基于仿生識(shí)別系統(tǒng)對(duì)金銀花顏色與“氣”的鑒別研究＊

姚月保，楊曉蕓，彭 蓮，俞越童，邵遠(yuǎn)洋，鄒慧琴，閆永紅

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488；2. 昆藥集團(tuán)股份有限公司研究院 昆明 650106；3. 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科 廣州 510630）

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]，有悠久的藥用歷史，有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效[2]，常用于治療喉痹，丹毒[3]?，F(xiàn)代研究表明，金銀花具有提高免疫力、解熱、抗炎等功效[3]。

每種中藥材都有自己特定的顏色、氣味，和其所含的化學(xué)成分相關(guān)，在長(zhǎng)期用藥實(shí)踐中，一直把顏色和氣味作為評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[1]。對(duì)上等藥材的性狀鑒別中，常常包括顏色和氣味的語言描述，例如金銀花以表面綠色[4-6]，香氣濃者為佳。藥材的顏色、氣味不僅由它的品種和產(chǎn)地決定，不正確的加工、儲(chǔ)存方法也會(huì)使藥材性狀特征發(fā)生改變，失去原有的色澤和氣味。因此，在傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別的指導(dǎo)下，我們可通過藥材性狀特征，辨別出藥材的品種、產(chǎn)地、加工方法、儲(chǔ)藏時(shí)間和質(zhì)量?jī)?yōu)劣等。然而，由于在傳統(tǒng)的性狀鑒別中，人們只是憑借視覺和嗅覺對(duì)藥材的顏色、氣味特征進(jìn)行評(píng)定，鑒定的主觀性強(qiáng)，使得傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別中顏色和氣味特征難以客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量。

隨著現(xiàn)代仿生技術(shù)的不斷發(fā)展及其與中藥鑒定學(xué)科的交叉結(jié)合，色度儀、電子鼻仿生技術(shù)被迅速地運(yùn)用于中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)，使中藥顏色、氣味的表述不再是主觀性、抽象化的定性描述，而是數(shù)字化、客觀化的定量描述。色度儀是基于三濾色片原理，利用儀器內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)光源照明樣本，樣本選擇性吸收反射光線，光電探測(cè)器檢測(cè)反射光并與標(biāo)準(zhǔn)光源作比較、計(jì)算[7]。電子鼻又稱仿生嗅覺系統(tǒng)、氣味掃描儀，它是以特定的傳感器和模式識(shí)別系統(tǒng)快速提供被測(cè)樣品的整體氣味信息,指示樣品的隱含特征[8]，因此，能夠反映中藥材的“整體氣味特征”，符合傳統(tǒng)中醫(yī)藥“整體觀”的理論思想，而且不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，可對(duì)樣品進(jìn)行無損分析。

藥材所含化學(xué)成分種類及含量高低與藥材的顏色、氣味密切相關(guān)，通過顏色、“氣”的客觀量化可以有效地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量。何婉婉等[9]通過對(duì)北豆根顏色和化學(xué)成分的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)粉末的顏色橙紅色越深，其所含的生物堿含量越多。鄒慧琴等[10]引入分光測(cè)色計(jì)，確定了甘草去皮打粉的斷面顏色量化方法和以直接測(cè)量為主、濕法施壓剝皮測(cè)量為輔的表皮顏色量化方法，測(cè)量方法簡(jiǎn)便、可靠，測(cè)量結(jié)果顯示可以如實(shí)反映藥材顏色情況，為中藥顏色數(shù)字化發(fā)展提供了新思路。拱健婷等[11]選取易走油中藥苦杏仁為研究載體，通過色度儀、電子鼻量化樣品走油前后的顏色、氣味變化，為中藥貯藏過程中以顏色、“氣”的客觀量化來評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量提供新的思路與參考。黃學(xué)思等[12]通過色彩色差計(jì)和電子鼻分別對(duì)檳榔樣品（生檳榔、炒檳榔、焦檳榔）的顏色、“氣”進(jìn)行客觀量化，判別中藥炮制的“火候”，以此來評(píng)價(jià)檳榔炮制品。

