利用電子順磁波譜技術(shù)研究紅參對羥自由基的清除作用＊

劉紫琪，孔德志，田 園，張盼盼，任雷鳴

（河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 石家莊 050017）

紅參是經(jīng)新鮮的人參蒸煮加工后制得的熟品，現(xiàn)代研究表明紅參具有抗腫瘤、抗氧化和抗應(yīng)激等多種藥理活性[1-3]，一般認為人參皂苷是其發(fā)揮抗氧化作用的主要活性成分。近年來，紅參的抗氧化作用成為人們關(guān)注的焦點，紅參通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等多種抗氧化酶的活性，增強內(nèi)源性抗氧化劑如谷胱甘肽的合成，從而減少或消除自由基的產(chǎn)生，降低氧化損傷[4-6]。也有報道指出，人參皂苷可通過直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）而保護H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷[7]。

ROS 廣泛分布于大氣以及生物體中，廣泛定義為含氧的化學(xué)反應(yīng)性分子，體內(nèi)各種細胞在生理及病理條件下均可產(chǎn)生。生物體中的ROS 主要為單線態(tài)氧（single O2）、過氧化物（ROO?）、超氧陰離子（O2-?）以及羥自由基（?OH），其中?OH 是對人體損害最大的自由基之一，具有高活性、高反應(yīng)性和高表達性，是引起氧化應(yīng)激的主要原因[8]。在病理條件下，過量的ROS 會誘導(dǎo)基因突變、細胞衰老和死亡[9-11]，并參與誘發(fā)動脈粥樣硬化、神經(jīng)病變、糖尿病等病理過程[12-13]。

電子順磁共振是用于檢測具有順磁性物質(zhì)（具有未成對電子）的一種波譜方法，其主要的檢測對象是具有順磁性質(zhì)的自由基和過渡金屬離子[14]。此法是極少數(shù)可以直接測定復(fù)雜體系中自由基含量的方法[15]。本實驗采用電子順磁共振波譜技術(shù)，結(jié)合自旋捕獲劑，研究紅參對?OH 的直接清除作用，以利于進一步開發(fā)紅參資源。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

EMX-nano 電子順磁共振波譜儀（德國Bruker 公司），UltiMate?3000 高效液相色譜儀（美國Thermo 公司），Thermo Orbitrap Fusion 高分辨率組合式質(zhì)譜儀（美國Thermo 公司），KQ-300DE 型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀有限公司），Cubis MSX 電子天平（美國Sartorius公司）。

1.2 試劑試藥

紅參藥材（粉碎后過40目篩），石家莊市樂仁堂藥店；人參皂苷對照品Rh1、F1、F2、Rf、Rg5、Rb3、Rg3（HPLC 含量均大于95%），成都曼斯特生物科技有限公司；5,5-二甲基吡咯氮酮（DMPO），日本東仁化學(xué)科技有限公司；六水合硫酸亞鐵銨FeSO4(NH4)2SO4?6H2O，上海阿拉丁生化科技公司；30% H2O2，美國Sigma 公司；甲醇、乙腈、乙酸（色譜純），美國Thermo公司。

2 方法

2.1 實驗原理

檢測?OH 等短壽命自由基，一般需要添加自旋捕獲劑（通常為有機硝酮類或亞硝基類），這些自旋捕獲劑會與短壽命自由基反應(yīng)生成壽命較長的自由基加合物，通過檢測這些加合物的含量從而實現(xiàn)對這些短壽命自由基的定量[15]。本研究以芬頓反應(yīng)為?OH產(chǎn)生體系，即痕量的過渡金屬，例如Fe 和Cu，可使過氧化氫異質(zhì)裂解成?OH 和OH-陰離子：Fe2++H2O2→Fe3++(OH)-+ ?OH（式1）。但所生成的?OH 極不穩(wěn)定，半衰期只有10-9s[16]，聯(lián)合環(huán)狀硝酮類?OH 捕獲劑DMPO 將其轉(zhuǎn)化為半衰期較長的捕獲劑加合物DMPO-OH（見式2），可以準確、快速地直接定量分析短壽命?OH 的產(chǎn)生。

