多鱗fih-1基因克隆及其低氧脅迫的mRNA表達

黃志棚 林星樺,2 王耀嶸,2,3 江東能,2,3 陳華譜,2,3 鄧思平,2,3 朱春華,2,3 李廣麗,2,3 黃 洋,2,3,* 田昌緒,2,3,*

(1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院,湛江 524088;2.廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心,湛江 524088;

3.廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實驗室,湛江 524088)

多鱗Sillago sihama(Forsk?l),又名沙錐魚,隸屬鱸形目、科,為熱帶印度至西太平洋淺海魚類,廣泛分布于我國沿海地區(qū),粵西地區(qū)產(chǎn)量豐富,但近年來由于過度捕撈,導致多鱗種群數(shù)量減少,產(chǎn)量降低[1]。該魚美味可口深受消費者喜愛,市場價格約60元/斤,具有較高的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值[2]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中,多鱗屬小型魚類,成品魚規(guī)格小,養(yǎng)殖管理過程簡單,養(yǎng)殖成活率高,經(jīng)濟效益較好,養(yǎng)殖前景十分廣闊[1]。目前杜濤等[3]已攻克了多鱗人工繁殖技術(shù)并對多鱗的人工養(yǎng)殖進行了初步試驗,研究發(fā)現(xiàn)多鱗與對蝦的混養(yǎng)模式具有較高的養(yǎng)殖效益,水體溶解氧過低是養(yǎng)殖過程中造成大規(guī)模死亡的主要原因。多鱗耐低氧能力差,對水體溶解氧含量變化敏感,在低氧環(huán)境下易出現(xiàn)浮頭現(xiàn)象。目前尚未能夠?qū)崿F(xiàn)工廠化高密度養(yǎng)殖,嚴重限制了其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展空間。

水體中溶解氧含量不足或缺氧,直接影響了魚類生長發(fā)育、繁殖及各種行為活動,進而導致嚴重的水產(chǎn)養(yǎng)殖問題[4—6]。低氧誘導因子抑制因子-1(factor inhibiting hypoxia inducible factor 1,fih-1)是魚類低氧信號通路中的關(guān)鍵因子,在魚類低氧轉(zhuǎn)錄響應中起重要作用。fih-1是由Mahon等[7]通過酵母雙雜交方法發(fā)現(xiàn)的一種與HIF相互作用的蛋白。人類fih-1基因定位于10號染色體(10q24),含有8個外顯子[8]。fih-1是一種天冬酰胺羥化酶,屬于2-氧化戊二酸依賴的二氧化物酶超家族,能夠使HIF-1α羧基端反式激活區(qū)(CTAD)的天冬酰胺殘基羥基化[9]。在低氧信號傳導途徑中fih-1在常氧條件下利用氧氣中的氧分子將HIF-1α的CTAD天冬酰胺殘基羥基化,阻礙HIF-1α與轉(zhuǎn)錄輔助因子(CBP/p300)結(jié)合,從而抑制其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。相反,在低氧條件下,fih-1對HIF-1α羥基化能力下降,HIF-1α能夠與轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合,從而促進下游靶基因轉(zhuǎn)錄[4,9,10]。目前在魚類中關(guān)于fih-1基因的研究也取得一定進展: Zhang等[10]完成了團頭魴(Megalobrama amblycephala)fih-1基因的克隆,并在該基因中發(fā)現(xiàn)3個與其低氧耐受性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點;李紅蓮[11]克隆了尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)fih-1α基因并對其抑制劑fih-1αn進行了功能分析;丁為群等[12]完成鰱(Hypophthalmichthys molitrix)低氧調(diào)控基因igfbp-1和igf-I的克隆及表達特征分析;Geng等[13]基于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)開展了斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)fih-1基因在低氧脅迫下的表達;Ju-Hoon等[14]對斑馬魚(Danio rerio) fih-1與Mib E3泛素連接酶相互作用機制進行了探討。

fih-1基因在低氧脅迫通路中發(fā)揮重要作用,但目前多鱗中fih-1基因尚未克隆,其機制特別是在低氧脅迫后的表達機制不清楚,因此本研究的開展將為多鱗低氧脅迫相關(guān)基因的研究和解析多鱗低氧脅迫分子機理建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

本實驗多鱗均為1齡性成熟魚[體重(30.0±5.0) g,體長(13.5±3.0) cm],來自廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地。

1.2 低氧脅迫處理實驗

1.3 樣品采集和保存

在實驗魚麻醉后解剖分離組織。對照組采集鰓、心臟、腦、肝臟、肌肉、精巢、卵巢等7個組織,其余三組采集鰓和心臟組織,采樣后立刻放入液氮速凍,后轉(zhuǎn)移到-80℃保存,用于后續(xù)實驗。

