基于代謝組學(xué)的對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷機(jī)制研究

李修龍，胡 誠，李云鶴，楊 蓉，陳 龍，賈益群

(上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心分析測(cè)試室，上海 201203)

肝臟是機(jī)體重要的新陳代謝和解毒器官，容易被一些化學(xué)物質(zhì)如酒精、四氯化碳和對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)損傷[1]。APAP是一種廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛藥；但是，已有大量的報(bào)道過量攝入是急性肝功能衰竭的主要原因，甚至可能導(dǎo)致死亡[2-3]。人們普遍認(rèn)為，對(duì)乙酰氨基酚可被肝細(xì)胞色素酶P450(cytochrome P450，CYP450)代謝為N-乙?；?對(duì)苯醌亞胺(N-Acetyl-P-Benzoquinon Imine，NAPQI)，后者可以與谷胱甘肽(glutathione，GSH)結(jié)合，形成 APAP-谷胱甘肽、APAP-半胱氨酸和 APAP-N-乙酰半胱氨酸來解毒。但是，過量的NAQPI會(huì)使細(xì)胞內(nèi)GSH耗竭，剩余的NAPQI可以共價(jià)結(jié)合細(xì)胞生物大分子形成NAQPI蛋白質(zhì)加物，擾亂細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，線粒體功能障礙和細(xì)胞核 DNA 斷裂，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和肝損傷[4-5]。目前，臨床對(duì)藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)的診斷仍有很多不足，傳統(tǒng)檢測(cè)指標(biāo)如谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(glutamate aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)等存在敏感性低、特異性差的特點(diǎn)，尚未找到理想的DILI生物標(biāo)志物。最新版《藥物性肝損傷診治指南》(2015年版)指出，新生物標(biāo)志物在DILI診斷中的貢獻(xiàn)還有待進(jìn)一步研究[6]。

代謝組學(xué)由Nicholson等[7]于1999年首次提出。它是運(yùn)用高通量儀器，對(duì)機(jī)體內(nèi)分子質(zhì)量小于1 000的代謝物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，旨在尋找與生理病理存在規(guī)律的特異性分子標(biāo)志物，適用于研究代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制及治療藥物的作用機(jī)制[8]。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)[9]，APAP肝毒性劑量(2.5 g·kg-1)給大鼠口服后48 h，從大鼠肝腎組織的病理切片觀察，產(chǎn)生了明顯的肝損傷；肝腎組織的活性氧(reactive oxygen species)、一氧化氮(nitric oxide)和丙二醛(malondiadehyde)含量增加和GSH含量以及血清的多項(xiàng)生化指標(biāo)與空白組相比也產(chǎn)生了顯著的差異，說明肝損傷后大鼠機(jī)體代謝系統(tǒng)發(fā)生了紊亂。因此，本實(shí)驗(yàn)在該文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上首次采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-Q-Orbitrap-MS)結(jié)合多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法，探討大鼠口服對(duì)APAP后不同時(shí)間段血清中內(nèi)源性代謝物的變化及可能的通路分析，為臨床診斷和用藥安全提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑對(duì)乙酰氨基酚(Sigma-Aldrich中國，批號(hào)099K0127)；2-氯苯丙氨酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)D1404053)，乙腈為色譜純(美國Honeywell公司，批號(hào)K3021728)；甲醇(批號(hào)20181113)、甲酸(批號(hào)3208K240)(均為色譜純，德國CNW公司)。

1.2 儀器FA2004N 型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，Thermo 液相色譜-質(zhì)譜儀(UPLC-Q-Orbitrap-MS)；TARGINTMVX-Ⅱ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；1730R離心機(jī)(基因有限公司)；SK8200LHC 超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；TBA-40FR生化分析儀(日本東芝公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Wistar大鼠，♂，24 只，體質(zhì)量(180±20)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，置于動(dòng)物飼養(yǎng)籠中，保持室內(nèi)溫度(18～22) ℃，室內(nèi)晝夜自然明暗交替照明，飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005，倫理審查編號(hào)：PZSHUTCM190315013。

