第二代測序技術(shù)在五例人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎診斷中的應(yīng)用

金珂 王曉娟 關(guān)鴻志 秦靈芝 賈亞珍 周珂珂 馬海暢 王月 王芳 邢麗 李瑋

人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎是指由皰疹病毒原發(fā)感染或潛伏感染再激活后引起的嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，好發(fā)于老年人、兒童或免疫力低下人群，具有發(fā)病率高、病死率高的特點，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、嘔吐、精神行為異常、癲發(fā)作、共濟失調(diào)、頸項強直等，甚至可引起譫妄、昏迷、呼吸或循環(huán)衰竭［1-2］。目前，病毒分離與聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是診斷該病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但病毒分離與鑒定耗時長且檢出率低，而PCR 則受引物所能結(jié)合的核酸片段的限制，從而大大地限制了這兩種實驗方法的臨床應(yīng)用。而第二代測序技術(shù)（NGS）具有不受靶向引物限制、檢測速度快、檢出率高等特點，可以快捷并高效地輔助臨床診斷，自2014 年首次報道以來逐漸在臨床腦脊液標(biāo)本病原體檢測中推廣應(yīng)用［3］。筆者通過對5 例人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎患者臨床及腦脊液第二代測序結(jié)果的分析，擬評價該項技術(shù)在皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎診斷中的應(yīng)用價值。

對象與方法

一、觀察對象

1.納入標(biāo)準(zhǔn) （1）臨床特征符合腦膜炎或腦炎癥狀與體征（發(fā)熱、頭痛、精神狀態(tài)改變、癲發(fā)作、頸項強直等）。（2）腰椎穿刺腦脊液檢查白細(xì)胞計數(shù)＞5×106/L。（3）影像學(xué)檢查可見腦膜強化或腦實質(zhì)異常改變。（4）腦脊液第二代測序檢出人類皰疹病毒序列。（5）臨床無其他微生物感染證據(jù)。（6）本研究經(jīng)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)［倫理批號：（2017）倫審第（35）號］，并為北京市腦炎協(xié)作組腦脊液第二代測序合作研究項目子項目（倫理批號：JS-890），入組病例及其家屬對研究內(nèi)容知情并簽署知情同意書。

2.排除標(biāo)準(zhǔn) （1）非感染性腦炎如自身免疫性腦炎（IE）、副腫瘤邊緣性腦炎（PLE）、視神經(jīng)脊髓炎譜系疾?。∟MOSDs）、風(fēng)濕免疫性疾病累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。（2）近期（發(fā)病＜4 周）有疫苗接種史。（3）存在腰椎穿刺禁忌證或無法獲取腦脊液。

3.一般資料 選擇2018 年1-9 月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院并確診的患者共5例，男性3例，女性2例；年齡 17 ～ 72 歲，平均為 40.20 歲。5 例患者均急性發(fā)病，病程為6 ～13 d，平均8 d；發(fā)病季節(jié)分別為夏季（例1、例2）、秋季（例3、例5）和冬季（例4）；既往病史包括肺腺癌腦轉(zhuǎn)移（例1）、高血壓（例2、例4）；癥狀與體征以發(fā)熱、頭痛、頸項強直（5 例）為主，同時可伴有精神行為異常（例1）、左上面部皰疹（例2）、嗜睡或癲發(fā)作（例1、例2和例5），詳見表1。

二、研究方法

1.腦脊液第二代測序 （1）標(biāo)本采集：對入組患者行腰椎穿刺獲取1 ～2 ml 腦脊液，滴入試管（德國Sarstedt 公司），于30 min 內(nèi)置-80 ℃冰箱保存，用于第二代測序。（2）樣本提取與質(zhì)控：采用微量樣本基因組DNA 提取盒［DP316 型，天根生化科技（北京）有限公司］提取腦脊液樣本DNA，通過DNA 切割超聲破碎儀（Q800R2，美國Qsonica 公司）破碎至200 ～300 bp 小片段，2100 生物分析儀（美國Agilent 公司）質(zhì)控片段大小，定量PCR（美國Thermo Fisher 公司）質(zhì)控DNA 文庫濃度。（3）文庫構(gòu)建：在獲得的DNA片段末端修復(fù)和加A后，在其兩端添加接頭序列，并將其環(huán)化形成單鏈環(huán)狀DNA，滾環(huán)擴增技術(shù)將單鏈環(huán)狀 DNA 增加 2 ～ 3 個數(shù)量集，獲得 DNA 納米球。（4）測序：將DNA 納米球加載至測序芯片上，使用BGISEQ-50 測序平臺（天津華大基因科技有限公司醫(yī)學(xué)檢驗所）對DNA納米球進行測序。

