黃顙魚擬態(tài)弧菌的鑒定、毒力相關(guān)因子及藥敏特性

藺凌云 馮東岳 潘曉藝* 姚嘉赟 尹文林 曹 錚 劉憶瀚 夏焱春 沈錦玉*

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖州 313001;2.全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,北京 100125)

潰瘍病是一種常見的魚類疾病,其顯著特征是魚體頭部、中部或背部出現(xiàn)嚴(yán)重的開放性皮膚潰瘍。已報(bào)道的可引起魚類潰瘍病的病原種類繁多,包括鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)、非典型殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、維氏氣單胞菌溫和亞種(A. veronii biovar sobria)、海洋屈撓桿菌(Flexibacter maritimus)等[1,2],此外彈狀病毒(Rhabdoviruses)、雙RNA病毒(Birnaviruses)及絲囊霉菌(Aphanomyces invadans)等亦有報(bào)道[3,4]。雖然這些病原均可導(dǎo)致魚體的潰瘍癥狀,但潰瘍的發(fā)病率、形成部位、特征及流行特點(diǎn)等存在較大差異。黃顙魚(Yellow catfish,Pelteobagrus fulvidraco)是我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)一種重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。2011年,黃顙魚潰瘍病首先暴發(fā)于廣東和廣西兩省,隨后在四川、湖北、浙江、湖南、江西等多地發(fā)生或流行,發(fā)病魚的死亡率為70%—100%。已報(bào)道的黃顙魚潰瘍病病原有擬態(tài)弧菌(V. miminus)、溫和氣單胞菌(A. sobria)和維氏氣單胞菌(A. veronii)[5—7]。2018年,黃顙魚潰瘍病在浙江省大面積暴發(fā)流行,發(fā)病時(shí)間自5月至10月,造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失,目前該病已成為黃顙魚養(yǎng)殖的最大威脅。病魚體表呈現(xiàn)規(guī)則形潰瘍,與Zhang等[5]報(bào)道的擬態(tài)弧菌感染黃顙魚引發(fā)的潰瘍癥狀極為相似。鑒于黃顙魚潰瘍病病原的多樣性,為驗(yàn)證本區(qū)域黃顙魚潰瘍病的病原是否為擬態(tài)弧菌,并分析該病的病原特點(diǎn),本文對(duì)浙江省黃顙魚主養(yǎng)區(qū)的多個(gè)典型發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行潰瘍病病原菌的分離鑒定,并對(duì)病菌的致病性、毒力因子、毒力相關(guān)基因及藥物敏感性等進(jìn)行了研究。旨為黃顙魚潰瘍病的防治及擬態(tài)弧菌致病因子或致病機(jī)理的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

患病黃顙魚采自浙江省湖州市多家發(fā)病典型的黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng),采樣時(shí)間2018年5—9月,病魚體表呈現(xiàn)規(guī)則形潰瘍,病變部位通常為方形,方形邊緣有紅色的出血帶(圖1)。革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定板購(gòu)自BD公司。BHI培養(yǎng)基、TCBS培養(yǎng)基、DNA營(yíng)養(yǎng)瓊脂、明膠培養(yǎng)基、卵磷脂瓊脂基礎(chǔ)、50%卵黃液購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。脫脂奶、脫纖維兔血、血瓊脂基礎(chǔ)等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州濱河微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑等購(gòu)自寶生物(大連)有限公司?；前粪奏?、磺胺甲噁唑等14種原料藥購(gòu)自國(guó)邦醫(yī)藥化工集團(tuán)有限公司。用于攻毒試驗(yàn)的雜交黃顙魚(黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂),購(gòu)自德清某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng),體重80—100 g?？莶菅挎邨U菌B115為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存菌株[8]。

圖1 發(fā)病黃顙魚的臨床癥狀Fig.1 The clinical signs of diseased yellow catfish

1.2 菌株的分離與純化

患病黃顙魚體表用酒精棉消毒,在無(wú)菌條件下,分別取肝、脾、腎和潰瘍病變等處的組織于BHI平板進(jìn)行劃線分離。平板放置28℃培養(yǎng)箱1—2d后,挑取優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),在多次純化后,對(duì)獲得的菌株進(jìn)行保藏。各菌株的來(lái)源地、采樣時(shí)間等信息詳見表1。

