單磷酰脂A佐劑的熱原控制方法研究

裴宇盛，蔡 彤，陳 晨，高 華

(中國食品藥品檢定研究院化學藥品檢定所藥理室，北京 102629)

細菌內毒素檢查法和熱原檢查法是《中國藥典》(2015版)[3]中收載的用于檢測注射劑熱原污染的方法，一般品種熱原控制首選細菌內毒素檢測。家兔熱原檢查法由于使用實驗動物，并且只能定性檢測無法定量給出具體數值，可作為終產品放行方法，但對生產過程中質量控制意義較小。新的體外熱原檢測方法[4-5](單核細胞活化實驗)是根據人的發(fā)熱機理而設計的一類檢測方法，報告基因法本質是對單核細胞活化實驗的改良。通過引入報告基因而簡化實驗流程。

本研究選擇了人源高表達TLR2受體的HEK細胞系和人源高表達TLR4受體的HEK細胞系進行檢測，并選擇了細菌內毒素檢查法作對照研究。參照藥典要求[6]3種方法分別進行線性與范圍、專屬性、檢測限、耐用度、回收率等方法學研究，其中以專屬性為研究重點。以期為MPLA佐劑建立適宜的熱原質量控制方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑細菌內毒素國家標準品(批號：150800-201601)中國食品藥品檢定研究院提供；動態(tài)顯色法試劑盒(貨號：KC-125，批號：1611182)購自湛江安度斯生物有限公司；人源高表達TLR2受體的HEK細胞系(貨號：hkb-htlr2)購自美國InvivoGen公司；人源高表達TLR4受體的HEK細胞系(貨號：hkb-htlr4)購自美國InvivoGen公司；合成MPLA分別購買自sigma(貨號：5086PHB029，批號：69800P-5mg-B-029)和InvivoGen公司(貨號：tlrl-mpls，批號：MPS-40-02)。

1.2 線性和范圍

1.2.1細菌內毒素檢查法 標準曲線制備：用1 mL細菌內毒素檢查用水(BET水)溶解細菌內毒素標準品，混勻15 min后，稀釋制備標準內毒素溶液，每步稀釋混勻不少于30 s；標準曲線范圍100～104EU·L-1，稀釋梯度為10(本文中標準曲線均為10倍稀釋)。陰性對照制備：將內毒素標準品溶液加入酶標板，每個濃度設3個復孔，陰性對照設2個復孔，加樣量均為100 μL每孔，于37 ℃孵育10 min；將鱟試劑按標示量1.25 mL溶解，立即加入酶標板中，每孔100 μL,振蕩10 s；于37 ℃條件下孵育，于660 nm處每隔30 s讀取一次數據，預設OD值為0.02。實驗重復5次。

1.2.2人源高表達TLR2受體的HEK細胞系 當細胞覆蓋率達到50%～80%時，經懸浮細胞計數后，用培養(yǎng)基將細胞稀釋2×108個·L-1，接種到96孔板，每孔160 μL。用1 mL細菌內毒素檢查用水(BET水)溶解細菌內毒素標準品，混勻15 min后，稀釋制備標準內毒素溶液，標準曲線范圍100～104EU·L-1每個濃度平行3孔。在酶標板中每孔加入20 μL內毒素標準溶液，再加入20 μL的BET水。培養(yǎng)24 h后每孔吸取上清液20 μL至一個新酶標板中，每孔續(xù)加180 μL專用顯色溶液，37 ℃孵育3 h，顯色為藍紫色，在波長630 nm下檢測。實驗重復5次。

為了進一步探求圖式理論策略與閱讀能力的關系，該研究采用逐步進入法（stepwise）對圖式理論策略與閱讀能力進行多元回歸分析（見表3）。

1.2.3人源高表達TLR4受體的HEK細胞系 除采用細胞系為人源高表達TLR4受體的HEK細胞系，其余操作同1.2.2。實驗重復5次。

1.3 專屬性研究MPLA與鱟試劑的反應：取商業(yè)化生產的兩批MPLA分別稀釋至1 μg·L-1與鱟試劑進行反應。人源高表達TLR2/TLR4受體的HEK細胞系：取商業(yè)化生產的兩批MPLA分別稀釋至1～10 000 μg·L-1分別與人源高表達TLR2/TLR4受體的HEK細胞系進行反應，記錄每一濃度響應值(OD值)。另取細菌內毒素標準品，使用內毒素檢查用水，稀釋至100～106EU·L-1，分別使用人源高表達TLR2/TLR4受體的HEK細胞系進行反應，記錄每一濃度的響應值(OD值)。

