好氧反硝化細(xì)菌的鑒定及其脫氮特性研究

朱 云 龔?fù)麑?謝 駿 王廣軍 余德光 李志斐 張 凱 田晶晶

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510380;2.上海海洋大學(xué),水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,養(yǎng)殖方式從傳統(tǒng)粗放型向現(xiàn)代規(guī)?；⒓s化轉(zhuǎn)變[1],養(yǎng)殖過程中營養(yǎng)物質(zhì)的高投入,導(dǎo)致池塘養(yǎng)殖內(nèi)源氮素污染嚴(yán)重,不僅會惡化水質(zhì),致使養(yǎng)殖動物疾病暴發(fā),養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量下降,而且氮素超標(biāo)嚴(yán)重的養(yǎng)殖尾水排放會導(dǎo)致江河水域環(huán)境的污染。因此,如何降低池塘養(yǎng)殖水體中氮素污染成為水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。生物脫氮以無污染、高效率的優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是去除水體中氮素的有效途徑之一[2]。傳統(tǒng)的生物脫氮理論認(rèn)為反硝化是嚴(yán)格厭氧的過程[3],氧氣會抑制反硝化還原酶基因的表達(dá)和反硝化還原酶的活性,不能發(fā)揮微生物脫氮的作用。

20世紀(jì)80年代,Robertson和Kuenen[4]首次成功分離出了一株細(xì)菌Thiosphaera pantotropha(現(xiàn)命名為Paracoccussp.),報(bào)道了該菌能夠在好氧條件下進(jìn)行反硝化作用,并將此現(xiàn)象命名為好氧反硝化。Bell等[5]對Paracoccussp.的反應(yīng)機(jī)理開展了進(jìn)一步研究,結(jié)果表明,好氧反硝化的發(fā)生是由于細(xì)胞內(nèi)存在的好氧反硝化作用酶系。好氧反硝化細(xì)菌能夠在有氧的環(huán)境中將NO-N和NO-N還原為N2,這就為生物脫氮提供了嶄新的思路[6]。此后,越來越多的好氧反硝化細(xì)菌從不同的環(huán)境中分離出來,如糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)[7]、假單胞菌(Pseudomonadaceae)[8]、不動桿菌(Acinetobacter)[9]、叢毛單胞菌(Comamonas)[10]、紅球菌(Rhodococcus)[11]、芽孢桿菌(Bacillus)[12]和副球菌(Paracoccus)[13]等,其中以假單胞菌屬最多[14—17]。好氧反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn),為現(xiàn)有的養(yǎng)殖池塘水體中氮素的去除工藝提供了新的研究方向。

本研究從廣東省中山市草魚養(yǎng)殖池塘水體中分離出一株高效好氧反硝化細(xì)菌ZS1,對該菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析,探究了該菌株在好氧條件下的脫氮特性以及不同環(huán)境因子對菌株ZS1脫氮效率的影響,以期為養(yǎng)殖池塘尾水處理系統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)工藝提供理論支持及初步的候選菌株。

1 材料與方法

1.1 池塘條件及樣品采集

本實(shí)驗(yàn)在廣東省中山市某養(yǎng)殖場進(jìn)行,池塘面積約10000 m2,水深1.8 m。該池塘采用輪捕輪放的生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù),三年不換水,其中主養(yǎng)草魚密度為30000 尾/hm2,規(guī)格為1000 g/尾。

采樣時(shí)間為2018年3月20日,養(yǎng)殖水溫24.3℃,溶氧為4.5 mg/L,pH為7.7。上午10點(diǎn)用采水器5點(diǎn)采樣法取池塘水樣裝于無菌水樣袋中,置于4℃冷藏箱中,并立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株的富集和分離。

1.2 培養(yǎng)基

(1)基礎(chǔ)富集培養(yǎng)基: 酵母浸膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,pH=7。

