克氏原螯蝦源維氏氣單胞菌的分離鑒定及組織病理學觀察

胡 騫 胡瑞雪 金玉立 顧澤茂

(1.華中農(nóng)業(yè)大學雙水雙綠研究院/水產(chǎn)學院,武漢 430070;2.湖北省水生動物病害防控工程技術研究中心,武漢 430070)

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)俗稱“小龍蝦”,隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda),是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種,深受消費者喜愛。我國是世界上最大的克氏原螯蝦養(yǎng)殖國家,近幾年我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量不斷增加,2017年全國總產(chǎn)量高達1.1297×109kg,養(yǎng)殖面積達8.0×105hm2[1]。隨著我國養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,克氏原螯蝦的病害也呈現(xiàn)爆發(fā)趨勢,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟損失和環(huán)境污染,也威脅克氏原螯蝦的質量安全。

氣單胞菌屬中的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas cavive)[2]、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[3]和維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)[4,5]等細菌感染能引起克氏原螯蝦的大量死亡。其中維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)屬于氣單胞菌科氣單胞菌屬,是一種廣泛存在于淡水、海水、淤泥和土壤中的條件致病菌,能引起人類腸胃炎、肺炎和傷口感染[6],也可感染多種水生動物,導致斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[7]、泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)[8]、達氏鱘(Acipenser dabryanus)[9]、鯰(Silurus soldatovi)[10]等魚類發(fā)病死亡,引起中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[11]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[12]的無力死亡。

2016年5月,湖北省洪湖市、荊州市、潛江市及安徽省合肥市等地區(qū)養(yǎng)殖的克氏原螯蝦陸續(xù)出現(xiàn)暴發(fā)性死亡。患病蝦四肢無力,反應遲鈍,應激能力較弱,伏于池塘邊沿或水草后死亡。為明確該病病原,本研究通過形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定,結合16S rDNA和gyrB序列分析測定和系統(tǒng)發(fā)育分析對從患病蝦中分離到的病原菌進行鑒定,觀察回歸感染后病蝦肝胰腺、腸道和心臟的病理變化,并檢測了藥物敏感性,以期為該病的防控和基礎研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗蝦

患病克氏原螯蝦取自湖北省潛江市某基地,體長為(7.0±1.0) cm。供試健康克氏原螯蝦購自潛江市農(nóng)貿(mào)市場,平均體長為(8.0±0.7) cm。

1.2 主要試劑

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自青島高科園海博生物技術有限公司,細菌微量生化管、藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司,細菌基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 致病菌的分離與回歸感染

取典型患病的克氏原螯蝦,用75%酒精對其體表進行消毒,無菌操作取其肝胰腺組織,劃線接種于BHI瓊脂平板,28℃恒溫培養(yǎng)24h,隨機挑取3株優(yōu)勢菌落,進一步劃線純化培養(yǎng)。將純化的菌株用BHI培養(yǎng)基28℃過夜搖勻培養(yǎng),加終濃度15%的甘油,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將500只健康克氏原螯蝦運至實驗室暫養(yǎng),水溫為(24±1)℃,日換水量約30%,做好水草躲避場所,及時充氧清污并定期投喂人工配合飼料。暫養(yǎng)10d后,取400尾健康克氏原螯蝦隨機分成4組,3個實驗組和1個對照組,每組三個平行,每個平行20尾蝦。將上述分離純化的菌株過夜培養(yǎng)用于人工感染實驗,血球計數(shù)板測定菌液濃度,用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1.0×106、1.0×107和1.0×108CFU/mL。實驗組分別在蝦的第三步足基部關節(jié)軟膜處注射0.1 mL不同濃度的菌液,對照組注射相同體積的無菌生理鹽水。連續(xù)觀察蝦的攝食、活動及發(fā)病情況,記錄每組蝦的死亡數(shù)量,使用改良寇氏法計算LD50,對瀕死病蝦進行細菌再分離和鑒定。

1.4 致病菌的鑒定

生理生化鑒定 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14],利用微量細菌生化鑒定管對分離株的生理生化指標進行測定。