表 1 患病黃顙魚中分離菌株的信息Tab.1 The information of the pathogens isolated from diseased yellow catfish

1.3 菌株的鑒定

菌株生理生化鑒定及培養(yǎng)特性觀察將分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色,分別應(yīng)用BD PhoenixTM100全自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)和細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行鑒定。菌株分別在BHI及TCBS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),觀察菌落形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

分子鑒定過(guò)夜培養(yǎng)(16—18h)的新鮮菌液,使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提DNA。采用PCR方法分別擴(kuò)增16S rRNA和pyrH基因,引物序列及目的片段大小等見表2。16S rRNA及pyrH的PCR反應(yīng)體系: 2×premixTaq25 μL,上下游引物(濃度為10 μmol/L)各2 μL,DNA模板1 μL(20—100 ng),ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃ 5min;94℃變性30s,退火溫度見表2,30s,72℃延伸(16S rRNA 100s,pyrH60s);35個(gè)循環(huán)后72℃溫育10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增目的條帶。PCR 產(chǎn)物純化后交由杭州尚亞生物公司進(jìn)行測(cè)序。分別將測(cè)序獲得的16S rRNA和pyrH基因序列與GenBank中已知核酸序列進(jìn)行同源比對(duì),使用MEGA X軟件對(duì)從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的序列相似性較高的菌株序列進(jìn)行多序列比對(duì),采用最大似然法(Maximum Likelihood method)的Jukes-Cantor 模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,并通過(guò)Boot-strap法(1000次重復(fù))檢驗(yàn)。

1.4 人工感染試驗(yàn)

健康雜交黃顙魚在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)1周,隨機(jī)分為9組,每組20尾。選取生理生化特性差異明顯的2株代表菌Hsy0531-K和Hsy0820-Sk以腹腔注射方式進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。攻毒菌株接種于BHI培養(yǎng)基,28℃恒溫振蕩(180 r/min)培養(yǎng)24h,平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度。無(wú)菌PBS制備成1.25×108、1.25×107、1.25×106和1.25×105CFU/mL的菌懸液。腹腔注射攻毒組,每尾注射0.2 mL菌液,空白對(duì)照組腹腔注射0.2 mL PBS。每天記錄發(fā)病及死亡情況,連續(xù)觀察14d,根據(jù)Reed-Muench方法[11]計(jì)算攻毒菌株的LD50。對(duì)感染發(fā)病黃顙魚進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定。

表 2 本研究所用引物Tab.2 Primers used in this study

1.5 菌株毒力相關(guān)因子的檢測(cè)

溶血活性及胞外酶活性檢測(cè)將菌株接種血瓊脂(含5%脫纖維兔血)平板中,28℃培養(yǎng)24h,出現(xiàn)溶血圈則判斷其具有溶血活性。分離菌的胞外蛋白酶(5%脫脂乳的營(yíng)養(yǎng)瓊脂)、卵磷脂酶(5%卵黃瓊脂)及DNA酶活性(0.2% DNA營(yíng)養(yǎng)瓊脂)采用平板檢測(cè)法;明膠酶活性采用試管液化法檢測(cè)。將菌株點(diǎn)種于培養(yǎng)基平板中,28℃恒溫培養(yǎng)24—72h,以生理鹽水為陰性對(duì)照。蛋白酶: 以菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明水解圈為陽(yáng)性。卵磷脂酶: 在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán),即為陽(yáng)性。DNA酶: 用1 mol/L鹽酸覆蓋平板,5min后觀察結(jié)果,在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽(yáng)性。明膠酶: 菌株穿刺接種明膠培養(yǎng)基試管,于28℃恒溫培養(yǎng)48h后,置于4℃冰箱30min后觀察,如仍為液態(tài),即為陽(yáng)性。