(2)反硝化富集培養(yǎng)基[18]: 酵母浸膏3.0 g,蛋白胨5.0 g,KNO3l.0 g,蒸餾水1000 mL,pH=7.0—7.6。

(3)溴百里酚藍(lán)(BTB)培養(yǎng)基: KNO31.0 g,C6H5Na3O21.0 g,KH2PO41.0 g,FeSO4·7H2O 0.05 g,CaCl20.2 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,1%的溴百里香酚藍(lán) 1 mL,蒸餾水999 mL,pH=7.2。

(4)反硝化性能測定培養(yǎng)基: CH3COONa 2.56 g,KNO30.361 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,KH2PO4l.0 g,K2HPO45.0 g,NaCl 0.5 g,微量元素溶液1 mL,蒸餾水999 mL,pH=7.4。

(5)微量元素溶液: EDTA 50 g,CaCl25.5 g,ZnSO42.2 g,MnCl2·4H2O 5.06 g,FeSO4·7H2O 5.0 g,(NH4)6MO7O2·4H2O 1.1 g,CuSO4·5H2O 1.57 g,CoCl2·6H2O 1.61 g,蒸餾水1000 mL,pH=7.0。

1.3 菌株的富集、分離和篩選

將養(yǎng)殖場采集的水體10 mL放入裝有90 mL反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在搖床上培養(yǎng)(180 r/min,30℃)。24h后,取菌懸液體1 mL,放置到9 mL無菌水的離心管中,混合混勻,然后用涂布平板10倍稀釋法分離好氧反硝化細(xì)菌。將平板長出的菌落進(jìn)行3 次純化,得到純菌。

挑取純化后的純菌株單菌落至液體反硝化富集培養(yǎng)基中至其長到對數(shù)期,將其稀釋為細(xì)菌濃度為4×108cfu/mL的菌懸液,取1 mL菌懸液接種到裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中,放置在搖床中培養(yǎng)(180 r/min,30℃),24h后測其NO-N和TN的去除效率,并選取NO-N去除效率在90%以上且總氮去除效率在60%以上的菌株開展進(jìn)一步分析,共分離得到89株反硝化細(xì)菌,其中菌株ZS1脫氮性能最優(yōu),使用甘油法[19]將ZS1置于-80℃保存待用。

1.4 菌株的鑒定

從形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA三方面對菌株進(jìn)行鑒定。

掃描電鏡(SEM)觀察: 取菌液體1.5 mL在1000 r/min 條件下離心10min,使用3%的戊二醛溶液固定24h后,通過掃描電鏡(JSM-5800,Japan JEOL)拍攝觀察菌株形態(tài),在廣東省微生物分析檢測中心測定分析。

采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒(Omega,USA)提取菌株ZS1 的DNA,然后以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,選用細(xì)菌通用引物[20],上游引物為27F(5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′),下游引物為1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為: DNA模板1 μL,TaqDNA聚合酶25 μL,27F引物 (10 μmol/L) 1 μL,1492R引物 (10 μmol/L)1 μL,ddH2O(22 μL)。將PCR反應(yīng)體系充分混合均勻后,在PCR擴(kuò)增儀(Heal Force,T960,杭州)上進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸2min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸8min,4℃ forever。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 (約1400 bp) 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(EB染色) 確定條帶后,送至上海美吉生物公司進(jìn)行測序分析,將16S rDNA基因序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較,以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株ZS1好氧反硝化性能測定

將活化好的菌液按體積比1%接種到以KNO3為唯一氮源的反硝化培養(yǎng)基的錐形瓶中,培養(yǎng)基的初始pH為7.4,碳源為乙酸鈉,C/N為15,培養(yǎng)條件為溫度30℃,轉(zhuǎn)速180 r/min,設(shè)3組平行,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,每隔6h取樣監(jiān)測菌株的生長、TN、NO-N、NO-N等指標(biāo),分析菌株ZS1的反硝化性能。

