miR-17靶向調(diào)控Akt2在抑制宮頸癌細(xì)胞增殖中的作用及機制研究

陳丹 李媛媛 趙俊

宮頸癌是發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤，高復(fù)發(fā)率以及高轉(zhuǎn)移性是宮頸癌預(yù)后不良的主要原因，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康[1]。近年來，盡管宮頸癌手術(shù)以及放化療技術(shù)取得了很大的發(fā)展，但是中晚期宮頸癌患者預(yù)后仍然極差[2]。因此，進(jìn)一步尋找宮頸癌發(fā)病的分子機制對于改善中晚期患者預(yù)后具有重大意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在腫瘤的增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，如miRNA以及l(fā)ncRNA等[3-7]。微小RNA即miRNA，一類長鏈非編碼RNA，其長度為19～25個核苷酸[8]。miRNA主要通過結(jié)合靶基因的3’非翻譯區(qū)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后水平從而干預(yù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞中亦存在較多差異表達(dá)的miRNA[10-13]，這些差異表達(dá)的miRNA可能成為宮頸癌分子靶向治療的潛在靶點。有研究報道m(xù)iR-17在乳腺癌以及肺癌中均出現(xiàn)差異表達(dá)，且差異表達(dá)的miR-17與腫瘤增殖密切相關(guān)[14,15]。miR-17在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低[16]，但其在宮頸癌中的發(fā)病機制尚未完全闡明。Akt又名蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)，當(dāng)前的研究結(jié)果表明AKT通路在細(xì)胞的增殖與凋亡過程中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[17]。TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果表明Akt2為miR-17的靶向調(diào)控基因，因此我們猜測miR-17可以通過靶向調(diào)控Akt2/Foxo1A/Bcl-2通路抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。本研究以上述背景為基礎(chǔ)，以Hela細(xì)胞株為研究對象，證實miR-17與Akt2的靶向調(diào)控關(guān)系，并通過多種實驗驗證miR-17靶向調(diào)控Akt2從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年8～12月在我院行手術(shù)切除的宮頸癌患者手術(shù)標(biāo)本23例，包括癌組織以及癌旁正常組織，入組患者均具有完善的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初診患者，術(shù)前無放化療以及內(nèi)分泌治療史；(2)術(shù)后病理確診為宮頸癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌等其他惡性腫瘤病史；(2)無心功能以及肝腎功能障礙；(3)合并傳染病史如艾滋病、梅毒以及肝炎等。標(biāo)本離體后30 min內(nèi)切取新鮮的癌組織以及癌旁正常組織，并將其置于裝有RNA保存液的凍存管中，放于-80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器 miR-17 mimics、inhibitor及對照組NC(普健生物科技有限公司，武漢)，蛋白酶抑制劑、PMSF(浩然生物技術(shù)有限公司，上海)，Trizol試劑(Thermo Fisher公司，美國)，BCA蛋白定量檢測試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)，DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰酶(Thermo Fisher公司，美國)，雙熒光素酶活性檢測試劑盒(北京艾然生物科技有限公司，北京)，Akt2抗體(abcom,ab38513)，內(nèi)參GAPDH抗體(abcom,ab8245)，Akt2的3’-UTR熒光素酶報告基因載體(introvigen公司，美國)，qT-PCR試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，RIPA組織裂解液(索萊寶科技有限公司，北京)，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，日本)，RNA提取試劑盒(索萊寶科技有限公司，北京)。宮頸癌細(xì)胞株(上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 液氮中取出Hela細(xì)胞以及正常宮頸上皮細(xì)胞，37℃快速復(fù)溫后離心(800 r/min，3 min)，將加入1 ml含有10%FBS的培養(yǎng)基重懸后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm2的小瓶中，繼續(xù)加入3 ml培養(yǎng)基，并將其置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。SiHa以及Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，H8細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中。