PCR鑒定參照TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書提取分離菌株的基因組DNA,以提取的的DNA為模板,用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對細菌的16S rDNA進行擴增。PCR的擴增條件為: 94℃預變性4min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共30個循環(huán);72℃延伸6min;16℃結束反應程序。同時,采用通用引物UP-1和UP-1S對模板基因組DNA的gyrB基因進行擴增[15],擴增條件為: 94℃預變性4min;94℃變性1min,60℃退火1min,72℃延伸2min,共30個循環(huán);72℃延伸6min;16℃結束反應程序。PCR產(chǎn)物的純化與測序委托奧科鼎盛生物科技有限公司完成,其中gyrB基因的測序引物為UP-2r和UP-2Sr[15]。所得序列通過NCBI的Blast進行同源性檢索,GenBank下載相關序列,Muscle比對后,利用MEGA 7.0軟件,選用NJ方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 克氏原螯蝦的病理損傷研究

取健康蝦100尾,隨機分為2組,第一組60尾注射無菌生理鹽水稀釋的3×107CFU/mL濃度菌液;第二組40尾,注射生理鹽水。無菌生理鹽水稀釋菌液濃度至3×107CFU/mL進行感染試驗,正常組注射0.85%生理鹽水,接種后第6h、12h、24h、48h和72h采樣,每個時間點取3尾,采集肝胰腺、心臟、腸道等組織,4%多聚甲醛固定48h,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等步驟處理,切片厚度為4 μm,組織切片用蘇木精-伊紅(HE)染色,中性樹脂封片后顯微鏡(Olympus CX21)觀察拍照。

1.6 藥物敏感性實驗

將菌株懸液均勻涂布于BHI瓊脂平板上,采用標準Kirby-Bauer紙片擴散法對其進行16種抗生素藥物的敏感性檢測,以抑菌圈直徑作為判定指標,參照文獻[16]確定致病菌株對藥物的敏感程度。所用抗生素涉及喹諾酮類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類和氯霉素類。

2 結果

2.1 致病菌的分離

從自然患病克氏原螯蝦肝胰腺劃線接種后,BHI固體培養(yǎng)基上長出大量色澤和形態(tài)均一的菌落,菌落呈圓形、不透明、灰白色,表面光滑、中央隆起、邊緣整齊,直徑為1—2 mm。從平板上隨機挑取3個單菌落,對其16S rDNA序列進行擴增、測序,獲得3條完全一致的序列,挑選其中一株為代表菌株,命名為QD160502。

從表1可以看出,克氏原螯蝦人工注射QD160502后,在12h內(nèi)開始出現(xiàn)死亡,1.0 ×108CFU/mL實驗組蝦在36h內(nèi)全部死亡,當注射菌液濃度為1.0 ×107CFU/mL時,蝦的死亡率在48h后高達90%,對照組不發(fā)病。使用改良寇氏法計算72hLD50值為2.98×106CFU/mL。人工感染的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似,主要表現(xiàn)為螯足無力、行動遲緩。從人工感染后瀕死蝦的肝胰腺分離到的菌株與QD160502的形態(tài)特征、理化性質及16S rDNA、gyrB序列完全一致,證明為同一菌株?；貧w感染實驗表明菌株QD160502為本次發(fā)病的病原菌,且對克氏原螯蝦有著較強的致病性。

2.2 致病菌的鑒定

菌株QD160502的生理生化特性鑒定結果見表2,在35個特性中,除七葉苷水解陰性、精氨酸雙水解酶陽性和水楊苷發(fā)酵陰性與維氏氣單胞菌參考菌株有差異外,其他結果均一致,初步鑒定QD160502為維氏氣單胞菌。

菌株QD160502的16S rDNA序列長度為1441 bp(GenBank登錄號為: KX585901),gyrB序列長度為1143 bp(GenBank登錄號: MN189983),在NCBI中進行Blast同源性檢索,發(fā)現(xiàn)其16S rDNA序列與維氏氣單胞菌的同源性最高(99.9%),gyrB序列與維氏氣單胞菌的同源性最高(98.53%)。選取不同氣單胞菌屬的代表株16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1、圖2)。結果顯示,QD160502與維氏氣單胞菌聚為一支。