2.2 溶液配制

紅參樣品溶液的配制：取紅參樣品粉末約80.0 mg，精密稱定，加1 mL 水，冰浴超聲30 min，浸泡過夜，再

次超聲30 min，得紅參樣品母液；將母液用超純水分別稀釋2、4、10、20、40倍，得相當于母液50%、25%、10%、5%、2.5%的不同濃度紅參樣品溶液。

人參皂苷對照品溶液的配制：分別稱取Rh1、F1、F2、Rf、Rg5、Rb3、Rg3 對照品適量，加入超純水，超聲30 min溶解，得5 mmol?L-1不同人參皂苷的溶液。

取上述人參皂苷對照品溶液，70%甲醇稀釋上述人參皂苷溶液50 倍，20000 g 離心10 min，取上清100 μL用于人參皂苷的LC-MS檢測。

不同濃度人參皂苷Rg5 溶液的配制：取上述5 mmol?L-1人參皂苷Rg5溶液，用超純水分別稀釋1.25、2.5、5、10、20 倍，得濃度分別為4、2、1、0.5、0.25 mmol?L-1Rg5溶液。

稱取適量FeSO4(NH4)2SO4?6H2O，超純水溶解得0.4 mmol?L-1溶液；H2O2用超純水稀釋至2mol?L-1、0.4 mol?L-1、40 mmol?L-1；DMPO超純水稀釋至0.9 mol?L-1。

2.3 紅參提取液中皂苷成分的檢測

根據(jù)文獻[17]中測定人參皂苷方法，測定本研究紅參樣品中的皂苷成分。方法簡述如下：色譜條件：色譜柱Xbridge C18 柱（3.5 μm，100 × 3.0 mm）；流動相：含0.02%乙酸水溶液（A）和乙腈溶液（B）；梯度洗脫：0-1 min 30% B，2-6 min 30%-48% B，6-9 min 48% -5% B，9-12 min 85% B；流速：0.35 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件：負離子模式；ESI 源的參數(shù)設(shè)置：加熱溫度335℃，毛細管溫度335℃，毛細管電壓3.5 kV，鞘氣42 arb，輔助氣12 arb；掃描模式：數(shù)據(jù)依賴式采集（DDA）；一級掃描分辨率120000，掃描范圍550-1750 Da；二級隔離窗口2 Da，掃描分辨率15000；碰撞能量（HCD）：20%。

2.4 EPR儀器測試參數(shù)

中心磁場（CF）：3432 G；掃描寬度（SW）：100 G；掃描時間（ST）：30 s；微波功率（MP）：10 mW；調(diào)制幅度（MA）=1.0 G；調(diào)制頻率（MF）：100 KHz；微波頻率（MF）：9.63 GHz；測試溫度（T）：室溫。

2.5 ?OH生成體系的確定

確定體系內(nèi)Fe2+和DMPO 的終濃度分別為0.1 mmol ?L-1和225 mmol ?L-1，設(shè) 定H2O2的 濃 度 為10 mmol?L-1、100 mmol?L-1和500 mmol?L-1，在0.5 mL離心管內(nèi)依次加入5 μL 水，5 μL 0.4 mmol?L-1Fe2+，5 μL 0.9 mol?L-1DMPO，混合均勻后分別加入5 μL 40 mmol?L-1H2O2、5 μL 400 mmol?L-1H2O2、5 μL 2 mol?L-1H2O2快速吸打混勻引發(fā)反應(yīng)。立即移至石英毛細管中，外加石英保護套管，放入電子順磁波譜儀的諧振腔中，待儀器自動調(diào)諧完畢后開始測量，此時距芬頓反應(yīng)開始為兩分鐘。?OH生成量用DMPO-OH的峰高（H）表示。

