益生菌改善尿毒癥大鼠腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)保護腸道屏障功能的研究

魏萌 蔣紅利 史珂慧 王萌 孫凌霜 何荃

710061 西安，西安交通大學第一附屬醫(yī)院血液凈化科

慢性腎臟病患者由于腎小球濾過率持續(xù)降低，大量的尿毒癥毒素如尿素、尿酸、胺類、胍類、吲哚類、未完全代謝的激素等在體內(nèi)潴留，血液中多種代謝廢物不斷蓄積，患者逐漸產(chǎn)生尿毒癥的各種癥狀，以胃腸道癥狀尤為突出[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者存在嚴重腸道屏障功能障礙，尿毒癥大鼠出現(xiàn)腸道細菌移位且腸道通透性增高[2-3]，腸道菌群移位參與尿毒癥微炎癥狀態(tài)的產(chǎn)生和發(fā)展，而微炎癥與多種尿毒癥并發(fā)癥密切相關(guān)[4-5]。益生菌具有改善腸道屏障完整性，抑制病原菌黏附定植，調(diào)節(jié)腸道免疫力等多種有益作用[6]。動物雙岐桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)是目前研究較多、應(yīng)用較廣泛的益生菌菌種，多個實驗研究均發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)腸道屏障功能的卓越效果[7-8]。因此，本研究擬通過對尿毒癥大鼠口服補充益生菌動物雙岐桿菌乳亞種Bi-07，研究益生菌是否可改善尿毒癥大鼠腸道屏障功能障礙，并同時探討益生菌對腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，以期揭示補充益生菌改善腸道屏障功能的作用機制，為后續(xù)深入研究益生菌干預改善尿毒癥患者多種并發(fā)癥提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、尿毒癥動物模型制備及實驗分組

取雄性SD大鼠40只，隨機分為假手術(shù)組(n=10)以及模型組(n=30)，模型組采用5/6腎切除法制備尿毒癥動物模型，假手術(shù)組僅打開腎包膜。至第10周末，模型組有20只大鼠達到尿毒癥腎功能水平，進入后續(xù)實驗，分為尿毒癥組(n=10)和尿毒癥+益生菌組(n=10)。將動物雙歧桿菌乳亞種Bi-07凍干粉接種至改良TPY培養(yǎng)基復蘇后，取少量菌液再次接種至TPY培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌液濃度至109Cfu/mL。取菌液1 mL灌胃尿毒癥+益生菌組大鼠，灌胃后給予正常飲水及飲食，每日灌胃，共持續(xù)4周。假手術(shù)組和尿毒癥組大鼠均行普通飲水飲食處理。

二、腎臟及腸道組織病理學

三組大鼠采用水合氯醛麻醉后，分別取空腸、回腸、結(jié)腸腸道組織標本按常規(guī)脫水、透明、包埋，石蠟切片3～4 μm。按組別進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。

三、腸道通透性的檢測

每只大鼠均給予含有5 μCi/mL的99mTc-DTPA溶液1 mL灌胃后，置于代謝籠中，以新的清潔塑料杯收集每只大鼠24 h尿液。24 h后測定每只大鼠的尿量，取少量尿液用于檢測尿中所含的核素量。同時采用斷尾法留取大鼠血液用于測定殘留在血液中的核素濃度。通過估算每只大鼠的血液量換算出殘留在其體內(nèi)的核素量。核素的檢測在西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科進行，檢測過程由其臨檢人員執(zhí)行。腸道的通透性以24 h尿液中所含的99mTc-DTPA總量及殘留在血液中的核素量之和占灌胃給予的99mTc-DTPA量的百分比表示，計算公式如下：

大鼠總血量(mL)=0.06×體質(zhì)量(g)+0.77[9]

放射劑量(血)=核素濃度×總血量(mL)

放射劑量(尿)=核素濃度×總尿量(mL)

四、免疫比濁法檢測超敏C反應(yīng)蛋白

采用散射免疫比濁法測定血清超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)。檢測操作委托西安交通大學醫(yī)院第一附屬醫(yī)院檢驗科。檢測嚴格按照hs-CRP試劑盒說明操作。

五、血清中炎癥因子白細胞介素-6、腫瘤壞死因子α水平檢測

所有樣品血清均進行酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

六、硝酸鑭示蹤法觀察腸上皮細胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)