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥顏色、“氣”描述的客觀化、規(guī)范化，本文將仿生系統(tǒng)技術(shù)——色度儀和電子鼻引入中藥性狀鑒別，以常用大宗藥材金銀花為研究對(duì)象，建立金銀花顏色、“氣”數(shù)字化分析方法，為快速、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量提供依據(jù)，同時(shí)利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建模分析以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同儲(chǔ)藏期、產(chǎn)地及處理方式金銀花的快速鑒別。

1 材料儀器

1.1 材料

5 批金銀花樣品收集于河南、河北和山東三個(gè)主產(chǎn)區(qū)（河南A、河南B、河南C、河北、山東），所有樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系閆永紅教授鑒定，確定為藥典所規(guī)定的忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.

藥材的顏色、氣味和其品種、產(chǎn)地密切相關(guān)，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)藏、高溫烘烤、日照等也會(huì)使藥材的顏色、氣味發(fā)生變化。藥材儲(chǔ)藏過久，其內(nèi)部會(huì)發(fā)生氧化、酶催化等反應(yīng)，高溫會(huì)加速藥材內(nèi)部細(xì)胞活動(dòng)或使細(xì)胞死亡，藥材在光照下易發(fā)生氧化和分解等活動(dòng)，這些均會(huì)導(dǎo)致藥材顏色和氣味發(fā)生改變[13]。因此，為得到不同顏色和氣味的金銀花樣品進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述收集的5 批樣品分別按如下方法處理：①河南A、河北、山東進(jìn)行常溫避光儲(chǔ)藏，每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行一次測(cè)量；②河南B 分別進(jìn)行70℃烘箱加熱、日光光照處理，當(dāng)顏色或氣味發(fā)生改變時(shí)測(cè)量；③河南C 進(jìn)行日光光照處理，當(dāng)顏色或氣味發(fā)生改變時(shí)測(cè)量。烘箱加熱的溫度太低，顏色改變較慢，溫度太高會(huì)將樣品烤糊，因此將烘箱加熱的溫度定為70℃；日光光照為從8:00—17:00日光照射，溫度為外界氣溫平均溫度。

樣品信息見表1。

表1 金銀花樣品信息

1.2 儀器

BP211D 型1/100 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯），帶有積分球及色度分析軟件的U-3010 紫外可見分光光度計(jì)（日本日立公司），粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司），自制石英測(cè)色皿，α-Fox3000 電子鼻指紋分析儀（法國(guó)AlphaMos公司），藥典篩。

2 方法

圖1 CIE1976L*a*b*均勻色空間系統(tǒng)

2.1 性狀鑒別

組建測(cè)評(píng)小組對(duì)所有金銀花樣品分別做顏色、“氣”感官評(píng)價(jià)，測(cè)評(píng)小組由10位有鑒定專業(yè)知識(shí)背景的北京中醫(yī)藥大學(xué)資源與鑒定專業(yè)的在讀研究生組成，感官評(píng)價(jià)前對(duì)測(cè)評(píng)小組成員進(jìn)行一段時(shí)間的相關(guān)培訓(xùn)。

傳統(tǒng)認(rèn)為金銀花表面綠色[4-6]，香氣濃者為佳，所以將感官評(píng)價(jià)指標(biāo)顏色由深到淺的文字描述定為：綠色-黃綠色-綠白色-黃白色-黃色，同一個(gè)顏色深淺分4個(gè)不同等級(jí)，“1”為最深，“4”為最淺，如“綠色1、綠色2、綠色3、綠色4”是將綠色分為了4個(gè)不同等級(jí)，“1”為最深，“4”為最淺；氣味由濃到淡的文字描述定為：濃郁香氣-氣清香-氣微。同一個(gè)氣味濃淡分4個(gè)不同等級(jí)，“1”為最濃，“4”為最淡，如“濃郁香氣1、濃郁香氣2、濃郁香氣3、濃郁香氣4“是將濃郁香氣分為了4個(gè)不同等級(jí)，“1”為最濃，“4”為最淡。