2.6 EPR技術(shù)檢測紅參對?OH生成的影響

分別吸取5 μL 紅參樣品母液及相當于母液濃度50%、25%、10%、5%、2.5%的不同濃度紅參提取液為樣品溶液（空白對照以5 μL 水代替），以及等體積的0.4 mmol?L-1FeSO4(NH4)2SO4?6H2O、0.9 mol?L-1DMPO，快速吸打混勻，最后加入5 μL 6% H2O2（2 mol?L-1）引發(fā)芬頓反應(yīng)。吸打混勻后快速移至石英毛細管中，外加石英保護套管，放入電子順磁波譜儀的諧振腔中，待儀器自動調(diào)諧完畢后開始測量，此時距芬頓反應(yīng)開始為2 min。

?OH 清除率計算按照公式：I=(H0-Hx)/H0*100%，其中，I表示清除率，H0表示空白體系中EPR 測量芬頓反應(yīng)產(chǎn)生?OH 與DMPO 形成的加合物的信號值，Hx表示加入紅參提取液及人參皂苷溶液后的EPR 測量信號值。I值越大，則表明紅參對?OH清除能力越強。

2.7 ERP技術(shù)檢測不同人參皂苷對?OH生成的影響

分別吸取5 μL 濃度為5 mmol?L-1的人參皂苷Rh1、F1、F2、Rf、Rg5、Rb3、Rg溶液為樣品溶液（空白對照以5 μL 水代替），以及等體積的0.4 mmol?L-1FeSO4(NH4)2SO4?6H2O、0.9 mol?L-1DMPO，快速混勻后加入5 μL 6%H2O2（2 mol?L-1），參照2.5項下的描述進行測定并計算?OH的清除率。

2.8 EPR技術(shù)檢測人參皂苷Rg5對?OH生成的影響

分別吸取5 μL 濃度分別為5、4、2、1、0.5、0.25 mmol?L-1的Rg5 溶液為樣品溶液（空白對照以5 μL 水代替），以及等體積的0.4 mmol?L-1FeSO4(NH4)2SO4?6H2O、0.9 mol?L-1DMPO，快速混勻后加入5 μL 6%H2O2（2 mol?L-1），參照2.5項下的描述進行測定并計算?OH的清除率。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0 進行單因素方差分析，組間多重比較選擇Dunnett′s t 法，以P＜0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)差異的指標。

3 結(jié)果

3.1 紅參提取液皂苷成分的確定

依據(jù)各人參皂苷對照品的出峰時間，LC-MS 負離子模式下在紅參藥材提取液中檢測到了人參皂苷Rh1、Rf、Rb3、F1、F2、Rg3、Rg5，各物質(zhì)的[M+CH3COO]-提取離子流圖見圖1。

圖1 紅參提取液中各皂苷成分的提取離子色譜圖

3.2 確定?OH產(chǎn)生體系

DMPO-OH 的EPR 波譜圖見圖2，g = 2.005，超精細分裂常數(shù)aN= 14.8 × 10-4T，aβH= 14.8 × 10-4T。a 體系各物質(zhì)的終濃度為0.1 mmol?L-1Fe2+、10 mmol?L-1H2O2、225 mmol?L-1DMPO，DMPO-OH 生成量對應(yīng)峰高Hx 為11.15；b 體系為0.1 mmol?L-1Fe2+、100 mmol?L-1H2O2、225 mmol?L-1DMPO，DMPO-OH 生成量對應(yīng)峰高Hx為19.44；c體系為0.1 mmol?L-1Fe2+、500 mmol?L-1H2O2、225 mmol?L-1DMPO，DMPO-OH 生成量對應(yīng)峰高Hx 為21.44。通過測試Fe2+和H2O2不同濃度比例下 的?OH 生 成 情 況，發(fā) 現(xiàn)H2O2在500 mmol ?L-1時DMPO-OH 生成量最大，且平行性較好（見圖1），最終確 定?OH 產(chǎn) 生 的 體 系 為Fe2+0.1 mmol ?L-1、H2O2500 mmol?L-1、DMPO 225 mmol?L-1，即每個樣品加入5μL40 mmol?L-1H2O2、5 μL 400 mmol?L-1H2O2、5 μL 2mol?L-1H2O2。

