谷氨酰胺和丙酮酸鈉對NK-92 細胞體外擴增的影響

應丹妮, 陳煥蕓, 付 巖, 蔡海波, 譚文松

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室, 上海 200237)

1 前 言

免疫效應細胞由于其獨特的殺瘤能力和治療優(yōu)勢使其在腫瘤疾病治療中備受矚目[1-2]。在治療過程中，為了獲得滿意的臨床效果，需要分離患者自體免疫效應細胞通過體外擴增技術獲得符合臨床要求的細胞數(shù)量。由于從腫瘤患者體內(nèi)難以采集大量免疫效應細胞，且收獲的細胞質(zhì)量受患者身體狀況影響很大，常常無法實現(xiàn)有效擴增，不僅使患者遭受巨大痛苦，也影響治療效果[3-4]。因此，如何提高免疫細胞體外擴增效果并維持其殺傷活性是亟待解決的問題[5-7]。

氨基酸作為哺乳動物細胞培養(yǎng)基中的重要成分，其不僅是細胞增殖所需生物大分子的合成原料，某些氨基酸也可作為能源物質(zhì)為細胞體外擴增提供ATP，除此之外，還可以作為嘌呤、嘧啶、氨基糖和抗氧化劑合成的底物，參與其他生物合成途徑去維持細胞的完整和功能[8]。研究發(fā)現(xiàn)，當免疫效應細胞被激活時，抑制氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達從而阻礙氨基酸的攝取時，會抑制它的擴增和功能[9-13]。同時丙酮酸是多種氨基酸合成的起始化合物，免疫效應細胞受到刺激時會通過丙酮酸羧化酶加速丙酮酸氧化以促進免疫細胞的增殖[14]。由此可見，優(yōu)化培養(yǎng)基中氨基酸種類和濃度是免疫細胞體外擴增過程中的關鍵環(huán)節(jié)。而有血清培養(yǎng)基成分復雜，現(xiàn)有商業(yè)化無血清培養(yǎng)基中的氨基酸濃度通常也是保密的，無法使用現(xiàn)有的培養(yǎng)基進行優(yōu)化以適滿足細胞需求[15]。

為此，本文以具有CD3-CD56+表型特征和高細胞毒性的自然殺傷細胞系(natural killer-92 cells, NK-92)細胞為對象[16]，在一款自主設計的化學成分簡單、明確的無血清培養(yǎng)基SFM-MIN 中分析了NK-92 體外擴增前期氨基酸的消耗，探查關鍵營養(yǎng)組分，采用正交實驗確定其最適濃度。并在有/無血清培養(yǎng)體系中，以細胞活性、總細胞擴增、培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞比例、胞內(nèi)ATP 含量和細胞殺傷活性為指標，驗證了研究結(jié)果。為后續(xù)開發(fā)免疫效應細胞高效擴增的無血清培養(yǎng)基提供了技術支持和依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

NK-92 細胞來源于人惡性非霍奇金淋巴瘤患者外周血，購自南京科佰生物科技有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基購自美國Thermo 公司；HIPP-T009 淋巴細胞無血清培養(yǎng)基購自上海倍諳基生物科技有限公司，其谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度分別為3.3 和1.0 mmol·L-1；胎牛血清購自美國Hyclone 公司；馬血清購自以色列Biological Industries 公司；白細胞介素2(IL-2)購于美國Peprotech 公司；鼠抗人FITC-CD3 抗體和鼠抗人PE-CD56 抗體購自美國 Becton Dickinson 公司；二甲基亞砜購自美國 Merck 公司；丙酮酸鈉購自美國Applichem 公司；谷氨酰胺購自美國Merck 公司；CellTiter-LumiTMPlus 發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。SFM-MIN 是自配的無血清培養(yǎng)基，其谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度分別為0.0 和0.0 mmol·L-1。

2.2 方法

2.2.1 細胞培養(yǎng)

NK-92 細胞以 5×105cells·mL-1的密度接種于添加 12.5% 胎牛血清和 12.5% 馬血清的 α-MEM 培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基T009 中，并添加1 000 U·mL-1IL-2，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d。培養(yǎng)過程中，每天取樣計數(shù)，并補充新鮮培養(yǎng)基和IL-2，調(diào)回最初接種密度。