2 方法

2.1 大鼠分組及給藥健康雄性Wistar大鼠24只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組和APAP低(1 g·kg-1)、中(2 g·kg-1)、高(3 g·kg-1)劑量組，每組6只。正常對(duì)照組口服0.5% CMC-Na溶液，APAP組口服相應(yīng)劑量0.5% CMC-Na溶液配制的200 g·L-1APAP溶液。給藥前一晚大鼠禁食不禁水；飼養(yǎng)過程中保持溫度、光照、濕度等環(huán)境條件均衡，自由進(jìn)食飲水。灌胃后分別于6、24、48 h頸靜脈取血；全血于5 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取血清置于4 ℃冰箱備用。在48 h取完血后，取大鼠肝臟，分出肝大葉，立即用福爾馬林固定。

2.2 生化指標(biāo)的測(cè)定取50 μL血清，于全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定AST和ALT值。

2.3 肝組織病理學(xué)檢測(cè)取用福爾馬林固定的肝大葉，HE 染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)。

2.4 代謝組學(xué)

2.4.1血清樣品制備 取解凍后血清樣品50 μL，加入200 μL 甲醇和5 μL 2-氯苯丙氨酸(5 g·L-1)，振搖 1 min，于4 ℃離心機(jī)中以12 000 r·min-1離心10 min，吸取100 μL上清，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中待檢測(cè)。同時(shí)，各組取等量樣品混合，制備質(zhì)控樣品。

2.4.2LC-MS分析條件 ① 色譜條件 色譜柱：[Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm]；流速0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃；流動(dòng)相組成為 A：純水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脫程序見Tab 1；體積流量0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量4 μL。② 質(zhì)譜條件:靜電場(chǎng)軌道離子阱，ESI 離子源，正離子模式為加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量45 arb；輔助氣體積流量15 arb；尾氣體積流量1 arb；電噴霧電壓3.0 kV；毛細(xì)管加熱溫度350 ℃；負(fù)離子模式為加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量45 arb；輔助氣體積流量15 arb；尾氣體積流量1 arb；電噴霧電壓3.2 kV；毛細(xì)管加熱溫度350 ℃。鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?，掃描范圍m/z：50～1 000。

Tab 1 Mobile phase elution procedure

3 結(jié)果

3.1 APAP對(duì)ALT、AST水平的影響ALT和AST水平反映了大鼠肝細(xì)胞的損傷程度；與正常對(duì)照組相比，在6 h，給藥組大鼠血清ALT、AST無顯著變化；在24 h，中、高劑量組大鼠血清ALT和AST水平明顯升高(P<0.01)；在48 h，低、中、高劑量組大鼠血清ALT和AST水平均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，見Fig 1。

Fig 1 Rat serum ALT,AST detection*P<0.05，**P<0.01 vs control

3.2 大鼠肝組織病理變化如Fig 2所示，正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞正常，低劑量組大鼠肝組織出現(xiàn)少許空泡狀肝細(xì)胞，細(xì)胞間隙擴(kuò)大；中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死，有大量炎細(xì)胞浸潤；損傷程度均較低劑量組的嚴(yán)重，且高劑量組的大鼠肝組織損傷程度比中劑量組更嚴(yán)重。

Fig 2 HE staining results of rat liver tissues(HE×200)

3.3 大鼠血清代謝物PCA分析在正模式(ESI+)及負(fù)模式(ESI-)下對(duì)大鼠血清樣本進(jìn)行 PCA 分析，從Fig 3可以看出，正常對(duì)照組、給藥組和質(zhì)控的血清樣品能明顯分開。可知給藥組大鼠與正常大鼠之間的差異可以通過代謝譜有效地辨別。

Fig 3 PCA results of APAP(2 g·kg-1)serum metabolomicsPositive:A:6 h,B:24 h,C:48 h;negative:D:6 h,E;24 h,F:48 h

3.4 大鼠血清代謝物 OPLS-DA 分析在正模式(ESI+)及負(fù)模式(ESI-)下對(duì)大鼠血清樣本進(jìn)行 OPLS-DA 分析，正常對(duì)照組、給藥組的血清樣品分離，在正離子模式下，6 h的R2X、R2Y、Q2分別為0.619、0.995、0.876，24 h的分別為0.633、0.998、0.657，48 h的分別為0.728、0.999、0.901；在負(fù)離子模式下，6 h的R2X、R2Y、Q2分別為0.655、0.998、0.714，24 h的分別為0.644、0.997、0.781，48 h的分別為0.765、0.999、0.902，見Fig 4。結(jié)果顯示，所建立的模型有效，模式質(zhì)量良好，可用于后續(xù)的組間差異成分的尋找與分析。

