光光度儀檢測(cè)總RNA的純度和濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript II RT Kit說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取cDNA應(yīng)用miScript SYBR Green PCR Kit進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)。引物序列：miR-93上游引物5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游引物5’- ACGUGACACGUUCGGAGAAATT-3’；U6上游引物5’- TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物5’- CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 10 min，60℃ 1 min，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。以U6為參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-93的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 隨訪 采用電話或門診的方式每3個(gè)月隨訪記錄患者的生存情況，隨訪截止至2018年12月止。

2 結(jié)果

2.1 2組血清中miR-93的檢測(cè) qRT-PCR結(jié)果顯示，胃癌組血清中miR-93相對(duì)表達(dá)水平為(4.25±0.25)2-ΔΔct明顯高于對(duì)照組(0.97±0.06)2-ΔΔct，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=99.590,P<0.05)。

2.2 miR-93表達(dá)變化與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 以胃癌患者血清miR-93表達(dá)水平的中位值為截?cái)嘀?，將患者分為miR-93高表達(dá)組44例和mi-93低表達(dá)組44例，統(tǒng)計(jì)分析顯示胃癌患者血清miR-93表達(dá)與腫瘤直徑、病理分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度等有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別等無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 miR-93表達(dá)變化與GC臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 血清miR-93對(duì)胃癌的診斷價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，miR-93診斷胃癌時(shí)ROC曲線下面積(AUC)為0.975(95% CI為0.960～0.991，P<0.05)。最佳診斷值為1.597時(shí)，靈敏度為93.7%，特異度為92.4%。見圖1。

圖1 血清miR-93診斷胃癌的ROC曲線

2.4 回歸分析 Cox 回歸分析結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-93表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響胃癌患者預(yù)后的Cox 回歸分析

2.5 血清miR-93水平對(duì)胃癌預(yù)后的判斷價(jià)值 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，血清miR-93高表達(dá)組胃癌患者總生存率明顯低于血清miR-93低表達(dá)組胃癌患者(P<0.05)。見圖2。

圖2 血清miR-93高、低表達(dá)組胃癌患者生存曲線

3 討論

胃癌是一種好發(fā)于老年人的惡性腫瘤，該病起病隱匿，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期或晚期，為治療增加了一定的難度。臨床治療胃癌通常以化療、手術(shù)治療為主，但患者5年生存率仍不理想[6,7]，因此及早發(fā)現(xiàn)胃癌，對(duì)于提高患者生存率意義重大。有研究表明，作為小分子非編碼RNA的miRNA可以參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及多種腫瘤的進(jìn)展過程[8,9]。miRNA是一類在廣泛存在于人體中的小片段非編碼 RNA，不易被酶降解，可在血清中穩(wěn)定存在，且不易受到外界環(huán)境因素的影響，因此，臨床中可將血清中異常表達(dá)的miRNA作為診斷腫瘤及預(yù)測(cè)預(yù)后的分子標(biāo)記物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多血清中異常表達(dá)的miRNA可以作為惡性腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。陳劍等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-183在食管鱗癌患者血清中表達(dá)明顯增高，并且與腫瘤的TNM分期有關(guān)，血清miR-183能夠明顯提高食管鱗癌的診斷效率。在胰腺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)miR-196a和miR-210表達(dá)異常增高，并且與胰腺癌患者的生存時(shí)間相關(guān)[11]。王丹等[12]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者血清中miR-187-3p可能成為早期診斷及預(yù)后判斷特異敏感的生物標(biāo)志物。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)胃癌的研究中也發(fā)現(xiàn)了許多血清中異常表達(dá)的miRNA。王靜等[13]發(fā)現(xiàn)血清中miR-223對(duì)胃癌有著良好的早期診斷效能。陳卿奇等[14]研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清miR-132及miR-183異常高表達(dá)，可作為胃癌早期診斷的新型腫瘤標(biāo)記物。但至今尚未發(fā)現(xiàn)令人滿意的胃癌血清miRNA預(yù)測(cè)標(biāo)志物[15]。miR-93屬于miR-106b～25 miRNA簇重要成員，研究發(fā)現(xiàn)miR-93在消化道惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，可能與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示：胃癌患者血清中miR-93水平較對(duì)照組明顯升高，提示miR-93在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著癌基因的作用。有研究表明miR-93作為癌基因發(fā)揮作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[17]。但另有研究發(fā)現(xiàn)：miR-93在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)降低，作為抑癌基因發(fā)揮作用，能夠抑制癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲潛能[18]。原因可能為：miR-93在不同類型的腫瘤中通過不同的下游分子靶向通路起作用，存在明顯的異質(zhì)性。Li等[19]也發(fā)現(xiàn)miR-93在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，但是未對(duì)胃癌患者血清中miR-93表達(dá)水平進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，隨著腫瘤直徑擴(kuò)大、病理分化程度降低、TNM分期進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血清miR-93表達(dá)水平則隨之升高，說明 miR-93在胃癌中可能發(fā)揮癌基因的作用。本研究結(jié)果還顯示血清miR-93診斷胃癌時(shí)ROC曲線下面積(AUC)為0.975，通常AUC>0.9則表明診斷效能較高，提示miR-93對(duì)于早期胃癌的早期診斷價(jià)值較高，可作為胃癌早期診斷的敏感生物學(xué)指標(biāo)。本研究曾指出，在非小細(xì)胞癌組織中，miR-93表達(dá)顯著上調(diào)，高表達(dá)患者5年總生存率低[18]。本研究結(jié)果也顯示，與血清miR-93低表達(dá)組比較，血清miR-93高表達(dá)組胃癌患者預(yù)后較差。Cox 回歸分析結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-93表達(dá)水平是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。提示血清miR-93高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，胃癌患者血清中miR-93異常高表達(dá)，血清中miR-93可以作為早期診斷胃癌的血清生物學(xué)標(biāo)志物，且可作為胃癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。