1.4 最低檢測限

1.4.1細菌內毒素檢查法 最低檢測限為鱟試劑標識靈敏度的下限。

1.4.2人源高表達TLR2/TLR4受體的HEK細胞系 最低檢測限為所制備的細菌內毒素標準曲線(S 型四參數擬合曲線)的最低點濃度,該檢測限所至單核細胞分泌的內熱原量應不小于閾值(陰性對照的平均值加上其 3 倍的標準偏差)；若小于閾值，則將閾值對應的OD值代入上述四參數擬合曲線中，獲得的濃度值即為最低檢測限。

1.5 耐用度研究人源高表達TLR2/TLR4受體的HEK細胞系：考察細胞代次的對實驗影響，將細胞傳至20代。按照1.2.2標準曲線線性和范圍實驗進行操作，r值應大于0.980。檢測限不應降低。

1.6 回收率實驗

1.6.1內毒素檢查法 樣品制備：將2種不同來源的MPLA用細菌內毒素檢查用水進行系列稀釋，細菌內毒素檢查法中，2批樣品在1 μg·L-1測定。樣品陽性對照制備：用內毒素檢查用水將細菌內毒素國家標準品進行系列稀釋，每步稀釋混勻不少于30 s；將內毒素標準品分別加入到2批MPLA中，使其含有內毒素含量為104EU·L-1。標準曲線制備：用1 mL細菌內毒素檢查用水(BET水)溶解細菌內毒素標準品，混勻15 min后，稀釋制備標準內毒素溶液，標準曲線范圍100～106EU·L-1，每個濃度平行3孔。陰性對照制備：為內毒素檢查用水。

1.6.2人源高表達TLR2/TLR4受體的HEK細胞系 樣品制備：將2種不同來源的MPLA用細菌內毒素檢查用水進行系列稀釋，TLR4細胞系中，2批樣品在1 mg·L-1測定。TLR2細胞系中，2批樣品在0.1 g·L-1測定。樣品陽性對照制備同1.6.1。標準曲線制備：用1 mL細菌內毒素檢查用水(BET水)溶解細菌內毒素標準品，混勻15 min后，稀釋制備標準內毒素溶液，標準曲線范圍100～ 106EU·L-1每個濃度平行3孔。陰性對照制備：為內毒素檢查用水。

1.7 內毒素含量檢測樣品制備、樣品陽性對照制備、標準曲線制備、陰性對照制備同1.6回收率試驗。

1.8 統計方法

1.8.1細菌內毒素檢查法 到達預設OD值的時間(Onset time)與對應的內毒素濃度進行雙對數轉換，以內毒素濃度對數值為橫坐標，以Onset time對數值為縱坐標進行線性擬合，擬合相關系數的絕對值應大于0.980。

按中國藥典內毒素檢查法干擾實驗項目下計算回收率，回收率在50%～200 %范圍內有效。

1.8.2人源高表達TLR2/TLR4受體的HEK細胞系 以內毒素濃度值為橫坐標，以吸光度值為縱坐標進行四參數擬合，擬合相關系數應大于0.980。按中國藥典內毒素檢查法干擾實驗項目下計算回收率，回收率在50%～200 %范圍內有效。

2 結果

2.1 線性和范圍采用3種方法進行檢測，r的絕對值均>0.980，檢測范圍上下限及r的絕對值，詳見Tab 1。

Tab 1 Results of linear range

2.2 專屬性MPLA與鱟試劑反應方面，MPLA可以引起類似內毒素的響應，其響應值高達1×109EU·g-1水平，與純品細菌內毒素的反應水平相當(參照細菌內毒素國際標準品說明書)，應為假陽性結果。MPLA專屬性研究試驗結果方面，MPLA對TLR2細胞系在實驗濃度范圍內測定值與陰性對照均無顯著性差異，表明在該濃度范圍內，MPLA并不會與TLR2細胞系發(fā)生反應，詳見Fig 1。MPLA在1 mg·L-1以上可激動TLR4受體并產生效應。此即MPLA的免疫激活效應，詳見Fig 2。內毒素專屬性研究結果方面，不同純度內毒素在不同濃度表現出對TLR2/TLR4細胞刺激結果不同。TLR2細胞對內毒素標準品在10 000～106EU·L-1范圍內顯示出隨濃度依賴的響應，詳見Fig 3。對于TLR4細胞內毒素標準品在濃度100～106EU·L-1范圍內細胞顯示出隨劑量依賴的響應，詳見Fig 4。綜上所述，MPL和內毒素標準品，對鱟試劑和TLR4細胞系引起類似的響應活性，不能將兩者區(qū)分；而TLR2細胞系僅對細菌內毒素標準品有響應，因此可用TLR2細胞系作為MPL的檢測細胞。