鐵載體鐵載體檢測(cè)采用通用CAS瓊脂平板法[12]。CAS檢測(cè)培養(yǎng)基及MKB無(wú)鐵培養(yǎng)基的配置參考文獻(xiàn)[12,13],試驗(yàn)中用到的器皿需進(jìn)行脫鐵處理。分離菌株接種液體MKB無(wú)鐵培養(yǎng)基,28℃,180 r/mim振蕩培養(yǎng)3d,進(jìn)行鐵饑餓處理。菌液離心并用無(wú)菌生理鹽水洗2次,取10 μL菌懸液接種于CAS檢測(cè)平板,28℃培養(yǎng)2d,觀察平板的顏色變化。以菌落周圍產(chǎn)生鐵載體螯合暈圈為陽(yáng)性。陰性對(duì)照組為按同樣方法處理的枯草芽孢桿菌B115。

毒力相關(guān)基因檢測(cè)PCR擴(kuò)增毒力相關(guān)基因:ctxA(cholera toxin enzymatic subunit A,霍亂毒素酶亞基A)、zot(zonula occludens toxin,帶毒素)、ace(accessory cholera enterotoxin,副霍亂毒素)、tcpA(toxin-coregulated pilus,毒素共調(diào)菌毛)、ompU(outer membrane protein U,外膜蛋白U)、toxR(central regulatory protein,中央調(diào)控蛋白)、vmh(V.mimicushemolysin,擬態(tài)弧菌不耐熱溶血素)、st(heat-stable enterotoxin,耐熱腸毒素)、tdh(thermostable direct hemolysin,耐熱直接溶血素),matCDBiucABCD-iutA(aerobactin transport and biosynthesis genes,鐵載體運(yùn)輸及合成基因簇)。其引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同上文分子鑒定,各基因的退火溫度及延伸時(shí)間參見表2。PCR產(chǎn)物采用1.0%—1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并對(duì)目的條帶進(jìn)行測(cè)序分析。

1.6 藥物敏感性試驗(yàn)

測(cè)試抗菌藥物包括7大類14種,磺胺類4種[磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)],喹諾酮類2種[環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)],四環(huán)素類2種[強(qiáng)力霉素(DC)、土霉素(OXY)],β內(nèi)酰胺類1種[氨芐西林(AMP)],大環(huán)內(nèi)酯類2種[紅霉素(E)、交沙霉素(JOS)],氯霉素類2種[甲砜霉素(THA)、氟苯尼考(FFC)],氨基糖胺類1種[新霉素(NEO)]。采用微量二倍稀釋法測(cè)定上述藥物對(duì)11株擬態(tài)弧菌的最小抑菌濃度(MIC)。各藥物的溶解、稀釋、質(zhì)控范圍參照CLSI動(dòng)物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片法與稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[18],并依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)推薦的MIC折點(diǎn)報(bào)告敏感、中介和耐藥,對(duì)部分缺乏判定標(biāo)準(zhǔn)的藥物其濃度折點(diǎn)值參考人源的解釋標(biāo)準(zhǔn)[19]。多重耐藥(Multiple antibiotic resistance,MAR)系數(shù)以菌株耐受抗菌藥物總數(shù)與受試抗菌藥物總數(shù)的比值表示[20]。使用SPSS 16.0軟件計(jì)算分離菌株對(duì)14種抗菌藥物的半數(shù)最低抑菌濃度(MIC50)。

表 3 分離菌株的生理生化特性Tab.3 Biochemical and physiological characteristics of theisolated strains from diseased yellow catfish

2 結(jié)果

2.1 菌株的表型特征及生理生化鑒定

從患病黃顙魚體表潰瘍病變部位及內(nèi)臟組織中均分離到了大量菌落特征一致的優(yōu)勢(shì)菌。優(yōu)勢(shì)菌株在BHI平板上,形成表面光滑、濕潤(rùn)、微隆起、邊緣整齊的淺黃色圓形菌落;在TCBS平板上形成表面光滑,邊緣整齊的綠色圓形菌落。革蘭氏染色為陰性,BD PhoenixTM100全自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)的生化報(bào)告結(jié)果見表3: 各菌株的生化特征基本相似,部分生化指標(biāo)存在差異性,如底物甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、賴氨酸-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素等的生化反應(yīng),這些差異指標(biāo)為生化鑒定的常規(guī)項(xiàng)目,其與菌株毒力的相關(guān)性未見報(bào)道,儀器鑒定結(jié)果顯示各菌株與擬態(tài)弧菌及霍亂弧菌的相似度最高,可信度值均在90%以上。采用細(xì)菌微量生化鑒定管進(jìn)一步區(qū)分,各分離菌株V-P試驗(yàn)、脂酶(玉米油)、酒石酸鹽等生化反應(yīng)均為陰性,這些結(jié)果與擬態(tài)弧菌的理化特性一致。