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成

本實驗采用Trizol法提取總RNA,使用瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)Tanon-1600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)檢驗RNA的完整性,使用Nanodrop 2000 超微量生物檢測儀測定RNA的濃度和質(zhì)量,最后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Bio)進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.5 fih-1基因cDNA全長的克隆

從多鱗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[2]中獲取fih-1基因序列,設(shè)計多鱗fih-1基因相關(guān)引物和β-actin基因引物(表1)。混合肝、肌肉、腦等組織cDNA作為模板,以fih1-Ss-orf-f引物作為正向引物,fih1-Ss-orf-r引物作為反向引物進行PCR擴增反應,程序設(shè)定為94℃預變性3min,94℃變性1min,58℃退火30s,72℃延伸1.5min,進行30個循環(huán),72℃延伸10min,4℃保存。PCR產(chǎn)物選取5 μL進行電泳(DYY-6C型電泳儀)檢測,將目的產(chǎn)物送上海生工公司測序。

表 1 引物名稱編號及其相應的序列Tab.1 Primer sequence

1.6 fih-1基因的生物信息學分析

運用DNAstar軟件(https://www.dnastar.com/)預測出基因的開放閱讀框(ORF)并翻譯成相應的氨基酸序列;運用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);運用Signal IP 4.1網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測基因前體蛋白的信號肽;通過Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)進行基因的三級結(jié)構(gòu)預測;使用DNAMAN 8軟件對基因氨基酸序列與其他脊椎動物的基因氨基酸序列進行多序列比對,利用MEGA 7.0軟件對氨基酸序列與其他脊椎動物的氨基酸序列進行鄰接聚類分析。

1.7 fih-1基因的組織表達

1.8 fih-1基因的組織表達熒光定量分析

本實驗采用實時熒光定量分析方法,對多鱗低氧脅迫處理前后鰓和心臟組織fih-1基因表達變化進行分析。在低氧脅迫實驗處理后,每組隨機選用3尾多鱗的鰓、心臟組織cDNA作為模板,以fih-1-RT-f引物作為正向引物,fih-1-RT-r引物作為反向引物,以β-actin基因作為內(nèi)參,使用實時熒光定量PCR儀(Roche,LightCycle?96)進行擴增反應,擴增循環(huán)程序為95℃變性10s,58℃退火15s,72℃延伸15s,進行40個循環(huán)。每個樣品做3個生物學重復,三個技術(shù)重復。熒光定量實驗數(shù)據(jù)使用2?ΔΔCt法計算相對表達量,用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,Duncan法對組間差異進行多重比較,用GraphPad Prism 7.0制作表達量直方圖。

2 結(jié)果

2.1 fih-1基因全長cDNA的克隆及特征分析

多鱗fih-1基因cDNA全長為1280 bp,ORF為1065 bp,可編碼353個氨基酸,其GenBank登錄號為MN013394。對cDNA序列進行分析,發(fā)現(xiàn)在第145個到第312個氨基酸包含一個JmjC 保守結(jié)構(gòu)域,fih-1蛋白無信號肽,其三級結(jié)構(gòu)模型是一個同二聚體。

2.2 fih-1基因的同源性以及系統(tǒng)進化分析

以多鱗fih-1基因氨基酸序列為基礎(chǔ),在NCBI中進行BLAST分析,得到尖吻鱸(Lates calcarifer)、大黃魚(Larimichthys crocea)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、武昌魚(Megalobrama amblycephala)、白斑狗魚(Esox lucius)、斑馬魚(Danio rerio)、原雞(Gallus gallus)、非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)、牛(Bos taurus)、智人(Homo sapiens)及小家鼠(Mus musculus)的氨基酸序列。使用DNAMAN 8軟件分析得到多鱗與尖吻鱸的同源性最高為94.66%,其次是大黃魚為92.13%;與哺乳動物智人同源性為80.34%,與兩棲類非洲爪蟾同源性為77.25%,與禽類原雞的同源性為78.93%。

系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示,系統(tǒng)進化樹主要分為2個大分支,魚類聚為一支,哺乳動物、鳥類、兩棲類等較高等的生物聚為另一支。其中多鱗與大黃魚和尖吻鱸的親緣關(guān)系最近,與哺乳動物、兩棲類和禽類的親緣關(guān)系較遠(圖1)。

2.3 多鱗fih-1基因在不同組織的表達

在正常氧條件下,對多鱗鰓、心臟、腦、肝、卵巢、精巢、肌肉等組織fih-1基因表達分析(圖2),多鱗fih-1基因在不同組織中均有表達,其中在精巢、卵巢和肌肉中的表達水平最高,其次在鰓、心臟和肝臟中的表達水平相對較高,在腦組織中的表達水平較低。