各組隨機選取5只大鼠，分別留取回腸組織標本0.5 cm，生理鹽水充分漂洗去除黏附的腸道內(nèi)容物。迅速將標本置入3%硝酸鑭-0.1 mol/L二甲胂酸鈉-3%戊二醛的固定液中，固定2 h。取出標本，于3%硝酸鑭-0.1 mol/L二甲胂酸鈉的緩沖液漂洗2次，每次10 min。再經(jīng)含2%硝酸斕-1%四氧化鋨固定液作后固定2 h，0.1 mol/L二甲胂酸鈉的緩沖液浸洗后，常規(guī)電鏡梯度丙酮或乙醇脫水，Epon812包埋。超薄切片機切片，每份標本在透射電鏡下隨機觀察5個視野。

七、腸組織丙二醛含量及超氧化物歧化酶活力檢測

將凍存于-80 ℃的回腸組織取出，稱重后置入4 ℃生理鹽水中勻漿。以1 500 rpm離心15 min，取上清。勻漿液蛋白定量采用考馬氏亮蘭蛋白法。采用硫代巴比妥酸縮合法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，MDA測試盒由南京建成生物公司提供，檢測步驟嚴格按說明書進行。采取黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力，SOD測試盒由南京建成生物公司提供，檢測步驟嚴格按說明書進行。

八、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、各組大鼠一般情況及生化指標比較

術(shù)后三組大鼠傷口無出血和感染。尿毒癥組大鼠逐漸表現(xiàn)出活動量減少、對外界刺激反應(yīng)遲鈍，喜拱背蜷縮，食物攝入量減少，且體質(zhì)量增長速度減緩，毛色轉(zhuǎn)黃干枯，疏松不齊，眼、耳、尾逐漸變蒼白。假手術(shù)組活動靈活，毛色、眼、耳及尾部均無異常變化，食量隨體質(zhì)量增長不斷增加，尿量無異常改變。尿毒癥+益生菌組大鼠基本情況同尿毒癥組。

術(shù)后7天模型組大鼠出現(xiàn)蛋白尿，尿素氮、血肌酐水平逐漸升高，術(shù)后第10周，5/6腎切除建模大鼠共有20只存活且血肌酐水平達到尿毒癥標準。假手術(shù)組10只大鼠全部存活。尿毒癥組、尿毒癥+益生菌組大鼠紅細胞比容均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，尿毒癥組大鼠尿量有減少趨勢，但與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。(表1)

表1 三組大鼠基本生物學參數(shù)

二、光鏡下各組大鼠腸道病理情況比較

假手術(shù)組大鼠各腸段呈正常腸組織形態(tài)，腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰飽滿，炎性細胞數(shù)量較少且分布均勻，絨毛部腸上皮細胞間可見大量吸收細胞。

尿毒癥組空腸、回腸明顯可見腸絨毛萎縮變細、倒塌，固有層大量炎性細胞浸潤，吸收細胞減少，空腸、回腸固有層及黏膜下層可見局部水腫，部分腸黏膜見淺表的潰瘍形成。結(jié)腸亦見炎性細胞浸潤，但與假手術(shù)組相比差異較小。

尿毒癥+益生菌組空腸、回腸仍可見炎細胞浸潤，但炎細胞浸潤程度較尿毒癥組減輕，空腸、回腸固有層及黏膜下層可見局部水腫，幾乎不可見腸黏膜淺表潰瘍。結(jié)腸亦見炎性細胞浸潤，但與假手術(shù)組差異較小。(圖1)

圖1 三組大鼠空腸、回腸、結(jié)腸病理圖(HE染色) A.假手術(shù)組空腸(×100)；B.假手術(shù)組回腸(×200)；C.假手術(shù)組結(jié)腸(×100)；D.尿毒癥組空腸(×100)；E.尿毒癥組回腸(×200)；F.尿毒癥組結(jié)腸(×100)；G.尿毒癥+益生菌組空腸(×100)；H.尿毒癥+益生菌組回腸(×200)；I.尿毒癥+益生菌組結(jié)腸(×100)

三、各組大鼠腸道通透性比較

尿毒癥組腸道通透性顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與尿毒癥組相比較，尿毒癥+益生菌組腸道通透性顯著降低(P<0.05)；尿毒癥+益生菌組與假手術(shù)組相比較，腸道通透性無顯著差異(P>0.05)。(表2)

四、各組大鼠炎癥介質(zhì)水平比較

尿毒癥組hs-CRP、IL-6、TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與尿毒癥組相比較，尿毒癥+益生菌組hs-CRP、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；尿毒癥+益生菌組與假手術(shù)組相比，hs-CRP、IL-6、TNF-α水平無顯著差異(P>0.05)。(表2)