續(xù)表 3

2.2 16S rRNA和pyrH基因序列同源性分析

將分離菌株16S rRNA 基因序列通過(guò)NCBI的Blastn檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果顯示11株分離菌與V. miminus及V. cholerae的同源性最高。在基于分離菌及其他弧菌屬菌株16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖2),各菌株與V. miminus聚為一支,同時(shí)與V. cholerae的同源關(guān)系也非常接近。在以pyrH基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖3),各菌株與V. miminus聚為一支,而各V. cholerae則聚為另外一支。綜合分離菌株的表型特征、理化特性及16S rRNA和pyrH基因序列同源性分析,判定11株分離菌均為擬態(tài)弧菌。

圖2 分離菌16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strains from diseased yellow catfish based on the sequences of the 16S rRNA genes

2.3 菌株對(duì)黃顙魚的致病性

使用菌株Hsy0531-K和Hsy0820-Sk腹腔注射感染健康黃顙魚,攻毒后1d,高濃度組開始死亡,但體表的潰瘍癥狀尚未顯現(xiàn),攻毒后第2天,黃顙魚體表出現(xiàn)褪色斑,3—7d 表現(xiàn)出明顯的潰瘍癥狀,為發(fā)病及死亡的高峰期,各濃度組的累計(jì)死亡情況見表4,對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)未出現(xiàn)典型的潰瘍癥狀及死亡現(xiàn)象。其中,菌株Hsy0531-K的LD50為6.28×105CFU/尾,菌株Hsy0820-Sk的LD50為1.05×106CFU/尾。取感染發(fā)病的黃顙魚進(jìn)行細(xì)菌分離,再分離的細(xì)菌經(jīng)菌落形態(tài)、生化特征及16S rRNA、pyrH基因序列分析,確定為擬態(tài)弧菌。

2.4 毒力相關(guān)因子

溶血活性及胞外酶活性11株擬態(tài)弧菌在5%脫纖維兔血平板上培養(yǎng)24h后,菌落周圍均出現(xiàn)了溶血圈,呈β溶血(圖4a);在5%脫脂奶的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)24h后,菌落周圍均出現(xiàn)清晰透明的水解圈(圖4b);在DNA營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)24h后,1 mol/L鹽酸覆蓋平板5min,菌落周圍均出現(xiàn)明顯的透明環(huán)(圖4c);在明膠培養(yǎng)基試管中培養(yǎng)48h,4℃冰箱放置30min后取出,培養(yǎng)基仍為液體狀態(tài)(圖4d);在5%卵黃瓊脂平板上培養(yǎng)72h,菌落周圍未出現(xiàn)渾濁帶。上述試驗(yàn)結(jié)果表明: 分離菌株具有溶血活性、酪蛋白酶、明膠酶和DNase活性,但不具有卵磷脂酶活性。

鐵載體檢測(cè)11株擬態(tài)弧菌及枯草芽孢桿菌B115在CAS檢測(cè)平板上培養(yǎng)2d后,試驗(yàn)菌株周圍均出現(xiàn)明顯的鐵載體暈圈(圖4e),而接種枯草芽孢桿菌的陰性對(duì)照,菌落周圍沒(méi)有產(chǎn)生鐵載體暈圈(圖4e)。

毒力相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增通過(guò)PCR擴(kuò)增,11株擬態(tài)弧菌均擴(kuò)增到了外膜蛋白U基因ompU、中央調(diào)控蛋白基因toxR和不耐熱溶血素基因vmh及鐵載體運(yùn)輸及合成基因簇matCDB-iucABCD-iutA的目的片段,片段大小分別為869、779、390、3300、3300及2900 bp。對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性的條帶進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),各菌株ompU、toxR和vmh與Gen-Bank上登錄擬態(tài)弧菌(ATCC33653)的ompU、toxR和vmh基因序列的同源性分別為98.00%、99.12%、98.73%。而其他毒力相關(guān)基因tcpA、ctxA、st、zot、ace、tdh均未擴(kuò)增到目的條帶。