2.2 數(shù)字化顏色的測(cè)定

本試驗(yàn)采用目前使用較廣泛的CIE1976L*a*b*均勻色空間系統(tǒng)[14]，如圖1 所示，L*表示明度，值越大越偏白，反之偏黑；正負(fù)a*分別表示紅綠方向；正負(fù)b*分別表示黃藍(lán)方向；ΔE*ab = {(ΔL*)2+(Δa*)2+ (Δb*)2}1/2表示色差，通常認(rèn)為其≤1時(shí)，人眼無法分辨兩種顏色的差異。

2.2.1 供試品的制備

粉碎金銀花樣品，過4號(hào)篩?；旌暇鶆蜻^篩粉末，以把測(cè)色皿裝滿為標(biāo)準(zhǔn)，取適量的粉末裝入石英測(cè)色皿中，蓋上石英玻璃片，并用自封膜封口，備用。

2.2.2 色度測(cè)量條件

針對(duì)工作需要的不同，顏色測(cè)量?jī)x器分為分光測(cè)色計(jì)和色彩色差計(jì)，生產(chǎn)中的色差測(cè)量常使用色彩色差計(jì)，而分光測(cè)色計(jì)因?yàn)榫缺容^高，常用于高精度色彩的分析，其中日立3010紫外可見分光光度計(jì)精度更高，更適合科研研究，且較適宜測(cè)量粉末類樣品。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇日立3010紫外可見分光光度計(jì)作為顏色測(cè)量?jī)x器。

起止波長(zhǎng)：780-380 nm；掃描速度：600 nm·min-1；狹縫寬度：1 mm；照明光源：D65；視場(chǎng)選擇：10 度視角。

2.2.3 色度測(cè)量方法

將標(biāo)準(zhǔn)白板分別放入日立3010 紫外可見分光光度計(jì)中積分球的參比處、樣品處，按照2.2.2項(xiàng)下所設(shè)定的條件進(jìn)行基線校正，當(dāng)基線校正后取出放置于樣品處的標(biāo)準(zhǔn)白板，將2.2.1中所制得的供試品放入積分球的樣品處，進(jìn)行測(cè)量。

2.2.4 精密度考察

選取河北的樣品，按照2.2.1 方法制備樣品，連續(xù)測(cè)量6 次，結(jié)果顯示RSD 均＜3%，說明儀器精密度良好。

2.2.5 重現(xiàn)性考察

選取河北樣品6 份，按照2.2.1 方法制備樣品，分別進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示RSD 均＜3%，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.3 數(shù)字化氣味的測(cè)定

2.3.1 供試品的制備

粉碎金銀花樣品，使其通過2 號(hào)篩，混合均勻粉末。稱取0.5 g 樣品粉末，裝入頂空瓶，并立刻壓蓋密封。

2.3.2 頂空樣品制備條件

孵化時(shí)間：360 s，孵化時(shí)間：45℃，樣品震蕩速度：250 r·s-1。

2.3.3 分析條件

進(jìn)樣量2500 μL，注射速度2500 s，載氣為空氣，流速150 mL·min-1，數(shù)據(jù)采集時(shí)間120 s，數(shù)據(jù)采集周期1 s，數(shù)據(jù)采集延遲300 s，吹掃時(shí)間480 s。

3 結(jié)果與分析

3.1 性狀鑒別結(jié)果

組建測(cè)評(píng)小組對(duì)金銀花樣品分別作顏色、“氣”感官評(píng)價(jià)，建立感官描述表，見表2。

將金銀花樣品按不同顏色、氣味歸類,結(jié)果見表3。傳統(tǒng)性狀鑒別金銀花以顏色發(fā)綠、濃郁香氣者質(zhì)量為佳，黃色、氣微類質(zhì)量較差，從性狀描述的結(jié)果來看，在避光儲(chǔ)藏、加熱和光照的樣品中，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的推移，樣品的顏色逐漸變淺，氣味逐漸變淡。光照樣品中溫度越高，顏色和氣味變化越明顯。

表2 金銀花樣品感官描述表

3.2 顏色數(shù)字化測(cè)量結(jié)果

按照2.2 所述對(duì)所有金銀花樣品進(jìn)行顏色測(cè)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次，記錄平均值，結(jié)果見表4。