2.數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量控制 測序數(shù)據(jù)下機后，剔除低質(zhì)量、低復(fù)雜度、測序長度＜35 bp的讀數(shù)，獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)后與BWA 人類基因組數(shù)據(jù)庫（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）進行比對，然后剔除人類基因組序列信息的干擾，再將剩余數(shù)據(jù)與微生物數(shù)據(jù)庫（ftp：//ftp.nebi.nlm.nih.gov/genomes/）進行比對，達到對細(xì)菌、病毒、真菌及原生生物的初步鑒定。本研究是與北京協(xié)和醫(yī)院腦炎協(xié)作組的合作項目，針對臨床真陰性或腦脊液培養(yǎng)陽性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者進行研究，初步獲得常見背景菌信息，例如痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌等，當(dāng)微生物初步鑒定完成后，再次剔除常見背景菌，獲得更為可靠的數(shù)據(jù)報告［4］。主要觀察指標(biāo)為病毒種，以腦脊液第二代測序所檢測到的病毒序列數(shù)＞1 為條件進行鑒定。

結(jié) 果

血清學(xué)檢查，白細(xì)胞計數(shù)（6.08 ～13.94）×109/L［（3.50 ～ 9.50）× 109/L］，鈉離子133 ～ 143 mmmol/L（137 ～ 147 mmmol/L），細(xì)菌培養(yǎng)均呈陰性。5 例患者均于入院2周內(nèi)行腦脊液檢查，腦脊液外觀清亮、透明，壓力為195 ～310 mm H2O（1 mm H2O=9.81×10-3kPa，80 ～ 180 mm H2O），白細(xì)胞計數(shù)為（74 ～260）× 106/L［（0 ～ 5）× 106/L］，單核細(xì)胞比例為85.30% ～ 100.00%（15% ～ 45%），蛋白定量 640 ～1620 mg/L（150 ～ 460 mg/L），葡萄糖水平為 2.24 ～3.23 mmol/L（2.50 ～ 4.50 mmol/L），氯化物 117.80 ～125.00 mmol/L（120 ～132 mmol/L）；腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)無陽性病例（表2）。本組患者腦脊液新型隱球菌莢膜抗原、Xpert 耐藥結(jié)核桿菌、抗酸-真菌-革蘭染色和自身免疫性抗體檢測均呈陰性。MRI 檢查，2 例呈現(xiàn)軟腦膜強化（例3、例 4）；3 例T2WI 和FLAIR 成像表現(xiàn)為高信號影，其中1例（例1）定位于雙側(cè)額顳葉、1 例（例2）定位于雙側(cè)額葉，1 例（例5）定位于側(cè)腦室周邊及雙側(cè)枕葉（圖1）。

以腦脊液第二代測序所檢測到的病毒序列數(shù)＞1 為條件，共計分離與鑒定病毒 1 屬 3 種，1 例（例 1）檢出人類皰疹病毒Ⅰ型（HHV-1），臨床診斷為人類皰疹病毒Ⅰ型腦炎；3 例（例2、例3、例4）檢出人類皰疹病毒Ⅲ型（HHV-3），臨床診斷為人類皰疹病毒Ⅲ型腦炎和（或）腦膜炎；1例（例5）檢出人類皰疹病毒Ⅳ型（HHV-4），臨床診斷為人類皰疹病毒Ⅳ型腦炎。腦脊液第二代測序檢出人類皰疹病毒核酸序列數(shù)為 4 ～ 5406 條，平均為 2089.20 條，將鑒定的讀數(shù)映射至病毒基因組的覆蓋度為0.08%～81.01%，檢測深度為1.00 ～2.21（表3）。同時，還鑒定出細(xì)菌5屬12種，真菌4屬5種，未見原生生物（寄生蟲等）。