2.4 多鱗低氧脅迫處理前后fih-1基因的表達變化

對多鱗進行低氧脅迫實驗,分析低氧脅迫處理過程中fih-1基因在鰓和心臟組織中表達變化(圖3)。結(jié)果顯示,經(jīng)低氧脅迫處理1h后,fih-1基因在鰓和心臟組織中的表達量顯著升高(P＜0.05),低氧脅迫處理6h后,fih-1基因在鰓和心臟中的表達量持續(xù)顯著升高(P＜0.05),恢復正常溶解氧4h后,fih-1基因在鰓和心臟中的表達量相對低氧脅迫處理時顯著下降(P＜0.05),但仍顯著高于正常水平。

圖1 多鱗鱚與其他脊椎動物fih-1基因的系統(tǒng)進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of fih-1 gene of S. sihama and other vertebrates

圖2 多鱗鱚fih-1基因的組織表達Fig.2 The expression of fih-1 in various tissues of S. sihama

3 討論

目前已有很多關(guān)于魚類低氧相關(guān)基因的研究報道,但在多鱗中尚未有相關(guān)的研究。本次研究獲得多鱗fih-1基因序列信息及其低氧脅迫處理下鰓和心臟組織中表達變化,發(fā)現(xiàn)fih-1在多鱗低氧信號傳導通路中具有重要作用,可為今后多鱗低氧脅迫研究提供基礎(chǔ)資料。

在常氧條件下,fih-1基因在團頭魴和斑點叉尾鮰主要組織中廣泛表達[10,13],本研究也發(fā)現(xiàn)該基因在多鱗主要組織中均有表達,其中在肌肉、卵巢、精巢的表達水平最高,在鰓、心臟、肝的表達水平較高,在腦的表達水平較低。同時,fih-1基因在不同的魚類中組織表達也存在一定差異,在團頭魴和多鱗的肝臟組織表達水平相對較高,在斑點叉尾鮰的肝臟組織表達相對較低,在河川沙塘鱧的腦組織表達水平相對較高,而在多鱗的腦組織表達相對較低[10,11,13]。

圖3 低氧脅迫處理多鱗鱚fih-1基因在鰓(A)和心臟(B)的組織表達量變化Fig.3 The expression of fih-1 gene in gill (A) and heart (B) under hypoxia stress

鰓和心臟是魚類低氧應激反應主要應答器官,研究低氧脅迫下多鱗fih-1基因在鰓和心臟組織中表達,發(fā)現(xiàn)該基因在低氧脅迫處理過程表達持續(xù)顯著升高,表明fih-1基因在多鱗低氧脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在多鱗中,低氧處理1h后,fih-1基因在鰓和心臟組織中的表達量顯著升高,但在團頭魴的研究中,低氧處理2h后,fih-1基因在大部分組織中的表達量降低[10],提示該基因的表達可能在多鱗和團頭魴間存在物種特異性。經(jīng)過低氧處理6h后,fih-1基因在多鱗鰓和心臟組織表達量顯著升高,在團頭魴中fih-1基因表達量同樣表現(xiàn)顯著升高[10],這種現(xiàn)象還出現(xiàn)在尼羅羅非魚和斑點叉尾鮰[11,13],表明在魚類中長時間的低氧脅迫處理可能會持續(xù)激活fih-1基因mRNA的表達。在低氧信號傳導途徑中,fih-1基因應在缺氧期間表達下調(diào),促進HIF與其轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合并激活其下游靶基因表達[4,9],但在以上4種魚類中經(jīng)過長時間的低氧脅迫處理fih-1基因在組織中的表達顯著升高,提示低氧通路中fih-1與HIF之間可能存在反饋調(diào)節(jié)機制,說明fih-1在魚類低氧適應中起著重要的作用。丁晨雨等[15]發(fā)現(xiàn)低氧脅迫通過調(diào)節(jié)鰱心肌Bax基因和Bcl-2基因的表達來誘導心肌細胞凋亡,從而造成鰱心臟損傷甚至魚死亡,吳鑫杰等[16]發(fā)現(xiàn)低氧可導致團頭魴心臟組織結(jié)構(gòu)的變化及線粒體損傷,低氧能誘導心肌細胞的凋亡。在恢復氧氣4h后,多鱗fih-1基因在鰓和心臟組織的表達量相對低氧脅迫處理時顯著降低,逐漸恢復至正常水平,但仍比正常水平要高。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的可能原因是低氧處理導致多鱗鰓和心臟組織部分細胞損傷,也可能是經(jīng)過長時間的低氧處理,fih-1的表達量恢復至正常水平需要更長的時間。

綜上所述,本研究成功克隆多鱗fih-1基因并對其基因序列進行分析,同時探究在不同低氧脅迫處理下多鱗fih-1基因mRNA表達量的變化。結(jié)果表明,不同低氧脅迫處理組間存在顯著的差異,表明fih-1基因在多鱗低氧信號傳導通路中扮演重要的角色。本次實驗為開展并解釋多鱗低氧脅迫遺傳機制提供候選基因,可為后續(xù)fih-1基因SNP篩選、鑒定以及關(guān)聯(lián)性分析建立基礎(chǔ)。