1.6 不同環(huán)境因子對菌株ZS1的脫氮影響

向裝有100 mL已滅菌的反硝化培養(yǎng)基的三角瓶中接入菌株ZS1,研究不同溫度(20、25、30、35、40℃)、C/N值(5、10、15、20、25)、初始pH(6、7、8、9、10、11)、搖床轉(zhuǎn)速(0、50、100、150、200 r/min)和碳源種類(檸檬酸鈉、乙酸鈉、丁二酸鈉、蔗糖、葡萄糖)對菌株ZS1反硝化特性的影響。以上處理的基本條件為: 溫度30℃、初始pH 7.4、C/N為15、初始懸浮液NO-N含量為50 mg/L、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、碳源為乙酸鈉、KNO3為唯一氮源。然后將其中一種條件改變,其余反應(yīng)條件與基本條件相同,培養(yǎng)24h后,測定培養(yǎng)基中菌株ZS1的生長、NO-N、NO-N和TN的濃度,并計(jì)算NO-N和TN的去除率。

1.7 分析方法

在本研究中,NO-N的測定采用N-(1-萘基)乙二胺光度法,NO-N的測定采用麝香草酚分光光度法,TN的測定采用堿性過硫酸鉀氧化紫外分光光度法,菌株的生長采用光度比濁法,用紫外可見分光光度計(jì)于600 nm處測量吸光度值(TU-1810,北京通用),pH采用pH計(jì)(pHB-3,上海)測定,所有樣品均測定3次,取平均值。脫氮率計(jì)算方法[21]如下:

式中,Q為氮的去除率,ct為終末氮濃度(mg/L),c0為初始氮濃度(mg/L),V為氮的去除速率[mg/(L·h)],t為時(shí)間。

本研究采用Excel、MEGA7.0和Origin8.5軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株的鑒定

形態(tài)特征菌株ZS1革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性,生理生化特性如表1所示: 接觸酶、氧化酶反應(yīng)陽性;硝酸鹽還原和檸檬酸鹽利用陽性;七葉苷水解和明膠液化陽性;吲哚反應(yīng)、V-P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、酪素水解、脲酶、ONPG試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶均為陰性。在基礎(chǔ)富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后,觀察到菌株ZS1的菌落形態(tài)特征為: 圓形,呈灰白色,凸起,邊緣整齊。經(jīng)掃描電鏡觀察,結(jié)果如圖1所示,菌體呈桿狀,長1.5—2.0 μm,寬0.7—0.9 μm,有鞭毛。

16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析菌株ZS1的16S rDNA基因序列長度為1333 bp,測序結(jié)果已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫,登錄號為MK615112。系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示,菌株ZS1與Pseudomonas furukawaii同源性達(dá)100%。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析結(jié)果,將菌株ZS1確定為Pseudomonas furukawaii。

2.2 菌株ZS1的好氧反硝化特性

在以KNO3為唯一氮源的情況下,觀察菌株ZS1在48h內(nèi)的生長情況及好氧反硝化特性。如圖3所示,在6—18h,可以觀察到菌株ZS1的A600顯著增加,從0.133增加到0.930;培養(yǎng)18h后菌體生長變緩,在18—24h生長處于穩(wěn)定期;培養(yǎng)24h后,菌體密度呈現(xiàn)減小趨勢,進(jìn)入衰亡期。在0—24h階段,NO-N濃度迅速下降,從48.93 mg/L降至7.32 mg/L,NO-N去除率為85.04%,去除速率達(dá)1.734 mg/(L·h);TN的含量從52.04 mg/L 降低到13.73 mg/L,去除率為73.62%,去除速率達(dá)1.596 mg/(L·h)。24h后,菌株進(jìn)入衰亡期,A600開始下降,NO-N和TN濃度也趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)至48h時(shí),NO-N的含量降低到1.27 mg/L,去除率達(dá)到97.40%,去除速率為0.993 mg/(L·h);TN的含量繼續(xù)降低到8.40 mg/L,去除率達(dá)83.86%,去除速率達(dá)0.909 mg/(L·h),且無NO-N積累。