圖3 分離菌pyrH基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree isolated strains from diseased yellow catfish based on the sequences of the pyrH genes

2.5 藥物敏感性

如表5所示,磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶的耐藥率最高,為100%,其MIC50＞512 mg/L。其次是氨芐青霉素,耐藥率達(dá)90.9%,MIC50為128 mg/L。菌株對(duì)喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及氯霉素類等4類抗菌藥物的敏感性較強(qiáng)。其中,恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、土霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、交沙霉素、紅霉素的敏感率為100%,甲砜霉素和新霉素的敏感率分別均為90.9%和81.8%。這8種高敏感抗生素(敏感率＞90%)的MIC50(表5),以恩諾沙星最低,其MIC50≤0.125 mg/L。其余依次為強(qiáng)力霉素、交沙霉素、紅霉素,MIC50均為0.25 mg/L,土霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考,MIC50均為0.5 mg/L,甲砜霉素略高,其MIC50為2.0 mg/L?；前范籽踵奏な?種磺胺類藥物中,唯一一種對(duì)擬態(tài)弧菌生長(zhǎng)抑制有效的藥物,其敏感率90.9%,MIC50≤128 mg/L。表6為菌株的耐藥譜型及多重耐藥系數(shù),11株擬態(tài)弧菌均表現(xiàn)為多重耐藥,多重耐藥系數(shù)0.29—0.45。優(yōu)勢(shì)耐藥譜型為SD-SMZ-SMM-AMP,占81.8%。其余耐藥譜型SD-SMZ-SMM-AMP-NEO、SD-SMZ-SMM-THA-NEO,各占9.1%。

3 討論

3.1 黃顙魚潰瘍病病原的鑒定分析

全雄黃顙魚和雜交黃顙魚是浙江省養(yǎng)殖黃顙魚的主要品種,2018年黃顙魚潰瘍病暴發(fā)嚴(yán)重,流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),雜交黃顙魚的發(fā)病率高于全雄黃顙魚。目前,潰瘍病已成為危及黃顙魚健康養(yǎng)殖的主要病害,但對(duì)其病原的報(bào)道眾說(shuō)紛紜。本研究從11個(gè)發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)采集的樣本中,共分離到了50株細(xì)菌,經(jīng)鑒定擬態(tài)弧菌42株,類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)4株,維氏氣單胞菌2株,溫和氣單胞菌2株(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。綜合優(yōu)勢(shì)菌的比例和回感試驗(yàn)結(jié)果,可驗(yàn)證擬態(tài)弧菌即為本區(qū)域黃顙魚潰瘍病的主要病原。同時(shí),氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的常見條件致病菌[23—25],發(fā)病黃顙魚的混合感染常有發(fā)生。在研究過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)擬態(tài)弧菌分離菌株用BD PhoenixTM100全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化分析,鑒定結(jié)果同擬態(tài)弧菌及霍亂弧菌的相似性都很高,雖然擬態(tài)弧菌的可信度值稍高于霍亂弧菌,但兩者非常接近。這可能是該儀器配套的革蘭氏陰性菌鑒定板的檢測(cè)指標(biāo)不能有效區(qū)分生化特性比較接近的物種。16S rRNA和pyrH基因的分子鑒定表明,基于16S rRNA基因的序列同源性檢索及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,仍不能將檢索出的擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌明顯區(qū)別開,有研究發(fā)現(xiàn)擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌的16S rRNA基因的序列同源性接近100%[26];而基于pyrH基因的序列同源性檢索及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,可以將擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌區(qū)別開來(lái)。Thompson等[27]的研究表明,pyrH基因序列的種間相似性不超過(guò)91%,而種內(nèi)相似性高于95%,對(duì)于區(qū)分這兩種相近弧菌的分辨力最強(qiáng)。Zago等[28]的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

