MiR-4429/NQO1對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷及炎癥因子分泌的影響

周燕 郭珊嵐 蘭秀君 鄭紅

641300 資陽，四川省資陽市第一人民醫(yī)院腎病內科(周燕，蘭秀君),病理科(郭珊嵐),檢驗科(鄭紅)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的并發(fā)癥之一，腎小管上皮細胞損傷在DN發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，而腎小管上皮細胞損傷主要包括炎性損傷、細胞凋亡等[1]。研究表明高糖環(huán)境可誘導腎小管上皮細胞損傷[2]。目前關于腎小管上皮細胞損傷的分子機制尚未完全闡明，國外研究表明miR-29c、miR-216a-5p等miRNA可通過調控靶基因表達從而參與DN發(fā)生及發(fā)展過程[3-4]。但仍有部分miRNA在DN發(fā)生過程中的作用機制尚未闡明。因而探究其發(fā)生機制有助于診斷及治療DN。miR-4429在DN患者中呈高表達，但關于其具體作用機制尚未闡明[5-6]。生物信息學分析顯示依賴還原型輔酶/醌氧化還原酶1(NADH quinone dehydrogenase 1，NQO1)可能是miR-4429的靶基因，研究表明NQO1屬于抗氧化基因，并可拮抗高糖誘導的氧化應激反應[7-8]。但miR-4429是否可通過調控NQO1從而參與腎小管上皮細胞損傷過程尚未可知。本研究通過高糖誘導腎小管上皮細胞建立細胞損傷模型，觀察細胞中miR-4429與NQO1的表達，分析miR-4429與NQO1對高糖誘導腎小管上皮細胞損傷及炎性因子分泌的影響，旨在為進一步揭示腎小管上皮細胞損傷的分子機制奠定理論基礎。

材料與方法

一、材料與試劑

人腎小管上皮細胞HK-2購自上海通派生物科技有限公司；D-葡萄糖購自上海甄準生物科技有限公司；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；Lipofectamine2000購自上海潤成生物科技有限公司；miR-4429特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-4429)及陰性對照序列(anti-miR-NC)、miR-4429寡核苷酸模擬物(miR-4429 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、NQO1小干擾RNA(si-NQO1)及陰性對照序列(si-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自上海澤葉生物科技有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶細胞凋亡試劑盒購自上海朗智生物科技有限公司；RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司；二喹啉甲酸蛋白定量檢測試劑盒購自武漢卡諾斯科技有限公司；增強型化學發(fā)光試劑購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)抗體購自美國CST公司；兔抗人NQO1抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；丙二醛(malondialedhyde，MDA)含量檢測試劑盒與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒購自美國Abnova公司；白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

二、方法

1.細胞轉染與實驗分組 HK-2細胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數期HK-2細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，調整細胞密度1×104個/mL，按照每孔100 μL的密度接種于6孔板，用含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記作高糖組(HG組)[9]；用含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記作正常對照組(Control 1組)；用含有50 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記作高滲對照組(Control 2組)。取對數期HK-2細胞接種于6孔板，待細胞生長融合度達到70%時，將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，分別將anti-miR-NC、anti-miR-4429、anti-miR-4429與si-NC、anti-miR-4429與si-NQO1轉染至HK-2細胞，使用含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記作HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-4429組、HG+anti-miR-4429+si-NC組、HG+anti-miR-4429+si-NQO1組。轉染方法參照Lipofectamine2000試劑說明書，嚴格按照試劑說明書進行操作。

2.實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞中miR-4429、NQO1 mRNA的表達水平 收集各組腎小管上皮細胞，采用Trizol法提取腎小管上皮細胞中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。miR-4429正向引物5′-TCTCTCCAACTCAGACTGCC-3′，反向引物5′-AAAGCAAGTCAGGGAAGCCT-3′；NQO1正向引物5′-TCCCAGGTTCCAGCAATTCT-3′，反向引物5′-CACTTTGGGAGGCTGAGGTA-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。qRT-PCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA 2 μL，正反向引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6 μL；反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循環(huán)。miR-4429以U6為內參，NQO1以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-4429、NQO1 mRNA的相對表達量。