表4 金銀花顏色測(cè)量指標(biāo)值

對(duì)金銀花所測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在不同產(chǎn)地金銀花方面，購(gòu)入的河南、河北和山東產(chǎn)金銀花在顏色上有明顯差異，河南產(chǎn)的金銀花較其他兩個(gè)產(chǎn)地的金銀花相比a*值更小，說明其顏色較其他兩種偏綠；河北產(chǎn)的金銀花b*值大于其他兩個(gè)產(chǎn)地，說明其顏色較偏黃；山東產(chǎn)的金銀花L*大于其他兩地的金銀花，說明其明度更高，顏色更淺。傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為金銀花偏綠色者為佳[4-6]，從顏色測(cè)量值可以推出，河南產(chǎn)的金銀花質(zhì)量?jī)?yōu)于其他兩地，這與傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗(yàn)一致[15]。

樣品1-5（未做處理的金銀花）的L*值小于經(jīng)過常溫避光、加熱、光照儲(chǔ)藏的部分樣品，說明經(jīng)過常溫避光、加熱、光照儲(chǔ)藏后，部分金銀花的顏色逐漸變白；樣品1-5（未做處理的金銀花）的a*值為負(fù)值，則說明其顏色偏綠，這些樣品經(jīng)過常溫避光、加熱、光照儲(chǔ)藏后，部分樣品的a*值逐漸增大為正值，說明其顏色中綠色的成分逐漸減少；樣品2、3 在經(jīng)過加熱和光照儲(chǔ)藏后，顯示其b*逐漸減少，說明其顏色中黃色成分逐漸減少。綜上，經(jīng)過常溫避光、加熱、光照儲(chǔ)藏后，金銀花的L*、a*值逐漸增大，b*值逐漸減小，說明顏色逐漸變淺。

采用色度儀對(duì)金銀花顏色進(jìn)行分析后，將顏色測(cè)定值和性狀鑒定結(jié)果相結(jié)合，對(duì)金銀花的五類顏色劃定大致范圍，見表5。通過對(duì)每類顏色的L*、a*、b*值的范圍劃定，使我們對(duì)金銀花顏色的描述由主觀的視覺判斷和感性描述變?yōu)槎康目陀^的描述。

表5 金銀花五類顏色的L*、a*、b*值范圍表

將表4 數(shù)據(jù)以EXCEL 文件保存,然后輸入到SIMCA-P + 13.0 軟件（Umetrics，Sweden）進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用OPLS-DA 分析，分析過程中根據(jù)3.1 性狀鑒別結(jié)果項(xiàng)下表3 將樣品按照顏色不同分為5 類，結(jié)果見圖2。

圖2 不同顏色金銀花的L*、a*、b*OPLS分析

從表5 和圖2 可以看出部分范圍區(qū)間有交叉重合現(xiàn)象，這是由目測(cè)顏色分類不準(zhǔn)確引起的，說明傳統(tǒng)性狀鑒別對(duì)顏色的主觀性描述難以客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量。傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)很大程度上依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)判斷，有著很強(qiáng)的經(jīng)驗(yàn)性和主觀性，例如對(duì)藥材顏色的描述黃白色、黃色等詞語，這種模糊語言的描述，相互之間并沒有明確的界限，可能對(duì)于同一種中藥，不同的人觀察后做出的判斷可能不太相同，即使經(jīng)驗(yàn)豐富的中藥鑒定人員也不易分辨清楚，而且人的感覺器官容易疲勞。

表6 不同產(chǎn)地及處理方式金銀花樣品分組

3.3 氣味測(cè)量結(jié)果分析

用電子鼻分別對(duì)41份樣品按2.3實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)試，每份樣品重復(fù)3 次。釆集了12 根傳感器響應(yīng)值數(shù)據(jù)，將電子鼻測(cè)量結(jié)果建立判別因子分析判別模型。