1.4 RNA提取及qRT-PCR檢測 (1)將收集的宮頸癌組織以及正常組織從-80℃冰箱取出并置于冰上，用鑷子或剪刀鉗夾適量組織塊置于研缽中，加入少許液氮后用力將組織研碎，加入1 ml Trizol反復(fù)吹吸，盡量將組織全部轉(zhuǎn)入無RNA酶的1.5 ml EP管中。加入200 μl氯仿，震蕩混勻后室溫靜置15 min，離心(12 000 g，4℃，15 min)，取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，離心(12 000 g，4℃，15 min)，加入75%乙醇，震蕩混勻后離心(8 000 g，4℃，5 min)，棄上清，室溫干燥15 min。10 μl DEPC水溶解RNA后，核酸檢測儀檢測RNA的濃度和純度(A260/280值約2.0)，將剩余的提取RNA立即放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)取融合度>80%的SiHa、Hela以及H8細(xì)胞消化后，離心，棄上清，提取細(xì)胞總RNA，以上述提取的總RNA為模板，進(jìn)行實時定量PCR技術(shù)，循逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，擴增28～32個循環(huán)后在實時熒光定量系統(tǒng)上檢測各組的CT值并記錄。G3PD為內(nèi)參，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。

1.5 熒光素酶報告基因?qū)嶒?取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，熒光顯微鏡下玻璃板計數(shù)，取2×104個細(xì)胞接種于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時將Akt2的3’-UTR熒光素酶報告基因載體及對照組(NC)導(dǎo)入細(xì)胞，每組設(shè)3個平行孔，共分為4組：Akt2(野生型或突變型)與miR-17 mimics共轉(zhuǎn)染組；Akt2(野生型或突變型)與對照組共轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培基，PBS沖洗2次(PBS提前預(yù)冷)，每孔加入100 μl 1×passive lysis Buffer，孵育15 min(室溫)，96孔發(fā)光檢測板中加入待檢樣品，放入ModulusTM 發(fā)光檢測儀中讀數(shù)，計算相對熒光強度并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取0.25%胰酶消化融合度達(dá)80%左右的對數(shù)生長期細(xì)胞，將其制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔1.5×105個細(xì)胞，將接種好細(xì)胞的6孔板搖勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。8 h后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染：A：更換1.5 ml無血清培養(yǎng)基，取5 μl lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑加入250 μl無血清混勻，室溫靜置20 min；B：取適量待轉(zhuǎn)化合物加入至250 μl無血清培養(yǎng)基中；C：將A液與B液混勻后加入6孔板中。6 h后換成常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時，收集細(xì)胞。qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.7 MTS檢測細(xì)胞 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，胰酶消化后將其制成單細(xì)胞懸液后計數(shù)，將細(xì)胞接種于以96孔板中(2×103個細(xì)胞)，每個轉(zhuǎn)染組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在鋪板后第0、1、2、3、4、5天各孔加入20 μl MTS工作液，培養(yǎng)箱中孵育2 h 后，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處各組細(xì)胞的吸光度 (OD值)，重復(fù)3次實驗。

1.8 細(xì)胞克隆形成能力檢測 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，胰酶消化后接種于6孔板中(每孔300個細(xì)胞、2 ml 培養(yǎng)基)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，各組孔重復(fù)加入轉(zhuǎn)染試劑一次，繼續(xù)培養(yǎng)1周，待觀察到有克隆團(tuán)形成時，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，甲醇固定15 min，去固定液后加入Giemsa染液染色20 min，流水沖洗后晾干，掃描拍照，計數(shù)肉眼可見克隆團(tuán)。重復(fù)3次實驗。

1.9 Foxo1A以及Bcl-2蛋白表達(dá)檢測 采用Western-blot方法，收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞(超聲破碎儀裂解30 min)；離心(14 000 g，4℃，30 min)，BCA 法測定細(xì)胞蛋白濃度，計算50 μg樣品的體積，加入總體積1/4的上樣緩沖液與樣品混勻后，將樣品置于沸水中煮沸5 min后將樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。配膠，上樣，跑膠，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，8%脫脂奶粉封閉3 h，一抗孵育過夜，TBST洗滌1次，二抗(1∶8 000)孵育2 h，TBST洗滌3次后，化學(xué)發(fā)光底物曝光條帶。GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 miR-17在宮頸癌組織以及細(xì)胞系中的表達(dá) qRT-PCR檢測miR-17在宮頸癌組織與宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：miR-17在宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于周圍正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與正常宮頸上皮細(xì)胞H8相比，miR-17在宮頸癌細(xì)胞株SiHa以及Hela細(xì)胞中表達(dá)明顯低于正常宮頸上皮細(xì)胞H8，且在Hela中的表達(dá)最低；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表1、2。