3.MTT檢測細胞增殖 收集各組對數期腎小管上皮細胞接種于96孔板(3×104個/孔)，每組設置3個復孔，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 300 r/min離心5 min，棄上清液，按照每孔150 μL的密度加入二甲基亞砜(DMSO)，室溫避光振蕩孵育5 min，應用酶標儀檢測各孔吸光度值，計算細胞存活率，計算公式為：細胞存活率(%)=[(各實驗組A值-空白對照組A值)/(正常對照組A值-空白對照組A值)×100%]，實驗重復3次。

4.流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組對數期腎小管上皮細胞，1 000 r/min離心6 min，棄上清，預冷PBS洗滌，加入5 μL 膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素，充分混勻，加入5 μL碘化丙啶，室溫振蕩孵育10 min，置于FACS Calibur流式細胞儀及應用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡率。

5.檢測MDA含量與SOD活性 收集各組對數期腎小管上皮細胞，按照試劑盒說明書分別檢測MDA含量與SOD活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

6.酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測IL-1β、TNF-α濃度 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，根據ELISA檢測試劑盒檢測IL-1β、TNF-α含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

7.雙熒光素酶報告基因檢測miR-4429的靶基因 starBase預測顯示NQO1的3′UTR含有miR-4429的互補序列，將結合位點與突變位點分別插入熒光素酶報告基因載體分別構建野生型載體WT-NQO1與突變型載體MUT-NQO1，分別將WT-NQO1、MUT-NQO1與miR-NC、miR-4429 mimics共轉染至腎小管上皮細胞，按照熒光素酶活性檢測試劑盒分別檢測各組細胞相對熒光素酶活性。參照Lipofectamine2000說明書分別將miR-NC、miR-4429、anti-miR-NC、anti-miR-4429轉染至腎小管上皮細胞，通過qRT-PCR與蛋白免疫印跡法(western blot)檢測各組細胞中NQO1 mRNA及蛋白表達量。

8.Western blot檢測NQO1、Caspase-3蛋白表達 收集各組對數期腎小管上皮細胞，加入蛋白裂解液(1 mL RIPA、1%苯甲基磺酰氟、0.1% 抑肽酶)，冰上裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r/min(離心半徑6 cm)離心15 min，吸取上清液。采用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品加入SDS上樣緩沖液，高溫煮沸，蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜、封閉，加入NQO1(稀釋比1∶1 000)、Caspase-3(稀釋比1∶1 000)與內參GAPDH(稀釋比1∶2 000)一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(稀釋比1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加增強型化學發(fā)光試劑顯影，應用Quantityone軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參照條帶灰度值。

三、統計學處理

結 果

一、miR-4429、NQO1 mRNA在高糖誘導的腎小管上皮細胞中的表達

與Control 1組、Control 2組相比，HG組細胞中miR-4429的表達水平顯著升高(P<0.05)，NQO1 mRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)。(表1)

表1 miR-4429、NQO1 mRNA在高糖誘導的腎小管上皮細胞中的表達量比較(n=9)

二、抑制miR-4429對高糖誘導的腎小管上皮細胞的細胞存活率及凋亡的影響

與Control 1、Control 2組相比，HG組細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)；與HG+anti-miR-NC組相比，HG+anti-miR-4429組細胞存活率顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)。(圖1、表2)

注：與Control 1組和Control 2組比較，aP<0.05；與HG+anti-miR-NC組比較，bP<0.05

表2 抑制miR-4429對高糖誘導的腎小管上皮細胞的細胞存活率及凋亡的影響(n=9)

三、抑制miR-4429對高糖誘導的腎小管上皮細胞中氧化應激及炎癥因子的影響

相較于Control 1、Control 2組，HG組細胞中MDA、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與HG+anti-miR-NC組相比，HG+anti-miR-4429組細胞中MDA、IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。(表3)

表3 抑制miR-4429對高糖誘導的腎小管上皮細胞中炎癥因子分泌的影響

四、miR-4429靶向調控NQO1的表達

starBase預測顯示NQO1的3′UTR含有miR-4429的互補序列，見圖2A。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，轉染野生型載體WT-NQO1的細胞中，miR-4429組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)；轉染突變型載體MUT-NQO1的細胞中，miR-4429組與miR-NC組熒光素酶活性相比差異無統計學意義(P>0.05)(表4)。qRT-PCR與Western blot檢測結果顯示，與miR-NC組相比，miR-4429組細胞中NQO1 mRNA及蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-4429組細胞中NQO1 mRNA及蛋白表達量顯著升高(P<0.05)(圖2B、表5)。