表 1 菌株QD160502對克氏原螯蝦人工感染實驗結果Tab.1 The mortality of Procambarus clarkii challenged with strain QD160502

表 2 菌株QD160502的理化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain QD160502

2.3 致病菌感染克氏原螯蝦的動態(tài)病理學研究

正常肝小管形態(tài)完整,排列緊密(圖版Ⅰ-1);6h后,肝小管結構保持完整,肝小管間出現(xiàn)少量嗜伊紅物質(圖版Ⅰ-2);12h后,分泌細胞(B細胞)中出現(xiàn)內(nèi)含棕色顆粒的轉運小泡(圖版Ⅰ-3);24h后,含棕色顆粒的轉運小泡數(shù)目增加,肝小管間出現(xiàn)炎性細胞浸潤(圖版Ⅰ-4);48h后,儲存細胞(R細胞)與分泌細胞(B細胞)大量解體、空泡化(圖版Ⅰ-5);72h后,肝小管上皮細胞壞死,可見破裂組織落入管腔(圖版Ⅰ-6)。

正常腸道結構形態(tài)完整,由外向內(nèi)分別為外膜層、肌肉層、結締組織層、上皮層、幾丁質層(圖版Ⅱ-1);在本實驗中,觀察到腸道組織從攻毒24h之后開始出現(xiàn)明顯的病理變化,攻毒24h后腸道結締組織萎縮,柱狀上皮組織與結締組織剝離(圖版Ⅱ-2);48h后皺嵴減少,組織間存在大量裂隙(圖版Ⅱ-3);72h后柱狀上皮組織損傷和壞死,組織間存在大量裂隙,可見外膜層與肌肉層分離(圖版Ⅱ-4)。

正常心臟結構形態(tài)完整;24h后,心臟出現(xiàn)空泡樣擴張(圖版Ⅲ-2);48h后,心肌出現(xiàn)大量空泡樣擴張(圖版Ⅲ-3);72h后,心臟內(nèi)出現(xiàn)透明細胞聚集(圖版Ⅲ-4)。

圖2 基于QD160502 gyrB序列構建的氣單胞菌的NJ樹Fig.2 Phylogenetic NJ tree based on QD160502 gyrB sequence

圖版 I 注射攻毒后克氏原螯蝦肝胰腺組織結構Plate I Hepatopancreas histopathology after QD160502 challenge

圖版 Ⅱ 注射攻毒后克氏原螯蝦中腸組織結構Plate Ⅱ Midgut histopathology after QD160502 challenge

圖版 Ⅲ 注射攻毒后克氏原螯蝦心臟組織結構Plate Ⅲ Histopathology of heart after QD160502 challenge

2.4 致病菌的藥敏性

菌株QD160502對16種抗生素的藥敏實驗結果見表3。該菌對恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、強力霉素、復方新諾明高度敏感;對頭孢氨芐、新霉素、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑、氟苯尼考中度敏感;對青霉素、阿莫西林、鏈霉素、卡那霉素耐藥。