3.3 紅參提取液對?OH的清除作用

分別添加紅參樣品母液及相當于母液濃度50%、25%、10%、5%、2.5%的不同濃度紅參提取液后，測量芬頓體系產(chǎn)生的?OH（見圖3）。a 為空白對照中DMPO-OH 的EPR 波譜圖，b ～g 分別為稀釋40、20、10、4、2倍后人參提取液及紅參樣品母液中DMPO-OH的波譜圖，清除能力分別為16.45%、26.55%、34.65%、41.39%、43.52%、50.96%。表明紅參在測定濃度范圍內(nèi)清除?OH 能力隨濃度增加而增強，且在人參提取液母液濃度2.5% ～10%的范圍內(nèi)，呈明顯的線性關(guān)系。當濃度大于25%時，其對?OH 的清除能力不再明顯增加，清除率大于40%，說明紅參對?OH 有較好的清除能力。

3.4 不同人參皂苷對?OH的清除作用

七種不同人參皂苷Rh1、Rf、Rb3、F1、F2、Rg3 及Rg5 對?OH 的清除實驗結(jié)果見圖4；與對照組相比，人參皂苷Rg5 的清除作用最強（P＜0.001），能夠清除約60%的?OH；其次為Rf（P＜0.01），能夠清除約15%的?OH；人參皂苷Rh1、Rb3、F1、F2 和Rg3 無明顯的作用（P＞0.05）。

圖2 摸索不同條件下?OH的生成體系

圖3 不同濃度紅參提取液對?OH的清除能力

3.5 人參皂苷Rg5對?OH的清除作用

分別測量0.25、0.5、1、2、4、5 mmol?L-1Rg5 溶液，測得?OH 清除能力分別為3.06%、11.74%、15.24%、27.86%、63.55%、62.75%。表明人參皂苷Rg5 清除?OH作用與濃度成正相關(guān)。且人參皂苷Rg5 濃度范圍在0.25 mmol?L-1～4 mmol?L-1范圍時?OH 的清除作用與Rg5濃度呈明顯的正相關(guān)，當Rg5濃度大于4 mmol?L-1時清除能力不再增加。

4 討論

圖4 不同人參皂苷對?OH的影響

在世界范圍內(nèi)，隨著人口老齡化和人們對生活方式與慢性疾病關(guān)系認識的提高，應(yīng)用具有保健功能的天然產(chǎn)物來預(yù)防疾病的消費趨勢逐年上升[4]，其中人參作為一種保健功能性食品在世界范圍內(nèi)的應(yīng)用非常廣泛，占有舉足輕重的地位。

圖5 人參皂苷Rg5對?OH的清除作用（n=3）

人參是多年生草本植物，為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖，其藥用歷史已有4000 余年，主要產(chǎn)于中國東北、朝鮮、日本、韓國等地?，F(xiàn)代研究證明，人參皂苷、人參多糖等成分具有抗疲勞、增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等多種藥理功能，被視為“百草之王”[18-19]。紅參是新鮮的人參經(jīng)蒸煮加工后制得的熟品，紅參在高溫蒸煮、烘干的過程中，人參皂苷和人參多糖的種類、含量均發(fā)生變化[4]，通過美拉德反應(yīng)增加了其清除ROS的能力[20]。