表2 三組大鼠血炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素及腸道通透性

五、電鏡下各組大鼠腸道病理情況比較

假手術(shù)組回腸上皮細胞微絨毛表面少見鑭顆粒附著，腸黏膜上皮細胞間緊密連結(jié)構(gòu)完整，未見高電子致密物硝酸鑭滲入。

尿毒癥組回腸上皮細胞微絨毛表面附著大量鑭顆粒，高電子致密物硝酸鑭清晰分隔所有細胞外膜，不僅上皮細胞間緊密連接破壞可容硝酸鑭滲入，細胞之間所有接觸部位均有大量硝酸鑭滲入。

尿毒癥+益生菌組回腸上皮細胞微絨毛表面有少量鑭顆粒附著，可見少量示蹤劑滲入細胞間隙，極少部分細胞間隙呈高電子密度影，細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)模糊。盡管硝酸鑭可通過連接復合體，但是并未見硝酸鑭下行滲入深面細胞膜。(圖2)

注：箭頭示硝酸鑭染料聚集

六、各組大鼠腸組織MDA含量及SOD活力比較

回腸組織MDA含量及SOD活力反映組織氧化損傷程度。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，尿毒癥組回腸組織中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活力顯著降低(P<0.05)。與尿毒癥相比較，尿毒癥+益生菌組SOD活力顯著升高(P<0.05)，與假手術(shù)組相比較，尿毒癥+益生菌組SOD活力無顯著差異(P>0.05)。與尿毒癥組相比較，尿毒癥+益生菌組MDA含量降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(表3)

表3 三組大鼠腸組織SOD活力及MDA含量

討 論

本研究中我們對尿毒癥大鼠補充益生菌動物雙歧桿菌乳亞種Bi-07，并從腸道通透性、血炎癥因子、腸道氧化應(yīng)激水平以及腸道超微結(jié)構(gòu)多個方面研究益生菌對尿毒癥腸屏障的保護作用，結(jié)果顯示尿毒癥大鼠補充益生菌后，腸上皮細胞間緊密連接完整性恢復，腸道通透性下降、腸道氧化應(yīng)激減輕，血中炎癥因子水平改善，提示補充益生菌動物雙歧桿菌乳亞種Bi-07可改善腸道屏障功能，其機理與降低腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，并能夠在一定程度上改善尿毒癥微炎癥狀態(tài)。

正常情況下，腸道正常菌群之間保持著相當穩(wěn)定的比例關(guān)系，它們與腸道黏膜結(jié)合，以黏附或嵌合的方式形成有一定規(guī)律的膜菌群，與宿主的微空間結(jié)構(gòu)形成一個既相互依賴又相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)，這種微生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了腸道的微生物屏障。在構(gòu)成腸道生物屏障的眾多細菌中，雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是主要的共生菌類，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌被認為是人類宿主最重要的有益菌[10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)終末期腎病患者及大鼠腸道菌群譜發(fā)生了改變，乳酸桿菌、雙歧桿菌及擬桿菌門等益生菌減少，梭狀芽胞桿菌、腸桿菌科、產(chǎn)氣莢膜梭菌等致病菌增多[2-3]。腸道菌群譜的改變使得腸道細菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物發(fā)生改變，也使得腸道來源的尿毒癥毒素譜發(fā)生改變。

益生菌是指“對機體健康產(chǎn)生有益影響的微生物”。目前，益生菌在炎癥性腸病[11]、肝硬化[12]、腸易激綜合征[13]、抗生素相關(guān)性腹瀉[14]等疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，主要作用機制包括維持腸道屏障完整性，調(diào)節(jié)腸道局部免疫力，保持正常菌群結(jié)構(gòu)，降低病原體對腸道附著力并抑制其繁殖。研究證明尿毒癥患者及動物較常出現(xiàn)腸道黏膜局部水腫糜爛、腸道運動功能障礙、腸道局部及全身免疫力低下，腸道黏膜屏障損害普遍存在[15]。因此，針對性的給予尿毒癥大鼠補充其明確缺乏的益生菌，可能起到穩(wěn)定腸道屏障功能的作用。