圖1 miR-17在宮頸癌組織、正常組織和宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

表1 miR-17在癌組織以及宮頸正常組織的表達(dá)

表2 miR-17在宮頸癌及正常細(xì)胞系水平

2.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-17的相對表達(dá)量 轉(zhuǎn)染miR-17 inhibitor、miR-17 mimics 以及對照組轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，qRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-17的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示：miR-17 inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-17 的相對表達(dá)量較NC組顯著降低，miR-17 mimics顯著高于NC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明miR-17 inhibitor和mimics作用較強，可以繼續(xù)后續(xù)的功能實驗。見表3。

表3 不同處理條件下細(xì)胞內(nèi)miR-17的表達(dá)水平

2.3 miR-17與Akt2的靶向調(diào)控關(guān)系 TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果顯示miR-17與Akt2的3’-UTR區(qū)域存在互補結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示：Akt2-wt與miR-17 mimics共轉(zhuǎn)染組熒光素酶的活性明顯低于Akt2-wt與陰性對照組共轉(zhuǎn)染組；而Akt2-mut與miR-17 mimics以及陰性對照組間熒光素酶活性強度無顯著差異。Western Blot結(jié)果顯示，miR-17 mimics轉(zhuǎn)染組的Akt2蛋白表達(dá)水平較對照組均顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-17 inhibitor組Akt2蛋白的表達(dá)升高。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-17 mimics轉(zhuǎn)染組的Akt2 mRNA表達(dá)水平較對照組顯著降低。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 miR-17與Akt2的靶向調(diào)控關(guān)系

2.4 MTS檢測細(xì)胞增殖 過表達(dá)或抑制miR-17的表達(dá)后，采用MTS法測定miR-17抑制劑組、過表達(dá)組和對照組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示從第1天開始，與對照組相比，miR-17抑制物組細(xì)胞生長速度明顯加快，miR-7 mimics組細(xì)胞生長速度明顯減慢，且2組均隨時間的推移，活細(xì)胞數(shù)與對照組的差值有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 MTS檢測轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞miR-17抑制劑和mimics后1～5 d細(xì)胞增殖活性的變化;與對照組比較，*P<0.05

表4 不同處理條件下細(xì)胞增殖活性比較

2.5 細(xì)胞克隆形成能力的檢測 過表達(dá)或抑制miR-17的表達(dá)后，采用平板克隆實驗測定miR-17抑制劑組、過表達(dá)組和對照組細(xì)胞的克隆形成能力，結(jié)果顯示與對照組相比，miR-17抑制物組細(xì)胞克隆形成能力明顯增強，miR-7 mimics組細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱(P<0.05)。見表5。

表5 不同處理條件下細(xì)胞克隆形成能力比較

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-17對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 分別轉(zhuǎn)染miR-17 mimics ，抑制劑后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的Hela細(xì)胞其凋亡率為(1.34±0.25)%，較對照組(4.67±0.41)%顯著降低；轉(zhuǎn)染miR-17 mimics的細(xì)胞其凋亡率(12.36±1.23)%，較對照組顯著升高。見圖5，表6。

2.7 3組細(xì)胞Akt2、FOXO1A、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 為了進(jìn)一步闡明miR-17對Akt2、FOXO1A、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，分別轉(zhuǎn)染miR-17 mimics和miR-17抑制物48 h后，收集細(xì)胞，Western-blot檢測各組細(xì)胞中Akt2、FOXO1A、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-17抑制物的Hela細(xì)胞Akt2表達(dá)顯著升高、FOXO1A以及Bcl-2表達(dá)顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-17 mimics組細(xì)胞Akt2表達(dá)顯著降低、FOXO1A以及Bcl-2表達(dá)顯著升高。見圖6，表7。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑后，較對照組相比，細(xì)胞凋亡數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-17 mimics后，較對照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著升高(*P<0.05)