Fig 1 Results of MPLA specificity test on TLR2 cell line n=3)

Fig 2 Results of MPLA specificity test on *P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 3 Results of endotoxin specificity test on TLR2 cell line n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 4 Results of endotoxin specificity test on TLR4 cell line n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.3 檢測限根據“1.4.1”和“1.4.2”，內毒素檢查法檢測限確定為10 EU·L-1，TLR2細胞法為104EU·L-1，TLR4細胞法為100 EU·L-1。

2.4 耐用度考察細胞傳代次數對實驗影響，TLR2/TLR細胞系傳至20代，按照“1.2.2”標準曲線線性和范圍實驗進行操作，r值均大于0.980。各自檢測限與“2.3項”相比，均未降低。

2.5 回收率實驗和內毒素檢測結果結果見Tab 2。根據藥典規(guī)定，回收率在50%～200 %即符合規(guī)定，其檢測值即為樣品的內毒素含量。

Tab 2 Results of endotoxin detection and recovery

3 討論

實驗結果顯示，MPLA和細菌內毒素都能與鱟試劑發(fā)生反應。細菌內毒素一般由3部分組成，類脂A核心多糖和特異性多糖，鱟試劑與細菌內毒素的結合位點在于類脂A部分[7]。而MPLA恰恰是人工合成的類脂A結構類似物。雖然其具有相同的結合位點，但是其與鱟試劑的反應劑量依賴性卻與細菌內毒素表現出很大差異，由于這種特性，類似于生物測定量反應平行線法測定中，樣品與標準品產生的生物活性不同，不能用來定量。另一方面，細菌內毒素檢測的目的是間接反映樣品中污染的熱原量，MPLA雖然能與鱟試劑發(fā)生反應，然而卻不具有致熱性[8]，這就使得使用鱟試劑這種方法來控制其熱原污染程度失去了意義。因此表2中細菌內毒素檢查法所測定結果，雖然回收率實驗符合藥典的規(guī)定，用來量化細菌內毒素并不準確，僅作為同濃度不同樣品間內毒素含量比較參考值。

TLR4細胞法專屬性結果與細菌內毒素檢測專屬性研究結果類似。同樣存在無法確定檢測值是由MPLA引起還是由于細菌內毒素引起，因此也不適合用來量化細菌內毒素含量。根據中國藥典規(guī)定，細菌內毒素檢查法在檢測過程中，僅需要進行標準曲線可靠性驗證和干擾試驗，即回收率，可建立檢測方法。并不進行專屬性、耐用度等方面的研究。然而根據研究結果顯示，MPLA會嚴重干擾細菌內毒素檢測和TLR4細胞法準確檢測出細菌內毒素。

根據Fig 2、4結果，雖然MPLA和內毒素均能夠激動TLR4受體，根據細菌內毒素國際標準品的內毒素質量和效價關系，0.12 ng對應1 EU效價，可估算0.012 μg·L-1即可激活TLR4受體，明顯高于MPLA(1 mg·L-1)。推測與細菌內毒素的分子大小與聚集形態(tài)更適合于結合TLR4受體。

細菌內毒素是經典的TLR4受體激動劑[9]，本實驗表明細菌內毒素國家標準品同樣可以激活TLR2受體。根據文獻報道[10-11]，細菌中的脂蛋白，或者熱滅活大腸桿菌均可以激活TLR2受體，即使TLR2受體是由非內毒素成分激活，本研究所建立的TLR2細胞檢測體系仍然可以用于質控，其原因在于自然界不存在細菌內毒素純品，在質量控制活動中出現的細菌內毒素必定為細菌死亡后的產物。TLR2細胞檢測體系即為檢測微生物污染間接反映熱原的量。