Fig 4 OPLS results of APAP(2 g·kg-1)serum metabolomicsPositive:A:6 h,B:24 h,C:48 h;negative:D:6 h,E:24 h,F:48 h

3.5 代謝物的鑒定及通路分析通過 OPLS-DA 分析，可以找到變量權(quán)重(VIP)>1 以及P<0.05的差異性代謝物，經(jīng) HMDB、KEGG 等譜庫檢索篩選，本實(shí)驗(yàn)共找出了45個(gè)差異性代謝物，正模式下鑒定出 33個(gè)，負(fù)模式下共鑒定出12個(gè)(與正模式下鑒定出的相同物質(zhì)刪去不表)，結(jié)果見Tab 2、Tab 3。將主要產(chǎn)物大致歸類為：磷脂類(LysoPC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、LysoPC(14:0)、LysoPE(0:0/16:0)等)，鞘脂代謝產(chǎn)物(鞘氨醇：sphinganine)，膽酸(?；悄懰幔簍aurocholic acid；3a，7a-二羥基膽酸：3a,7a-dihydroxycholanoic acid)、嘧啶類(尿嘧啶：uracil)、不飽和脂肪酸類(二十碳五烯酸：eicosapentanoic acid)、花生四烯酸產(chǎn)物(N-花生四烯酸甘氨酸：N-arachidonoyl glycine)、糖代謝產(chǎn)物(對(duì)乙酰氨基酚葡萄糖醛酸：acetaminophen glucuronide)，等。

Tab 2 Differential metabolites in serum samples of positive ion mode

Tab 3 Differential metabolites in serum samples of negative ion mode

熱圖是數(shù)據(jù)的一種二維呈現(xiàn)，可以更加清晰地表示代謝物的組間差異，因此將上述化合物構(gòu)建熱圖，見Fig 5。其中發(fā)現(xiàn)，服用APAP后上調(diào)的差異物有Sph、TCA、LysoPC(14:0)、LysoPE(0:0/18:2(9Z,12Z))等；下調(diào)的差異物有LysoPC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、3a，7a-二羥基膽酸、硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate)等。

Fig 5 Thermographic analysis of potential biomarkersNormal group(Control 1～Control 6),middle group 6 h(M 6h.1～M 6h.6),middle group 24h(M 24h.1～M 24h.6),middle group 48 h(M 48h.1～M 48h.6)

將Tab 2、Tab 3中的差異代謝物通過 Metabo Analyst進(jìn)行通路分析得知，對(duì)乙酰氨基酚致肝損傷的作用機(jī)制可能與嘧啶代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、嘌呤代謝、泛酸和CoA生物合成及初級(jí)膽汁酸的生物合成等11條代謝通路有關(guān)，見Tab 4、Fig 6。結(jié)合 KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，甘油磷脂代謝、鞘脂代謝，以及初級(jí)膽汁酸的生物合成可能是其主要相關(guān)代謝通路。

Fig 6 Metabolic pathway of serum samples

Tab 4 Metabolic pathway

4 討論

APAP是臨床上廣為使用的解熱鎮(zhèn)痛藥，但是過量服用會(huì)超過機(jī)體代謝和排毒的能力，經(jīng)肝臟代謝后生成的毒性中間產(chǎn)物NAPQI不能及時(shí)被谷胱甘肽結(jié)合而清除排出體內(nèi)，從而導(dǎo)致中間產(chǎn)物與肝組織內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，引起肝細(xì)胞壞死，出現(xiàn)血清ALT 與 AST 的急劇升高。血清中 ALT 和 AST 含量的升高是肝損傷的特異性標(biāo)志，可反映細(xì)胞損傷和壞死程度[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)劑量組大鼠最終血清的ALT與AST水平均明顯高于正常對(duì)照組，且中、高劑量組于24 h差異就產(chǎn)生顯著性；病理組織學(xué)顯示，隨著APAP劑量的遞增，炎性細(xì)胞浸潤增多，結(jié)構(gòu)損傷加重。說明服用過量的APAP可能于24 h開始產(chǎn)生肝毒性，劑量越大肝損傷的程度越嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)首次采用UPLC-Q-Orbitrap-MS結(jié)合多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法，探討大鼠口服APAP后不同時(shí)間段血清中內(nèi)源性代謝物的變化及可能的通路分析；結(jié)果表明其可能主要與甘油磷脂代謝、鞘脂代謝，以及初級(jí)膽汁酸的生物合成等代謝通路有關(guān)。