3 討論

維氏氣單胞菌作為條件性致病菌在水體環(huán)境中廣泛存在,在夏、秋兩季其繁殖最快,近幾年維氏氣單胞菌引起的疾病暴發(fā)病例越來越多,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[17]。本研究從患病克氏原螯蝦肝胰腺分離的優(yōu)勢菌株QD160502,經(jīng)細菌形態(tài)學及生理生化指標結果初步鑒定為維氏氣單胞菌。分子鑒定發(fā)現(xiàn)分離菌株的16S rDNA序列和gyrB序列與NCBI中收錄的維氏氣單胞菌最為接近,系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示QD160502與維氏氣單胞菌聚為一支,結合分離株的形態(tài)學特征及生理生化特性進一步鑒定該分離株為維氏氣單胞菌。維氏氣單胞菌感染克氏原螯蝦已有陸續(xù)報道,2016年姜光明等[4]從江蘇一中華絨螯蟹和克氏原螯蝦混養(yǎng)池中患菌血癥的蝦上分離到了有強致病性的維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿的混合感染,2018年彭博文等[5]報道從荊州某養(yǎng)殖場患病克氏原螯蝦上分離出致病性維氏氣單胞菌,上述兩起報道中病害的暴發(fā)時間分別為6月與4月下旬,而本研究中病害暴發(fā)于5月,4月下旬至6月是克氏原螯蝦養(yǎng)殖與出售的關鍵時期,此時期水溫與部分運動性嗜溫氣單胞菌物種,如嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的最適溫度區(qū)間相重合[13],因此,維氏氣單胞菌對克氏原螯蝦的潛在危害性足夠引起相關學者和養(yǎng)殖者的注意。

本研究通過組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)隨著感染狀態(tài)的持續(xù),病蝦組織會出現(xiàn)不同程度的病理損傷。在注射24h內(nèi)心臟和腸道并未出現(xiàn)明顯病理變化,肝胰腺結締組織間出現(xiàn)了少量嗜伊紅物質,肝小管分泌細胞內(nèi)出現(xiàn)含有棕色顆粒的轉運小泡。在注射接種24后,病蝦肝胰腺和腸道組織出現(xiàn)明顯的病理特征,表現(xiàn)為肝小管內(nèi)儲存細胞(R細胞)與分泌細胞(B細胞)大量解體和空泡化,腸道柱狀上皮細胞以及結締組織的壞死、腸嵴減少。王權等[18]和丁正峰等[19]在克氏原螯蝦的藥物急性毒理研究中都觀察到了類似的含顆粒小泡,也有研究指出環(huán)境的脅迫如低pH[20]和低鹽度[21]也會引起蝦蟹肝胰腺內(nèi)分泌細胞中轉運泡和空泡增多,王權等[18]推測該顆?？赡苁且环N富鋅轉運泡,與克氏原螯蝦對重金屬的解毒功能有關,而丁正峰等[19]推測該顆粒是蝦在受到有害物質的刺激時,出現(xiàn)黑色素的沉積癥狀。儲存細胞(R細胞)與分泌細胞(B細胞)分別具有消化吸收營養(yǎng)物質和儲藏營養(yǎng)物質的功能[21],我們推測轉運泡增加是機體在感染脅迫下營養(yǎng)消耗增加引起。肝胰腺和腸道是克氏原螯蝦重要的營養(yǎng)消化和吸收器官,細胞壞死和空泡變性影響了腸道和肝胰腺的結構功能的完整性,感染蝦表現(xiàn)的攝食減少病癥也加重克氏原螯蝦面臨的饑餓脅迫[22,23],降低病蝦對疾病和環(huán)境應激的抵抗能力,進一步誘發(fā)克氏原螯蝦的死亡。此外,心肌細胞空泡樣擴張和大量血細胞的聚集,可能引起克氏原螯蝦心臟的收縮舒張異常,導致心律衰竭與血淋巴循環(huán)障礙[19],這可能是克氏原螯蝦死亡的另一重要原因。

目前對水產(chǎn)動物細菌性疾病的控制仍主要依靠抗菌藥物,但使用漁用抗生素應該科學而謹慎,避免因抗生素濫用或錯用所導致的耐藥性產(chǎn)生,環(huán)境污染和抗生素殘留問題。本研究在進行藥物敏感性檢測時所選用的抗生素回避了漁用禁藥,包括目前水產(chǎn)常用抗生素類以及部分還未被開發(fā)成水產(chǎn)藥物的抗生素,結果發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌對喹諾酮類和四環(huán)素類中的藥物都敏感,而對氨基糖苷類的藥物不敏感。在進行疾病防治時,應著重注意池塘環(huán)境改良與維護,精準用藥,盡可能地減輕對環(huán)境的污染。

表 3 菌株QD160502的藥物敏感試驗結果Tab.3 Antibiotics sensitivities of the strain QD160502