表 1 菌株ZS1的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain ZS1

2.3 不同環(huán)境因子對菌株ZS1反硝化性能的影響

不同碳源對菌株ZS1反硝化特性的影響如圖4所示,不同碳源對菌株ZS1的生長及脫氮率的影響存在很大差異。在5種不同碳源下,菌株的A600均顯著增多,由高到低的順序?yàn)橐宜徕c(0.930)、檸檬酸鈉(0.878)、葡萄糖(0.777)、丁二酸鈉(0.623)和蔗糖(0.013)。當(dāng)菌株ZS1分別以5種碳源為唯一碳源時(shí),對-N的去除率從高到低依次為乙酸鈉(99.47%)、檸檬酸鈉(99.39%)、葡萄糖(95.13%)、丁二酸鈉(75.49%)和蔗糖(26.20%);對TN的去除率從高到底依次為乙酸鈉(88.52%)、檸檬酸鈉(88.31%)、葡萄糖(78.12%)、丁二酸鈉(55.05%)和蔗糖(3.22%)。菌體生長情況與N和TN的去除率具有一致性,密度越大,對-N和TN的去除率就越高。當(dāng)以蔗糖為碳源時(shí),菌株ZS1幾乎不能生長,TN去除率僅為3.22%。因此,在實(shí)際池塘養(yǎng)殖尾水生物脫氮處理中可以將乙酸鈉、檸檬酸鈉和葡萄糖作為菌株ZS1的最適碳源。

圖1 掃描電鏡下菌株ZS1的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain ZS1 under a scanning electron microscope

圖2 基于16S rDNA分析的菌株ZS1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZS1 based on 16S rDNA analysis

不同C/N對菌株ZS1反硝化特性的影響如圖5所示,菌株ZS1的A600隨著C/N的增加而升高。當(dāng)C/N為5時(shí),TN和NO-N去除率均達(dá)最低值,分別為19.74%和51.28%,NO-N積累達(dá)最高值,為0.11 mg/L;當(dāng)C/N從5上升至15時(shí),TN和NO-N去除率同步上升達(dá)到最高值,分別為88.31%和99.39%;當(dāng)C/N從15上升至25時(shí),TN和NO-N去除率基本保持不變。因此,菌株ZS1發(fā)揮反硝化功能的最適C/N為15—25。

不同pH對菌株ZS1反硝化特性的影響如圖6所示,當(dāng)培養(yǎng)基的pH為6和11時(shí),嚴(yán)重抑制菌株ZS1的生長,A600值僅為0.003和0.001,同時(shí)其TN和NO-N的去除率也均最低,分別為6.43%和10.16%。當(dāng)pH在7—10時(shí),菌株ZS1生長良好,A600在0.734—0.773,其對NO-N和TN的去除率較高,NO-N的去除率在99.34%—99.59%,TN的去除率在60.735%—73.77%。因此,菌株ZS1發(fā)揮反硝化功能的最適pH為7.0—10.0。

不同溫度對菌株ZS1反硝化特性的影響如圖7所示,當(dāng)溫度為20℃時(shí),菌株ZS1的A600為0.048,幾乎停滯生長。當(dāng)溫度上升到25℃時(shí),NO-N和TN去除率分別為98.42%和71.98%。當(dāng)溫度為30℃時(shí),NO-N和TN去除率達(dá)到最高,分別為99.18%和77.99%。當(dāng)溫度繼續(xù)上升到40℃時(shí),菌株的生長和

不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株ZS1反硝化特性的影響培養(yǎng)基中的溶解氧濃度是通過改變搖床轉(zhuǎn)速來進(jìn)行調(diào)控。如圖8所示,隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高,菌株的去氮能力逐漸加強(qiáng)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為50 r/min時(shí),NO-N和TN去除效率極低,分別僅有9.19%和5.03%;當(dāng)轉(zhuǎn)速上升至100 r/min時(shí),NO-N和TN的去除率顯著上升,分別達(dá)93.33%和78.72%;當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)上升至150 r/min時(shí),NO-N和TN的去除率達(dá)最高值,分別為99.35%和83.09%;轉(zhuǎn)速升高到200 r/min時(shí),NO-N和TN的去除率保持穩(wěn)定。因此,菌株ZS1發(fā)揮反硝化功能的最適搖床轉(zhuǎn)速為100—200 r/min。