本組5 例患者均采取抗病毒治療，3 例（例1、例2、例 4）予更昔洛韋30 mg/次（2 次/d）治療，2 例（例3、例5）予阿昔洛韋15 mg/次（3次/d）口服，同時配合低劑量激素（甲潑尼龍50 mg/d）靜脈注射以減輕腦水腫，以及對癥支持治療，療程7 ～22 d。住院期間并發(fā)低鈉血癥者［2例（例1、例2）］予高鹽飲食；高同型半胱氨酸血癥（例3）和雙側(cè)胸腔積液（例5）者均未進行特殊治療，其中胸腔積液者在密切監(jiān)測下液體自行吸收。經(jīng)治療后，5 例患者頭痛、發(fā)熱、頸項強直等癥狀均消失，血液及腦脊液常規(guī)、生化指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，血常規(guī)白細(xì)胞計數(shù)（6.08 ～7.90）×109/L，腦脊液白細(xì)胞計數(shù)（34 ～70）×106/L、蛋白定量440 ～730 mg/L、葡萄糖 2.56 ～ 3.59 mmol/L、氯化物為119.80 ～ 124.80 mmol/L。1 個月后隨訪，5 例患者均無癥狀，各項實驗室指標(biāo)恢復(fù)至正常值范圍。

討 論

人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中最為常見的疾病之一，大多由人類皰疹病毒顆粒在原發(fā)感染位點或內(nèi)皮細(xì)胞、周圍神經(jīng)元、淋巴細(xì)胞、腎臟、分泌腺等位點潛伏或復(fù)制，并通過血行傳播、神經(jīng)元回路擴散、醫(yī)原性途徑或其他機制通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，好發(fā)于老年人、兒童或免疫力低下的人群［1，5-6］。臨床發(fā)病急驟、癥狀重，缺乏特異性，確診依賴實驗室檢查結(jié)果。但腦脊液樣本有限，僅能滿足部分檢查需要，且實驗室檢查耗時耗力、病原確診率低。腦脊液病毒分離與鑒定雖然被認(rèn)為是診斷病毒性腦炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但據(jù)文獻報道僅有＜5%的病例可以被成功鑒定［7-10］。PCR 技術(shù)雖然能夠提高腦脊液病原學(xué)診斷陽性率，但單次檢測范圍受限，只能檢測引物所能結(jié)合的病原體核酸片段，因此其臨床應(yīng)用難以推廣。血清學(xué)診斷方面，病毒抗體檢測于病毒感染后2 ～4 周才能達到診斷陽性率的高峰，且檢測容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此，為了進一步提高病原檢出率，臨床迫切需要一種新的技術(shù)方法［11-13］。

圖1 頭部MRI檢查所見 1a 例1患者橫斷面抑脂F(xiàn)LAIR成像顯示雙側(cè)額顳葉高信號影，雙側(cè)顳葉呈現(xiàn)“刀背征”，丘腦及蒼白球可見散在類圓形高信號影（箭頭所示） 1b 例2 患者橫斷面抑脂F(xiàn)LAIR 成像顯示雙側(cè)額葉深部高信號影（箭頭所示） 1c，1d 例3 和例4 橫斷面增強T1WI 可見軟腦膜強化影增多 1e 例5 患者橫斷面抑脂F(xiàn)LAIR 成像顯示側(cè)腦室周圍及雙側(cè)枕葉高信號影（箭頭所示）Figure 1 Head MRI findings of 5 patients with human herpes virus encephalitis/meningitis Axial FLAIR imaging of Case 1 showed high-intensity signals in bilateral frontotemporal lobe and "knife back sign" in bilateral temporal lobe. In addtion, scattered round-like high-density signals could be seen in thalamus and globus pallidus (arrows indicate, Panel 1a). Axial FLAIR of Case 2 showed highintensity signals in bilateral frontal lobe (arrows indicate, Panel 1b). Axial enhanced T1WI of Case 3 and Case 4 showed increasing of leptomeningeal enhancement shadow (Panel 1c, 1d). Axial FLAIR of Case 5 showed high-intensity signals around the lateral ventricle and bilateral occipital lobe (arrows indicate, Panel 1e).