3.3.1 不同產(chǎn)地及處理方式金銀花樣品判別模型的建立

將樣品按不同產(chǎn)地及處理方式分組，分組情況見表6。

利用每份樣品的每根傳感器最大響應(yīng)值進(jìn)行DFA分析，分析結(jié)果見圖3。

如圖所示，判別因子1 和判別因子2 和大于85%，說明樣品區(qū)分度很大，DFA 判別模型能夠較好的區(qū)分不同組別的金銀花。儲(chǔ)藏樣品組1、2、3 和樣品組4、8均是常溫狀態(tài)下放置、未經(jīng)過加熱和光照處理的樣品，判別結(jié)果將其聚為了一類。判別結(jié)果將樣品組5、7、9 聚為了一類，這幾組樣品均是經(jīng)過光照處理后的樣品。樣品組6 單獨(dú)聚成了一組，其特點(diǎn)是經(jīng)過加熱處理后的樣品。所有樣品均經(jīng)過確認(rèn)，識(shí)別值均為100%。說明不同的金銀花在“氣”（揮發(fā)性成分的種類和含量）上有一定的區(qū)別，并且DFA 模型能夠很好的區(qū)分氣味濃郁和氣微的金銀花。

圖3 不同產(chǎn)地及處理方式金銀花樣品的DFA判別模型

表7 金銀花不同儲(chǔ)藏期分組

3.3.2 不同儲(chǔ)藏期判別模型的建立

將樣品按不同儲(chǔ)藏期分組，分組情況見表7。

將表7的數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析，分析結(jié)果見圖4。

圖4 不同儲(chǔ)藏期金銀花樣品的DFA判別模型

如圖所示，判別因子1 和判別因子2 和大于85%，說明DFA 判別模型能夠?qū)⒉煌瑑?chǔ)藏期的金銀花進(jìn)行較好的分類。判別結(jié)果將分組1 單獨(dú)聚為了一類；分組2、3 聚為了一類；分組4 聚為了一類；分組5、6、7、8聚為了一類。未經(jīng)過儲(chǔ)藏樣品、短期儲(chǔ)藏樣品和長(zhǎng)期儲(chǔ)藏樣品在電子鼻結(jié)果分析上有很好的區(qū)分，所有樣品均經(jīng)過確認(rèn)，識(shí)別值均為100%，表明存儲(chǔ)時(shí)間不同的金銀花在“氣”（揮發(fā)性氣體的種類和含量）上有著一定的區(qū)別，并且DFA 模型能夠很好的區(qū)分氣味濃郁和氣微的金銀花。

4 討論

本課題組將仿生識(shí)別儀器——色度計(jì)與電子鼻引入中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)中，對(duì)顏色、“氣”進(jìn)行客觀測(cè)定，同時(shí)對(duì)各指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，將代表顏色、“氣”的指標(biāo)值與代表質(zhì)量指標(biāo)值相聯(lián)系，探索顏色、“氣”與有效成分之間的相關(guān)性，揭示了傳統(tǒng)性狀鑒別經(jīng)驗(yàn)的合理性，將老藥工傳承下來的鑒別經(jīng)驗(yàn)數(shù)字化，并且可通過對(duì)顏色、“氣”的測(cè)量，快速地判斷或預(yù)測(cè)藥材有效成分含量，完善中藥品質(zhì)的評(píng)價(jià)模式，推進(jìn)中藥現(xiàn)代化。課題組前期已對(duì)金銀花顏色、“氣味”與其所含化學(xué)成分的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在一定程度上，金銀花顏色測(cè)量值L*越小，所含的綠原酸含量越低；多酚類、葉綠素含量與顏色值關(guān)系規(guī)律不明顯。金銀花“氣”綜合指標(biāo)值與綠原酸、多酚類含量有顯著性正相關(guān)關(guān)系；與木犀草苷之間不存在顯著相關(guān)關(guān)系，證明金銀花的顏色、“氣”與其內(nèi)在的化學(xué)成分密切相關(guān)，并已發(fā)表文章[45-48]。本文則側(cè)重于為傳統(tǒng)中藥性狀鑒別中感官顏色與“氣”的客觀化、數(shù)字化分析方法的建立提供參考，用于指導(dǎo)實(shí)踐。