表 5 黃顙魚源擬態(tài)弧菌藥物敏感性及MIC50Tab.5 MIC50 results and antibiotics susceptibility of Vibrio mimicus isolates from diseased yellow catfish

表 6 黃顙魚源擬態(tài)弧菌的多重耐藥譜Tab.6 Multiple antibiotic resistance profile of Vibrio mimicus isolates from diseased yellow catfish

3.2 擬態(tài)弧菌的毒力相關(guān)因子及毒力基因流行分析

溶血素是擬態(tài)弧菌的重要毒力因子,它通過(guò)破壞紅細(xì)胞膜和提高腸上皮細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度而表現(xiàn)出溶血性和腸毒性[29]。擬態(tài)弧菌的溶血素有耐熱溶血素和不耐熱溶血素兩種,其中由vmh基因編碼的不耐熱溶血素(VMH)最為常見,Shinoda等[30]和Bi等[31]的檢測(cè)結(jié)果表明,vmh基因存在于所有擬態(tài)弧菌的臨床及環(huán)境分離株中。本研究的11株擬態(tài)弧菌均擴(kuò)增到了vmh基因,血平板上亦表現(xiàn)出了明顯的溶血活性,但耐熱溶血素基因tdh并未檢測(cè)到。有研究發(fā)現(xiàn)[15,30],擬態(tài)弧菌耐熱溶血素(TDH)主要存在于臨床分離株中,而非環(huán)境分離株。鐵載體是細(xì)菌為克服宿主環(huán)境的鐵限制而產(chǎn)生的一種有機(jī)化合物,它能吸收和螯合微量鐵元素。鐵的攝取和利用對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和毒性具有重要作用。擬態(tài)弧菌的鐵載體(Aerobactin)為異羥肟酸型,霍亂弧菌的主要鐵載體(Vibriobactin)為鄰苯二酚型,鐵載體的不同亦是鑒別兩種弧菌的標(biāo)志特征[32]。Alam等[33]對(duì)77株擬態(tài)弧菌進(jìn)行研究,其中84%菌株可以產(chǎn)生鐵載體。本研究中的11株擬態(tài)弧菌均檢測(cè)到了鐵載體表型(圖4e)和鐵載體(Aerobactin)運(yùn)輸及合成相關(guān)基因簇(matCDB-iucABCD-iutA)。2018年浙江暴發(fā)的黃顙魚潰瘍病,在潰瘍病變的邊緣肌肉呈鮮紅色,似出血癥狀,但質(zhì)地正常(未潰爛,圖1)。我們推測(cè),這與擬態(tài)弧菌產(chǎn)生的溶血素有關(guān)。溶血素促使血液中的血紅蛋白增加,鐵載體奪取血紅蛋白中的鐵元素,兩種毒力因子協(xié)同增效,使得宿主體內(nèi)的鐵被不斷消耗,菌株得以迅速大量增殖。

此外,各種胞外酶活性也是弧菌毒力的重要因素。胞外蛋白酶是一類廣泛存在的酶,在細(xì)菌致病性、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞活力等方面發(fā)揮著重要作用[34]。明膠酶是一種潛在的毒性因子,它缺乏明顯的底物特異性,可水解酪蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白等多肽[35],造成廣泛的組織損傷,并有助于細(xì)菌在高密度環(huán)境中的傳播。DNase可降解胞外DNA,不僅為細(xì)菌的增殖提供重要的物質(zhì)來(lái)源,也是病原通過(guò)組織傳播及免疫逃逸的重要手段。Beshiru等[36]對(duì)從即食蝦上分離的弧菌進(jìn)行了胞外毒力特性的研究,發(fā)現(xiàn)在擬態(tài)弧菌中,蛋白酶、明膠酶、DNase的陽(yáng)性率分別為90%、100%和100%。在本研究中11株擬態(tài)弧菌三種酶的陽(yáng)性均為100%。存在較大分歧的是,在Beshiru等[36]的研究中,擬態(tài)弧菌的脂酶陽(yáng)性率為100%,而本研究分別對(duì)脂酶(分別以玉米油、吐溫為底物)和卵磷脂酶(以卵黃液為底物)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果均為陰性。Davis等[22]對(duì)不同來(lái)源及血清型的51株擬態(tài)弧菌的生理生化進(jìn)行了系統(tǒng)研究,僅10%的擬態(tài)弧菌表現(xiàn)為脂酶(玉米油為底物)陽(yáng)性?？梢姅M態(tài)弧菌在脂酶活性這一表型特征上存在較大的差異性。