2015 年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院關(guān)鴻志教授對4例病毒性腦炎確診患者的腦脊液標(biāo)本進行第二代測序，2 例檢出人類皰疹病毒Ⅰ型（測序深度分別為35、3.3，覆蓋度分別為98%、53%）、1 例檢出人類皰疹病毒Ⅱ型（HHV-2，測序深度為1.3，覆蓋度為27%）、1 例檢出人類皰疹病毒Ⅲ型（測序深度為1.1，覆蓋度 12%）［14］。隨后，Xing 等［10］應(yīng)用腦脊液第二代測序技術(shù)確診人類皰疹病毒Ⅰ型腦炎6 例，人類皰疹病毒Ⅱ型腦炎1 例，人類皰疹病毒Ⅲ型腦炎 3 例。2019 年，Wilson 等［15］報告一項大樣本前瞻性臨床試驗結(jié)果，在204例特發(fā)性腦膜炎、腦炎或脊髓炎住院患者中，腦脊液第二代測序共檢出13例常規(guī)檢查方法無法確診的病例，其中8 例在行腦脊液第二代測序之前并未被考慮為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。上述研究表明，腦脊液第二代測序在人類皰疹病毒病原學(xué)診斷中具有一定臨床應(yīng)用價值。

本組5例人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎患者的癥狀與體征均缺乏特異性，血清和腦脊液病原學(xué)檢查結(jié)果，以及自身免疫性腦炎抗體檢測均呈陰性，腦脊液白細(xì)胞計數(shù)為（74 ～260）×106/L，以淋巴細(xì)胞為主，蛋白定量略升高，葡萄糖輕度降低或正常，影像學(xué)可見病灶多集中于額葉、顳葉、枕葉、軟腦膜、側(cè)腦室周圍等部位，符合病毒性腦炎和（或）腦膜炎的臨床特征，但與其他種類病毒如腸道病毒所致腦炎和（或）腦膜炎，以及自身免疫性腦炎難以鑒別。本研究通過腦脊液第二代測序分析，1 例檢出人類皰疹病毒Ⅰ型、3 例檢出人類皰疹病毒Ⅲ型以及1例檢出人類皰疹病毒Ⅳ型；其中，人類皰疹病毒Ⅳ型是Epstein-Barr 病毒，主要侵犯B 淋巴細(xì)胞。本組5 例患者的人類皰疹病毒核酸序列數(shù)為4 ～5406條，平均2089.20條，覆蓋度為0.08%～81.01%，其中1例（例5）覆蓋度較低（＜1%），考慮可能與測序深度偏低有關(guān)，例如背景信息的干擾、腦脊液病毒載量較少，或者從發(fā)病至獲取腦脊液樣本時間過長而致病毒核酸降解等。5 例患者經(jīng)過抗病毒治療后病情均明顯改善，支持病毒性腦炎和（或）腦膜炎的診斷。

表3 5例人類皰疹病毒性腦炎和（或）腦膜炎患者第二代測序結(jié)果Table 3. NGS results of 5 patients with human herpesvirus encephalitis/meningitis

本研究樣本量較小，而且測序深度偏低、基因覆蓋度低，有待在今后的臨床研究中擴大樣本量，改進測序技術(shù)。腦脊液宏基因組第二代測序技術(shù)以其高通量、短片段測序優(yōu)勢，可加快測序速度，增加樣本病原學(xué)陽性檢出的可能，從而彌補了傳統(tǒng)病原學(xué)檢測陽性發(fā)現(xiàn)率較低的劣勢，從而協(xié)助臨床對病原的診斷，使更多患者獲益。第二代測序技術(shù)不僅能夠鑒定病毒種類，還可以提供病毒的相對載量、基因分型、耐藥性等信息，但是目前缺乏行業(yè)判讀標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果還需綜合生物學(xué)家、生物信息學(xué)分析專家、臨床醫(yī)師的意見進行判讀［13，16-17］。第二代測序技術(shù)作為一種新型分子診斷技術(shù)，雖然存在缺陷和不足，但相信隨著技術(shù)的發(fā)展和成熟，在未來作為常規(guī)應(yīng)用于臨床感染篩查，將會大大提高臨床醫(yī)師對感染患者診斷效率和準(zhǔn)確性。

利益沖突無