2.2.2 細胞凍存

將處于對數(shù)生長期的NK-92 細胞以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清后懸浮于由90% 胎牛血清和10%二甲基亞砜組成的凍存液中，以1×107cells·mL-1的密度接入1.5 mL 的凍存管，每管1 mL，4 ℃ 放置30 min，-20 ℃ 放置2 h 后轉(zhuǎn)移到 -80 ℃ 冰箱中，24 h 后放入液氮中凍存7 d。

2.2.3 細胞表型分析

收集(5～10)×105個細胞，加入抗體稀釋液1 mL，1 500 r·min-1離心5 min，洗滌2 次后，將細胞重懸于 100 μL 抗體稀釋液中。分別將 8 μL 濃度為 0.2 mg·mL-1FITC-CD3 抗體和 8 μL 濃度為 0.2 mg·mL-1PE-CD56 抗體加入至上述細胞懸液中，4 ℃ 孵育30 min 使細胞表面抗原與加入的抗體充分結(jié)合，最后加入抗體稀釋液1 mL，1 500 r·min-1離心5 min 除去未結(jié)合的抗體并將細胞重懸于300 μL 抗體保存液中，采用FACS Aria I 流式細胞儀(美國Becton Dickinson 公司)分析培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞的比例，結(jié)果用FlowJo 軟件進行處理和分析。

2.2.4 胞內(nèi)ATP 含量測定

采用化學發(fā)光方法測定胞內(nèi)ATP 含量，取一定量的待測細胞，制備密度為1.5×104cells·mL-1的細胞懸液，將100 μL 細胞懸液加入到事先加有100 μL·孔CellTiter-LumiTMPlus 發(fā)光檢測試劑的96 孔板中，以添加100 μL 培養(yǎng)基為對照，采用熒光酶標儀進行化學發(fā)光檢測。

2.2.5 NK-92 細胞對K562 殺傷活性的檢測

以NK-92 細胞為效應細胞(E)，以處于對數(shù)生長期的K562 細胞為靶細胞(T)，利用2 個細胞共培養(yǎng)時NK-92 細胞對K562 細胞的殺傷作用評價NK-92 細胞的殺傷活性。分別將1×105個NK-92 細胞(E)、1×104個K562 細胞(T)、以及上述2 種細胞的混合物(ET)接種于裝有100 μL 無血清培養(yǎng)基的96 孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)4 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃ 孵育2 h 后用酶標儀檢測效應細胞(E)、K562 細胞(T)和 2 種細胞的混合物(ET)在 450 nm 處的吸光度 ODE、ODT和 ODET。按式(1)計算 NK-92細胞對K562 細胞的殺傷活性：

2.2.6 氨基酸濃度分析

采用濃度已知的20 種氨基酸混合液標準品稀釋制成不同濃度的氨基酸標準品混合液，以鄰苯二甲醛一氯甲酸芴甲酯(OPA-FMOC)為衍生劑進行柱前衍生[17]，根據(jù)峰面積和濃度之間的關系繪制氨基酸標準曲線，采用相同方法檢測培養(yǎng)基中相對應的20 種氨基酸峰面積，根據(jù)標準曲線計算各氨基酸的濃度。

2.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 統(tǒng)計分析軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以平均值加減標準差的形式表示，p ＜ 0.05表示存在顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 NK-92 細胞在培養(yǎng)過程中的氨基酸消耗分析

NK-92 細胞以 1×105cells·mL-1的密度接種于添加 2 mmol·L-1谷氨酰胺的 SFM-MIN 培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 d 后檢測培養(yǎng)基中20 種氨基酸濃度，計算培養(yǎng)2 d 后各氨基酸濃度變化差值如圖1 所示。由圖1 可知，NK-92細胞對不同氨基酸的需求存在較大的差異。天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸濃度呈升高趨勢，其余氨基酸濃度都有不同程度的降低，谷氨酰胺、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸這5 種氨基酸濃度變化幅度較大，其中以谷氨酰胺變化量最為顯著。進一步分析上述消耗較大的氨基酸的代謝特點，發(fā)現(xiàn)絲氨酸、蘇氨酸亮氨酸和異亮氨酸合成的原料來均與糖代謝過程中的丙酮酸有關。由此可推測，NK-92 細胞對谷氨酰胺和丙酮酸兩種營養(yǎng)物質(zhì)有較高的需求。