自由基在體內(nèi)的生成復(fù)雜而多樣，但可以通過建立體外化學(xué)反應(yīng)體系來模擬體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，例如羥自由基（?OH）可由芬頓反應(yīng)產(chǎn)生，超氧陰離子（O2-?）可由黃嘌呤（X）和黃嘌呤氧化酶（XOD）產(chǎn)生[21]。常見檢測?OH 的方法包括分光光度計法[22]、熒光顯微鏡法等，但這些方法都是將自由基與探針結(jié)合，依據(jù)結(jié)合型探針的吸光度值或熒光強度間接反映自由基的濃度；而探針易受多種實驗因素的干擾，影響測定結(jié)果的準確性[15]。由于自由基為順磁性物質(zhì)，在適當強度的磁場中即產(chǎn)生電磁輻射吸收，從而產(chǎn)生EPR 光譜圖。通過測量譜圖的超精細耦合、g 值和峰高、峰面積等參數(shù)，不僅可以對存在基團定性，還可以測定其精確的結(jié)構(gòu)、濃度、周圍環(huán)境以及運動狀態(tài)等。由于只有自由基等順磁性物質(zhì)才會對微波存在共振吸收，故非自由基物質(zhì)不會干擾該測定過程，而這是其他技術(shù)（如紫外/可見光、紅外、熒光和拉曼光譜以及電化學(xué)方法）所無法比擬的[15]。因此，EPR 技術(shù)具有直接、可靠、準確、快速的優(yōu)點，是藥物體外抗自由基活性的良好篩選手段。

雖然既有研究表明紅參及其部分活性成分具有抗氧化、清除ROS 的功能，然而大多數(shù)研究是應(yīng)用分光光度計法檢測1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的含量，間接推測其清除ROS 的能力[23-24]。但DPPH 法非常容易受到外界因素的影響，如反應(yīng)時間、樣品性質(zhì)、DPPH 初濃度、結(jié)果表達方式，以及光照、氧氣、pH 值、離子等[25]。文獻表明，在光照、氧氣存在及pH 降低等情況下，均會使DPPH 自由基的吸光度值降低[26]。本文首次采用EPR 技術(shù)對人參皂苷Rh1、Rf、Rb3、F1、F2 及Rg5 的清除自由基作用進行了研究，結(jié)果表明人參皂苷Rg5 具有明顯的清除?OH 活性，清除率大于60%，而其他皂苷成分清除?OH 作用不明顯，故本實驗對人參皂苷Rg5進行了量效曲線研究。

人參皂苷Rg5 是紅參的主要皂苷成分之一，屬于原人參二醇型人參皂苷。Rg5是人參的根莖在蒸煮和加熱過程中產(chǎn)生的，可以抑制腫瘤細胞的生長、增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，如：Rg5 可通過下調(diào)Bcl-2 蛋白抑制食管癌Eca-109 細胞的增殖，并促進其凋亡[27]；Rg5 通過miR-125b/STARD13/NEU1 信號通路抑制胃癌BGC-823 細胞的侵襲、遷移[28]。有文獻指出，在脂多糖刺激的BV2細胞中，Rg5通過上調(diào)血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達來抑制ROS 的產(chǎn)生，降低細胞內(nèi)ROS水平，起到保護細胞的作用[29]。

通過電子順磁共振技術(shù)，本研究首次發(fā)現(xiàn)Rg5 具有直接清除?OH 的作用。對于體外生成的?OH，人參皂苷Rg5 對其的清除能力可能來源于結(jié)構(gòu)中的-Glc-Glc（D-吡喃葡萄糖），因為有文獻報道指出結(jié)構(gòu)中存在-Glc-Glc 的人參皂苷對?OH 清除有明顯的作用[10]。在本實驗研究的皂苷中，Rf 同樣具有此結(jié)構(gòu)，故也表現(xiàn)出一定的清除?OH 能力，而文獻報道20(S)-Rg3 對?OH 清除具有明顯作用，20(R)-Rg3 并無此作用[10]，因此，人參皂苷清除?OH 的能力不僅與糖鏈的結(jié)構(gòu)有關(guān)，還可能與還原性-OH的空間構(gòu)象有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)紅參及其活性成分人參皂苷Rg5 具有明顯的直接清除自由基的作用，且該作用與濃度呈正相關(guān)。本研究確定了紅參抗自由基的物質(zhì)基礎(chǔ)，證實了紅參及其活性成分人參皂苷Rg5 是一種很好的天然自由基清除劑。文獻報道自由基與腫瘤、糖尿病、動脈粥樣硬化等多種疾病相關(guān)，本實驗結(jié)果為這些疾病的后續(xù)研究提供了數(shù)據(jù)支持，也為我們合理開發(fā)利用紅參資源和研制新型功能性食品提供了科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。