表6 不同處理條件下細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

近年來，隨著社會的不斷進(jìn)步，醫(yī)學(xué)進(jìn)入了高速發(fā)展時代，基因檢測技術(shù)的不斷更新、靶向治療以及內(nèi)分泌治療的不斷改善，使得宮頸癌治療向著精準(zhǔn)化治療方向邁進(jìn)，然而，對于中晚期宮頸癌患者來說，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然較高，預(yù)后不良。目前研究已經(jīng)證實異常表達(dá)的分子或蛋白可能在促使腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。研究報道m(xù)iRNA的表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，包括肺癌、乳腺癌以及肝癌等[18-20]。因此，深入研究miRNA的功能及機制可能為腫瘤診斷、預(yù)后以及靶向治療等提供潛在靶標(biāo)。

圖6 Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑以及miR-17 mimics 后，Akt2、FOXO1A以及Bcl-2蛋白表達(dá)變化。轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑后，western-blot檢測各組Akt2表達(dá)升高，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-17 mimics后細(xì)胞中Akt2表達(dá)降低，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高

表7 不同處理條件下細(xì)胞Akt2、FOXO1A、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

miR-17是miRNA家族中的一個成員，Liu等[21]發(fā)現(xiàn)miR-17在肝癌中的表達(dá)顯著下調(diào)，Xu等[22]發(fā)現(xiàn)miR-17表達(dá)下調(diào)可以顯著增強前列腺癌細(xì)胞對放療的敏感性，令人關(guān)注的是Li等[23]發(fā)現(xiàn)miR-17可通過靶向調(diào)控ETV1抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖。而最近研究也發(fā)現(xiàn)miR-17在宮頸癌中的表達(dá)顯著降低，且與宮頸癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)[24]，但具體機制尚未完全闡明。Akt2是PI3K/Akt通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其在細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。FOXO1A基因是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的重要一員，是PI3K/Akt通路下游的靶向調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用[25]。B淋巴細(xì)胞白血病-2(B-cell lymphorma-2,Bcl-2)是目前已知重要的抗凋亡基因，同時也是FOXO1A下游的調(diào)節(jié)因子[26]，Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)Akt2為miR-17的靶基因，因此本研究提出了miR-17通過靶向調(diào)控Akt2進(jìn)而調(diào)控FOXO1A/Bcl-2通路干預(yù)細(xì)胞的增殖。本研究驗證了miR-17在宮頸癌組織與癌旁組織，宮頸癌細(xì)胞株Hela和宮頸正常上皮細(xì)胞株H8中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-17在宮頸癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，且在宮頸癌細(xì)胞株Hela中的表達(dá)亦顯著低于正常宮頸上皮細(xì)胞株H8；進(jìn)一步采用miR-17抑制劑和mimics轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞進(jìn)一步研究miR-17在宮頸癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮的作用，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的Hela細(xì)胞中miR-17表達(dá)明顯降低，MTS以及平板克隆實驗顯示細(xì)胞的增殖能力和平板克隆形成能力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；反之，轉(zhuǎn)染miR-17 mimics細(xì)胞中miR-17表達(dá)明顯增多，MTS以及平板克隆實驗顯示細(xì)胞的增殖能力和平板克隆形成能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高；上述結(jié)果提示低表達(dá)的miR-17促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。

為了進(jìn)一步研究miR-17在抑制宮頸癌細(xì)胞增殖中的作用機制，我們采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證miR-17與Akt2的靶向調(diào)控關(guān)系，結(jié)果顯示，較對照組相比，野生型Akt2與miR-17共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低，由此可見，Akt2為miR-17的靶基因。此外，western-blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑組的Hela細(xì)胞Akt2蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2的表達(dá)顯著降低，反之，miR-17 mimics轉(zhuǎn)染組Akt2蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2的表達(dá)顯著升高。由此提示，miR-17可通過靶向Akt2調(diào)控FOXO1A/Bcl-2通路抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-17在宮頸癌組織以及宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)均顯著降低，且Akt2是miR-17的靶基因。miR-17抑制劑處理組細(xì)胞Akt2蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2的表達(dá)顯著降低，miR-17 mimics轉(zhuǎn)染組Akt2蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)OXO1A以及Bcl-2的表達(dá)顯著升高。因此，miR-17可能是抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的潛在靶向分子，為中晚期宮頸癌患者治療提供新的思路。