3.2 谷氨酰胺和丙酮酸鈉最適添加濃度的確定

使用 minitab 軟件設計了兩因子四水平正交實驗，其中X 代表培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度，濃度分別為0.0、 6.5、13.0、19.5 mmol·L-1，Y 代表培養(yǎng)基中丙酮酸鈉濃度，濃度為分別為 0.0、2.5、5.0、7.5 mmol·L-1(如表 1)，共產(chǎn)生 16 個正交實驗組。將 NK-92 細胞以 1×105cells·mL-1的密度接種于上述 16 種實驗組無血清培養(yǎng)基中，每48 h 取樣計數(shù)，并補充新鮮培養(yǎng)基和IL-2，調(diào)回最初接種密度，培養(yǎng)至10 d 時，測定各實驗組的總細胞擴增倍數(shù)，結(jié)果如表2，圖2 和表3 所示。

圖1 NK-92 細胞在SFM-MIN 中培養(yǎng)2 d 的氨基酸濃度差(n = 3)Fig.1 Difference of amino acid concentration for NK-92 cells cultured in SFM-MIN for 2 days (n = 3)

表1 2 因子4 水平正交設計Table 1 Two-factor four-level orthogonal design

表2 正交實驗結(jié)果(n = 3)Table 2 Results of the orthogonal experiments (n = 3)

圖2 均值主效應圖(n = 3)Fig.2 Main effect maps of mean values (n = 3)

表3 正交實驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of the orthogonal experiment results (*: p < 0.05)

N 為3 個平行實驗組的總細胞擴增倍數(shù)N1～N3 的平均值，進一步求出X、Y 2 種因子對應4 種不同水平的N 值平均值，即K1、K2、K3、K4，得到均值主效應圖即圖2。由實驗結(jié)果可知，在上述添加濃度范圍中，谷氨酰胺最適水平為13.0 mmol·L-1，丙酮酸鈉最適水平為2.5 mmol·L-1。

將正交實驗的數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表3 所示，谷氨酰胺和丙酮酸鈉對總細胞擴增倍數(shù)都有顯著性的影響(p ＜ 0.05)。

3.3 谷氨酰胺和丙酮酸鈉促進未凍存NK-92 細胞的擴增效率

將提高了谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度至上述最適水平的商業(yè)化α-MEM 有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基T009 為實驗組，不額外添加谷氨酰胺和丙酮酸鈉的原始培養(yǎng)基為對照組，以細胞活性、總細胞擴增倍數(shù)、培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞比例和細胞殺傷活性為指標，評價提高谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度對NK-92 細胞擴增的影響。

圖3為NK-92細胞在提高了谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度的有血清培養(yǎng)基中的擴增情況。從圖3(A)可知，培養(yǎng)過程中實驗組NK-92 細胞活性與對照組相當；培養(yǎng)15 d 后，總細胞擴增倍數(shù)為(3 712.85±225.74) 倍，顯著高于對照組的(2 255.93±243.00) 倍 (p ＜ 0.05) (圖 3(B))；培養(yǎng)物中 CD3-CD56+細胞比例為(89.63±1.56)%，與對照組中 CD3-CD56+細胞比例(88.37±2.74)% 相近(圖 3(C))。