圖3 菌株ZS1好氧反硝化特征及生長曲線Fig.3 Aerobic denitrification performance and growth curve of the strain ZS1

圖4 碳源對菌株ZS1反硝化性能的影響Fig.4 Effect of the carbon source on the denitrification ability of strain ZS1

圖5 C/N對菌株ZS1反硝化性能的影響Fig.5 Effect of the C/N ratio on the denitrification ability of strain ZS1

圖6 pH對菌株ZS1反硝化性能的影響Fig.6 Effect of pH on the denitrification ability of strain ZS1

圖7 溫度對菌株ZS1反硝化性能的影響Fig.7 Effect of temperature on the denitrification ability of strain ZS1

圖8 轉(zhuǎn)速對菌株ZS1反硝化性能的影響Fig.8 Effect of rotation speed on the denitrification ability of strain ZS1

3 討論

3.1 不同碳源對菌株ZS1脫氮性能的影響

有機(jī)碳源在菌株的反硝化過程中提供電子和能量,不同碳源因其化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量的差異而對菌株的生長和脫氮效果產(chǎn)生不同的影響[21]。在本研究中,當(dāng)菌株ZS1以乙酸鈉、檸檬酸鈉和葡萄糖為碳源時(shí),菌株生長良好,具有高效的脫氮性能,其NO-N的去除率分別為99.47%、99.39%和95.13%,TN的去除率分別為88.52%、88.31%和78.12%,菌株ZSI基本不能利用蔗糖，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與修海峰等[8]、張婷月等[22]和蔡茜等[23]研究結(jié)果一致。顏薇芝等[9]發(fā)現(xiàn)不動桿菌YN3以葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí),菌株基本不增長,檸檬酸鈉是其最佳碳源,氨氮去除率達(dá)到99%。這說明相對于糖類,菌株更高效利用有機(jī)酸,是因?yàn)橛袡C(jī)酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,能被細(xì)菌直接利用,而糖類需要先轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸再被利用。同時(shí)有機(jī)酸還能增強(qiáng)周質(zhì)硝酸還原酶的活性[24]。反硝化反應(yīng)屬于氧化還原反應(yīng),不同碳源對菌株的脫氮性能產(chǎn)生差異,也可能與不同碳源的氧化還原電位有關(guān)[25]。

3.2 不同C/N對菌株ZS1脫氮性能的影響

C/N是菌株能否進(jìn)行完全反硝化的關(guān)鍵因素,直接影響細(xì)菌的生長和對有機(jī)物質(zhì)的去除效果[23]。大多數(shù)研究結(jié)果表明,細(xì)菌的脫氮效率會隨著C/N的增大而升高,達(dá)到一定值后,脫氮效率維持穩(wěn)定,繼續(xù)增大C/N,脫氮效率反而會呈下降趨勢[26—28]。趙丹等[29]發(fā)現(xiàn)假單胞菌ZD8在好氧條件下,C/N在4—22時(shí),NO-N的去除率隨著C/N增加而增強(qiáng),當(dāng)C/N為22時(shí),其NO-N去除率達(dá)到最高,為99.2%,

3.3 不同pH對菌株ZS1脫氮性能的影響

培養(yǎng)基的pH通過影響微生物細(xì)胞膜上的電荷,從而決定微生物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移方式,進(jìn)而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)化[32]。pH過高或過低都會導(dǎo)致微生物酶的活性降低或喪失,從而降低菌體的反硝化活性[33]。菌株只有在最適pH下才具有快速生長和高效脫氮的能力[34]。在本實(shí)驗(yàn)中,pH為7—10時(shí),菌株ZS1的脫氮性能最佳,NO-N和TN的去除率分別在99.34%—99.59%和60.73%—73.77%。目前已報(bào)道的好氧反硝化細(xì)菌中大部分菌株的最適pH為中性或偏堿性,如張淑楠等[35]從地?zé)崴蟹蛛x出的一株芽孢桿菌,生長和高效反硝化作用的適宜pH為7—8。黃廷林等[36]篩選出的貧營養(yǎng)菌株A14在pH為7時(shí),對NO-N的去除效果最佳。高喜燕等[37]研究發(fā)現(xiàn)菌株在 pH為7.5時(shí)的脫氮率最高,但在過酸(pH＜5.5) 或過堿(pH＞9) 的條件下,菌株幾乎不生長,脫氮性能也最低。