甘油磷脂代謝：從Tab 2可知，甘油磷脂是肝損傷大鼠血清中主要的生物標(biāo)記物，包括LPCs、LPEs等；亦是生物體內(nèi)含有量最豐富、種類最復(fù)雜的磷脂之一，是肝細(xì)胞以及線粒體膜的重要組成部分[11]。甘油磷脂在磷脂酶的作用下催化降解生成LPC，甘油磷脂還可以通過影響體內(nèi)藥物代謝的酶，如藥物II相代謝酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase)、藥物Ⅰ相代謝酶CYP450等，從而影響藥物的代謝及加重代謝紊亂，并且會(huì)導(dǎo)致肝臟疾??；LPC可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并且與許多疾病的發(fā)生有關(guān)；LPC亦具有細(xì)胞毒性，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠口服APAP后體內(nèi)LysoPC(14:0)、LysoPE(0:0/16:0)、LysoPE(0:0/18:2(9Z,12Z))、LysoPC(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、LysoPC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))含量升高；且PE 可與 PC 相互轉(zhuǎn)化，PE 與細(xì)胞生長、增殖和分化密切相關(guān)，是細(xì)胞凋亡的誘因[13]，由此可知，可能是APAP導(dǎo)致了甘油磷脂代謝紊亂，產(chǎn)生了有毒的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞凋亡，引起了肝損傷。

鞘脂代謝:鞘脂(sphingolipids，SPL)的代謝較為復(fù)雜，其中神經(jīng)酰胺(ceramide，Cer)處于鞘脂代謝網(wǎng)絡(luò)中的核心位置；SPL是一類以鞘氨醇(sphingsine,Sph)為骨架的較復(fù)雜的化合物，Sph在體內(nèi)生成的唯一途徑是神經(jīng)酰胺在神經(jīng)酰胺酶(ceramidase)的作用下去乙酰化而產(chǎn)生的[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)酰胺可以引起細(xì)胞內(nèi)GSH的耗竭及線粒體去極化，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，大鼠口服APAP后Sph的含量升高，而Sph只能通過Cer轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，由此可推測(cè)，APAP可能引起鞘脂代謝紊亂，從而導(dǎo)致肝損傷。且有文獻(xiàn)報(bào)道[16]，在多種肝臟疾病如酒精性肝病、肝臟缺血/再灌注損傷、脂肪性肝病等中，其體內(nèi)的Cer和Sph含量均有明顯的變化。盡管有些神經(jīng)酰胺和鞘氨醇的作用機(jī)制還有待研究，但在一定程度上可作為肝損傷的生物標(biāo)記物。

初級(jí)膽汁酸的生物合成：肝臟在膽汁酸代謝中占重要地位，與膽汁酸的合成、分泌、轉(zhuǎn)化等具有密切關(guān)系，膽汁酸的變化亦被認(rèn)為是肝損傷的代謝組學(xué)標(biāo)志物[17]。初級(jí)膽汁酸是肝細(xì)胞以膽固醇為原料直接合成的，其從肝內(nèi)被分泌出來后進(jìn)入腸腔，在一些酶和細(xì)菌的代謝下成為次級(jí)膽汁酸[18]。本次研究結(jié)果所得，大鼠口服APAP后?；悄懰?Taurocholic acid，TCA)的含量升高，3a,7a-Dihydroxycholanoic acid(亦稱鵝去氧膽酸)的含量下降；據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，TCA為疏水性膽汁酸，可通過與體內(nèi)甘氨酸及?；撬峤Y(jié)合產(chǎn)生，其含量升高可引起肝內(nèi)膽汁淤積，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁酸代謝紊亂，進(jìn)而產(chǎn)生肝毒性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上探討了低、中、高3個(gè)劑量的APAP分別在6、24、48 h對(duì)大鼠肝臟造成的影響；首次采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-Q-Orbitrap-MS)結(jié)合多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行代謝差異物及通路分析，結(jié)果顯示，APAP致肝毒性代謝通路可能與甘油磷脂代謝、鞘脂代謝，以及初級(jí)膽汁酸的生物合成等代謝通路紊亂有關(guān)，為后期深入研究APAP致肝毒性的作用機(jī)制及治療藥物的開發(fā)提供一定的依據(jù)。