圖4 為NK-92 細胞在提高了谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度的無血清培養(yǎng)基中的擴增情況。從圖4(A)中可見，在培養(yǎng)前期，兩種培養(yǎng)基中的NK-92 細胞活性相當，但培養(yǎng)到第9 d，對照組中NK-92 細胞活性開始降低，而實驗組中NK-92 細胞的活率可以穩(wěn)定維持在90% 以上；到第11 d 時，細胞活性已顯著高于對照組 (p ＜ 0.05)；培養(yǎng) 15 d 的總細胞擴增為(3 193.59±199.99)倍，顯著高于對照組的(1 917.16±242.87) 倍(p ＜ 0.05) (圖4(B))；培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞比例為(90.37±0.90)%，顯著高于對照組中CD3-CD56+細胞比例(82.68±2.28)% (p ＜ 0.05) (圖4(C))?？梢?，提高培養(yǎng)基丙酮酸鈉和谷氨酰胺濃度促進了NK-92細胞的擴增。

以效靶比10:1 將擴增15 d 的NK-92 細胞與K562 共培養(yǎng)，分別評價在提高了谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度的有/無血清培養(yǎng)基中擴增后的NK-92 細胞的殺傷功能，結(jié)果如圖5 所示。由圖可知，在有/無血清實驗組中培養(yǎng)的NK-92 細胞的殺傷活性均值分別為63.53% 和71.22%，高于對照組57.23% 和62.63%?？梢?，提高培養(yǎng)基中丙酮酸鈉和谷氨酰胺濃度提高了NK-92 細胞的殺傷活性。

圖5 有血清和無血清培養(yǎng)基中谷氨酰胺和丙酮酸鈉對NK-92 細胞殺傷活性的影響(n = 3)Fig.5 Effects of glutamine and sodium pyruvate on the cytotoxicity of NK-92 cells in serum and serum-free media (n = 3) *: p ＜ 0.05

3.4 谷氨酰胺和丙酮酸鈉促進凍存后NK-92 細胞擴增效率

進一步將凍存7 d 后復蘇的NK-92 細胞以5×105cells·mL-1的密度接種于有/無血清培養(yǎng)基中，以谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度提高至上述最適水平為實驗組，不額外添加谷氨酰胺和丙酮酸鈉的原始培養(yǎng)基為對照組，以細胞活性、總細胞擴增倍數(shù)、培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞比例、胞內(nèi)ATP 含量和細胞殺傷活性為指標，評價提高谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度對凍存后NK-92 細胞生長的影響。

培養(yǎng)過程中的細胞活性、總細胞擴增倍數(shù)和培養(yǎng)物中 CD3-CD56+細胞比例如圖 6 所示。由圖 6(A)可知，在有血清實驗組培養(yǎng)基中培養(yǎng)凍存復蘇后的NK-92 細胞，培養(yǎng)1 d 后，其細胞活性可以快速由73.90%提高到90% 以上，而對照組中NK-92 細胞活性在第4 d 才上升至90%；且在培養(yǎng)的1～7 d，實驗組中細胞的活性均顯著高于對照組 (p ＜ 0.05)；由圖6(B)可見，在無血清實驗組培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 d 后，其細胞活性可以快速由73.90% 提高到80% 以上，而對照組中NK-92 細胞活性在第3 d 才上升至80% 以上；且在培養(yǎng)的1～5 d，其活性均顯著高于對照組 (p ＜ 0.05)；在有/無血清實驗組培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d 的總細胞擴增分為 (3 117.74±120.21) 倍和 (1 282.35±162.68) 倍，顯著高于對照組的 (1 031.86±111.13) 倍和(672.06±68.18)倍 (p ＜ 0.05) (圖6(C)～(D))；同時，在有血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞比例為(91.53±2.14)%，與對照組中CD3-CD56+細胞比例(89.67±1.44)% 相近(圖6(E))。而在無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物中CD3-CD56+細胞比例為(92.06±2.28)%，顯著高于對照組中CD3-CD56+細胞比例(84.81±1.74)%(p ＜ 0.05) (圖6(F))?？梢姡岣弑徕c和谷氨酰胺濃度促進了凍存復蘇后NK-92 細胞的擴增。

圖6 有/無血清培養(yǎng)基中谷氨酰胺和丙酮酸鈉對凍存后NK-92 細胞活性、總細胞擴增倍數(shù)和CD3-CD56+ 細胞比例的影響(n = 3)Fig.6 Effects of glutamine and sodium pyruvate on NK-92 cell activity, expansion fold of total cells and the percentage of CD3-CD56+ cells inserum/serum-free media after cryopreservation (n = 3) *: p ＜ 0.05