益生菌攝入機體后，其自身或表面成分作為抗原物質(zhì)刺激機體免疫。腸道內(nèi)樹突狀細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等抗原遞呈細胞對其水解、消化、加工，繼之與Th細胞相互作用，最終激活腸道固有層內(nèi)B淋巴細胞。在益生菌的不斷刺激下，B淋巴細胞分化增強，大量的成熟漿細胞可分泌sIgA、IgG、IgM。益生菌能夠?qū)δc黏膜中免疫細胞刺激、誘導分化，而免疫細胞充分發(fā)揮其攝取、抗原呈遞的作用，故產(chǎn)生大量的免疫效應(yīng)因子，抵抗外源性致病菌對機體損害，進而保護腸道的免疫屏障。

腸上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)在維持腸黏膜的通透性和完整性方面起著重要作用，是構(gòu)成腸黏膜機械屏障的重要組成部分。硝酸鑭是一種高密度的重金屬，分子量為433，其顆粒大小約為1～4 nm，不能穿過正常的細胞間緊密連接和細胞膜，故其常用于判斷組織細胞間是否存在緊密連接、屏障功能及細胞膜通透性改變，是超微結(jié)構(gòu)水平常用的示蹤物[16]。硝酸鑭染色結(jié)合透射電鏡方法觀察緊密連接其結(jié)果直觀反映腸道機械屏障完整性。本研究采用硝酸鑭示蹤劑染色觀察腸上皮細胞間緊密連接，發(fā)現(xiàn)尿毒癥組大鼠的腸黏膜細胞間緊密連接間隙明顯增寬，示蹤劑有不同程度的滲透現(xiàn)象。在尿毒癥+益生菌組大鼠腸組織中示蹤劑滲透減少，提示益生菌干預可改善腸上皮細胞間緊密連接完整性，保護腸道的機械屏障功能。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最終代謝產(chǎn)物，反映了機體脂質(zhì)過氧化的速度和強度，SOD是體內(nèi)主要的自由基清除劑，保護機體組織和細胞DNA免受氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)：尿毒癥大鼠腸道組織MDA含量增加，SOD活性降低，表明尿毒癥大鼠腸道過氧化反應(yīng)增強，大量的氧自由基可能參與腸道屏障功能損傷。脂質(zhì)過氧化作用可引起細胞損傷及功能障礙，大量的氧自由基能攻擊生物膜中的多聚不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成過氧化產(chǎn)物。尿毒癥時SOD等抗氧化酶減少，使機體不能有效清除脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基，脂質(zhì)雙層在氧自由基的作用下膜表面糖蛋白結(jié)構(gòu)含量出現(xiàn)改變，脂質(zhì)雙層細胞膜結(jié)構(gòu)生理性穩(wěn)態(tài)異常。另外，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細胞內(nèi)多種酶活性，如三磷酸腺苷酶、堿性磷酸酶和核苷酸酶結(jié)構(gòu)異常，三磷酸腺苷生成減少使得細胞膜主動轉(zhuǎn)運功能障礙[17-18]。因此我們推測腸道中過氧化反應(yīng)增強可能與腸道屏障功能障礙有關(guān)。本項目在對尿毒癥大鼠補充益生菌動物雙歧桿菌乳亞種Bi-07后，結(jié)果顯示腸組織中SOD活力顯著增強，MDA呈下降趨勢，說明補充益生菌后腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱，提示益生菌動物雙歧桿菌乳亞種Bi-07保護腸道屏障完整性的機理為抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。動物雙歧桿菌不表達尿素酶基因，因此可避免尿素衍生的胺類和細菌尿素酶催化的氨對腸屏障的破壞作用。

本項目補充益生菌后大鼠血液中IL-6、TNF-α、hs-CRP等微炎癥指標也顯著改善，提示益生菌可改善尿毒癥大鼠微炎癥反應(yīng)。增加有益菌數(shù)量，可減少潛在致病菌數(shù)量，可以競爭性的阻止病原菌黏附定植在腸黏膜。雙歧桿菌通過維持腸上皮細胞間緊密連接的蛋白表達，維持腸屏障的完整性[19]，能夠調(diào)節(jié)非特異性細胞免疫反應(yīng)，增加粒細胞和單核細胞的吞噬活力，移位的細菌因此可以被俘獲和清除[20]。

綜上所述，尿毒癥大鼠補充益生菌動物雙歧桿菌乳亞種Bi-07保護腸道屏障功能，可減輕尿毒癥微炎癥狀態(tài)，其機理與降低腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，然而在尿毒癥狀態(tài)下，益生菌動物雙歧桿菌乳亞種Bi-07改善腸道屏障功能的分子機制還值得進一步探討。