圖2 miR-4429對NQO1靶向調控作用 A.NQO1的3’UTR含有miR-4429的互補序列；B.4組細胞NQO1蛋白的表達情況

表4 雙熒光素酶報告實驗結果(n=9)

表5 miR-4429調控NQO1的表達(n=9)

五、抑制NQO1聯合抑制miR-4429對高糖誘導的腎小管上皮細胞的細胞凋亡、氧化應激及炎癥因子分泌的影響

與HG+anti-miR-4429+si-NC組相比，HG+anti-miR-4429+si-NQO1組細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)，IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。(圖3、表6)

表6 兩組細胞存活率、凋亡率、氧化應激及炎癥因子比較(n=9)

圖3 抑制NQO1聯合抑制miR-4429對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡及NQO1、Caspase-3蛋白表達的影響A.兩組腎小管上皮細胞凋亡情況；B.兩組NQO1、Caspase-3蛋白的表達情況

討 論

DN的主要病理特征是腎小球病變，而腎功能損傷與腎小球病變密切相關，研究表明腎小管上皮細胞凋亡是促使腎小球病變的重要原因之一，同時炎性損傷與氧化損傷等多種因素也可促使腎小球病變[10]。研究表明miRNA可參與高糖誘導的內皮細胞損傷過程[11]。相關報道指出高糖處理后的腎小管上皮細胞是DN腎小管上皮細胞損傷模型，并可用于體外實驗研究[12]。本研究結果顯示高糖處理后腎小管上皮細胞凋亡率明顯增多，提示成功構建DN腎小管上皮細胞損傷模型。

本研究結果顯示高糖處理后腎小管上皮細胞中miR-4429的表達水平明顯升高。研究表明miR-4429在急性缺血性中風、肥胖相關疾病中表達上調，并可能參與該疾病發(fā)生及發(fā)展過程[13-14]。但miR-4429在DN腎小管上皮細胞損傷發(fā)生過程中的調控機制尚未可知。本研究結果提示miR-4429表達量升高可能促進DN腎小管上皮細胞損傷的發(fā)生進而參與DN的發(fā)生過程，進一步分析顯示抑制miR-4429表達后可明顯抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，降低Caspase-3表達量，提示抑制miR-4429表達可能通過下調Caspase-3表達來抑制細胞凋亡，從而減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷并減緩DN的發(fā)展進程。

有研究表明糖尿病引起的氧化應激反應可加重腎小管上皮細胞損傷，降低MDA含量，增強SOD活性可明顯提高細胞抗氧化能力[15]。本研究結果顯示，高糖處理后腎小管上皮細胞中MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低，而抑制miR-4429表達可明顯提高SOD活性，減低MDA含量，提示抑制miR-4429表達可減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞氧化損傷。相關報道指出腎小管上皮細胞凋亡與腎臟組織炎癥反應密切相關，IL-1β、TNF-α可引起細胞損傷從而間接促進細胞凋亡[16]。本研究結果顯示,抑制miR-4429表達可減少高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞分泌IL-1β、TNF-α，提示抑制miR-4429表達可減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞炎性損傷。

本研究通過生物信息學分析顯示NQO1可能是miR-4429的靶基因，進一步分析顯示miR-4429能夠靶向結合NQO1，并可負向調控NQO1的表達。研究表明NQO1可催化醌類化合物形成水合醌類，還可與葡萄糖醛酸等形成共軛鍵而穩(wěn)定存在于細胞中，其發(fā)生反應的過程中沒有自由基等氧化產物形成從而可保護細胞免受氧化損傷[17]。研究表明上調NQO1表達可減輕視網膜神經節(jié)細胞氧化損傷[18]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示高糖處理后腎小管上皮細胞中NQO1表達量明顯降低，提示miR-4429可能通過調控NQO1的表達從而參與腎小管上皮細胞損傷過程。本研究還發(fā)現，抑制NQO1表達后可明顯減弱抑制miR-4429表達對高糖誘導腎小管上皮細胞的保護作用,提示抑制miR-4429表達可靶向上調NQO1表達從而抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，提高細胞存活率，減輕炎癥損傷，增強細胞抗氧化能力。

綜上所述，在高糖誘導的腎小管上皮細胞中，miR-4429表達上調，NQO1表達下調，miR-4429可能靶向調控NQO1的表達從而加重高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷；抑制miR-4429表達可明顯減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞炎性損傷及氧化損傷，抑制細胞凋亡，提高細胞存活率，可為揭示DN發(fā)生機制提供新方向。