3.4 不同溫度對菌株ZS1脫氮性能的影響

溫度是影響細(xì)菌反硝化性能的重要因素之一,主要是通過影響微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而影響其生長和新陳代謝[38]。許多研究證明,好氧反硝化細(xì)菌的最適溫度為20—35℃,如Ye等[39]報(bào)道了菌株P(guān)rovidencia rettgeri strainYL的最適脫氮溫度為25℃;修海峰等[8]報(bào)道德克斯氏菌株DF2的最適脫氮溫度為30℃;菌株P(guān)seudomonas stutzeriF1在溫度低于20℃和高于35℃時(shí),其生長和脫氮能力均受到抑制[40]。本實(shí)驗(yàn)中菌株ZS1發(fā)揮好氧反硝化性能的最適溫度為25—35℃,與上述報(bào)道一致。

3.5 不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株ZS1脫氮性能的影響

本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的溶解氧,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)速過低導(dǎo)致培養(yǎng)基中的溶氧偏低,抑制了菌株ZS1的生長和脫氮性能,當(dāng)轉(zhuǎn)速在100—200 r/min時(shí),菌株ZS1的生長和脫氮性能顯著增加。王田野等[28]發(fā)現(xiàn)不動桿菌SQ2脫氮性能最佳的轉(zhuǎn)速為180—220 r/min。易立等[26]報(bào)道蠟樣芽胞桿菌CZ1在轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí),其NO-N去除率達(dá)99.29%。菌株Acinetobacter calcoaceticusN7在轉(zhuǎn)速為230 r/min時(shí),TN去除率達(dá)到最大,為89.8%[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道一致,隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高,培養(yǎng)基中的液體形成渦流,延長了空氣的停留時(shí)間,加大了空氣接觸面積,使培養(yǎng)基中的溶解氧提高,滿足了菌株的生長代謝,提高了脫氮過程中相關(guān)酶的合成能力,導(dǎo)致菌株的脫氮性能增強(qiáng)。因此,在實(shí)際生物脫氮處理過程中,要控制適當(dāng)?shù)娜芙庋?以適合菌株的生長,從而提高菌株去氮的效率。

本研究中P. furukawaiiZS1具有高效的好氧反硝化性能,下一步需要深入開展該菌株在實(shí)際養(yǎng)殖水體中的應(yīng)用效果以及該菌株好氧反硝化的分子機(jī)制,為池塘養(yǎng)殖尾水處理應(yīng)用生物脫氮技術(shù)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)從中山市主養(yǎng)草魚池塘水體中分離篩選出1株具有高效好氧反硝化能力的菌株,經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,鑒定為Pseudomonas furukawaii,命名為P. furuka-waiiZS1。(2)經(jīng)48h培養(yǎng)后,NO-N的含量從48.93降至1.27 mg/L,去除率為97.40%,去除速率達(dá)0.993 mg/(L·h);TN的含量從52.04 mg/L 降低到8.40 mg/L,去除率為83.86%,去除速率達(dá)0.909 mg/(L·h),且無NO-N積累。以NO-N為唯一氮源時(shí),菌株ZS1實(shí)現(xiàn)最佳好氧反硝化性能的碳源為乙酸鈉、檸檬酸鈉和葡萄糖,溫度為25—35℃,pH為7.0—10.0,C/N為15—25,轉(zhuǎn)速為100—200 r/min。(3)在好氧條件下,P. furukawaiiZS1具有高效脫氮效率,該菌株為池塘養(yǎng)殖尾水生物脫氮處理提供初步的候選菌株。