外膜蛋白(Outer membrane proteins,Omps)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu),與維持細(xì)胞形態(tài)、物質(zhì)代謝、組織黏附及致病等密切相關(guān)。王薇等[37]的研究證實(shí)了OmpU是擬態(tài)弧菌的一種重要黏附素,它通過(guò)黏附參與致病作用。toxR基因在弧菌科細(xì)菌中分布較廣,但在不同的弧菌中其調(diào)控機(jī)制不盡相同。在霍亂弧菌中,ToxR是毒力基因表達(dá)的主要調(diào)控蛋白[38],在創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌中,ToxR分別參與調(diào)控vvh(Vibrio vulnificushemolysin gene) 和tdh的表達(dá)[39,40]。ctxA、zot及ace基因是霍亂毒素的核心遺傳元件。研究發(fā)現(xiàn),霍亂弧菌流行株均為產(chǎn)霍亂毒素的菌株。毒素共調(diào)菌毛( TCP)是霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌等常見的黏附素之一,具有組織細(xì)胞黏附性和血凝性,tcpA是其主要結(jié)構(gòu)亞單位基因,與霍亂毒素(CTX)的表達(dá)協(xié)同進(jìn)行。由st編碼的耐熱腸毒素(ST)通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)外離子平衡,導(dǎo)致小腸內(nèi)腸液大量聚集而致病。本試驗(yàn)中11株擬態(tài)弧菌均擴(kuò)增出了ompU和toxR基因,而ctxA、zot、ace、st、tcpA均未擴(kuò)增到。韓帥等[41]對(duì)4株鲇源擬態(tài)弧菌的毒力基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示各菌株均攜帶ompU基因,而不具有ctxA、zot、ace、tcpA和toxR。Singh等[14]研究發(fā)現(xiàn),所有擬態(tài)弧菌均攜帶toxR基因,ctxA、zot、ace基因的攜帶比例均為1/11,tcpA和ompU均為2/11。Shinoda等[30]檢測(cè)了100株不同來(lái)源擬態(tài)弧菌的毒力基因,其中95%菌株有toxR基因,17%菌株存在st基因,ctxA和tcpA的攜帶率均為2%。已有的研究表明,上述毒力基因在擬態(tài)弧菌中均有發(fā)現(xiàn),但尚未發(fā)現(xiàn)某個(gè)或某些毒力基因可以作為其致病性的有效指標(biāo),不同來(lái)源菌株的毒力基因型復(fù)雜多變。

3.3 黃顙魚源擬態(tài)弧菌的耐藥性

MAR系數(shù)是由Krumperman[20]首次提出,主要是反映環(huán)境受抗生素的污染程度及評(píng)價(jià)其對(duì)人類健康的風(fēng)險(xiǎn),通常認(rèn)為,MAR系數(shù)＞0.2即表明產(chǎn)品受到較高程度的污染和對(duì)人類健康有較大的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,11株黃顙魚源擬態(tài)弧菌均表現(xiàn)為多重耐藥,其MAR系數(shù)(0.29—0.45)均超過(guò)了0.2,說(shuō)明這部分黃顙魚受到抗菌藥物污染的程度較嚴(yán)重,對(duì)人類健康具有潛在威脅。

本研究對(duì)此次黃顙魚流行性潰瘍病病原的分離鑒定及病原特性分析,將為我國(guó)黃顙魚潰瘍病的防控、正確合理用藥、疫苗研發(fā)以及流行病學(xué)等研究提供依據(jù)。未來(lái)仍需進(jìn)一步開展擬態(tài)弧菌的致病因子、耐藥基因及抗原基因的研究,開發(fā)高效疫苗,通過(guò)免疫防控減少抗生素的使用,以保證我國(guó)黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。此外,建立快速準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的早期診斷方法也是有效控制擬態(tài)弧菌感染的重要手段。