谷氨酰胺和丙酮酸鈉與細胞的能量代謝密切相關，ATP 是細胞內(nèi)微環(huán)境的重要組成，是細胞合成代謝的關鍵因子，因此進一步分析NK-92 細胞在提高了谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度的有/無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～4 d 的胞內(nèi)ATP 水平，結(jié)果如圖7 所示。由圖可知，凍存后NK-92 細胞胞內(nèi)ATP 都呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，并都高于凍存復蘇起始值；培養(yǎng)1 d 后，NK-92 細胞胞內(nèi)ATP 均迅速回升，但在有/無血清培養(yǎng)基實驗組中擴增的細胞胞內(nèi)ATP 水平顯著高于對照組(p ＜ 0.05)；而在培養(yǎng)第3 d，其細胞胞內(nèi)ATP 水平顯著低于對照組(p ＜ 0.05)。由于ATP 作為細胞的“能量通貨”，其胞內(nèi)水平是生成和消耗共同作用的結(jié)果。提高谷氨酰胺和丙酮酸鈉濃度有助于三羧酸循環(huán)的轉(zhuǎn)運，從而促進胞內(nèi)ATP的生成。在培養(yǎng)早期細胞擴增不明顯，細胞胞內(nèi)ATP 生成大于消耗，使得培養(yǎng)早期胞內(nèi)ATP 水平高，有助于細胞快速進入擴增狀態(tài)；而后期細胞進入快速擴增狀態(tài)，需要更多的ATP 支持其快速生長，因而胞內(nèi)ATP 水平低。由此可見，谷氨酰胺和丙酮酸鈉的補充提升了細胞的能量代謝水平從而促進了復蘇后NK-92 細胞的體外擴增。

圖7 有血清和無血清培養(yǎng)基中谷氨酰胺和丙酮酸鈉對凍存后NK-92 細胞胞內(nèi)ATP 的影響(n = 3)Fig.7 Effects of glutamine and sodium pyruvate on intracellular ATP of NK-92 cells in serum and serum-free media after cryopreservation (n = 3) *: p ＜ 0.05

進一步評價擴增后的NK-92 細胞的功能，結(jié)果如圖8 所示。由圖可知，在有/無血清實驗組中培養(yǎng)凍存復蘇的NK-92 細胞的殺傷活性均值分別為62.33% 和64.63%，高于對照組54.65% 和56.70%?？梢?，補充谷氨酰胺和丙酮酸鈉提高了NK-92 細胞的殺傷活性。

圖8 在有血清和無血清培養(yǎng)基中谷氨酰胺和丙酮酸鈉對凍存后NK-92 細胞殺傷活性的影響(n = 3)Fig.8 Effects of glutamine and sodium pyruvate on the cytotoxicity of NK-92 cells after cryopreservation in serum and serum-free medium (n = 3) *: p ＜ 0.05

4 結(jié) 論

本文基于自主設計的成分簡單、明確的SFM-MIN 無血清培養(yǎng)基分析了NK-92 細胞氨基酸代謝特性，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸這5 中氨基酸在培養(yǎng)過程中消耗最為顯著，其中尤以谷氨酰胺為甚?？紤]蘇氨酸，絲氨酸、亮氨酸以及異亮氨酸其合成途徑均與丙酮酸有關，因此確定谷氨酰胺和丙酮酸鈉為關鍵營養(yǎng)組分，通過正交實驗確定了其最適濃度分別為13.0 和2.5 mmol·L-1，并將含12.5% 胎牛血清和12.5% 馬血清的α-MEM 培養(yǎng)基和市售的商業(yè)化無血清培養(yǎng)基T009 中谷氨酰胺和丙酮酸鈉的濃度至提高至最適濃度，提高了未凍存和凍存后NK-92 細胞的擴增倍數(shù)和殺傷活性。該結(jié)果為免疫細胞快速、高效擴增提供思路。