藤莓湯改善CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜免疫炎性損傷的機制研究＊

楊 蕾，張正菊，相瑞陽，顧 文，張紅紅，何毓璽，王達利，劉 慧，馬衛(wèi)國，孟鳳仙

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院風(fēng)濕科 北京 100078；2. 北京中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科 北京 100010；3. 順義中醫(yī)院風(fēng)濕科 北京 101300）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是由T、B細胞介導(dǎo)的全身性自身免疫病，以慢性滑膜炎癥為主要病理特征[1]。RA 主要以滑膜為靶組織，病理可見滑膜充血水腫，滑膜細胞增生，血管周圍可見滑膜增生，肉芽組織增生和血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨破壞，纖維樣關(guān)節(jié)強直[2]，最終導(dǎo)致嚴(yán)重畸形、關(guān)節(jié)功能喪失。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，全世界患病率約1%，我國患病率約0.3%，本病好發(fā)年齡為40-50歲，且女性患病率是男性的3 倍[3]。西醫(yī)治療RA 主要以緩解癥狀、控制病情為主，以非甾體抗炎藥、改善病情抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素類藥物等為主要用藥，這些藥物雖能暫時緩解癥狀，但長期安全性并不明確。近年來，白芍總苷、雷公藤等在治療RA 中療效確切，中醫(yī)藥能夠通過多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)治療RA。因此，探究中藥對RA 的作用機制具有重要應(yīng)用價值。

免疫炎性損傷貫穿著RA 發(fā)病的始終，由于機體免疫穩(wěn)態(tài)被打破，關(guān)節(jié)滑膜免疫系統(tǒng)被激活，大量的淋巴細胞浸潤，引起了關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，加速關(guān)節(jié)局部免疫-炎性的惡循環(huán)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，藤莓湯（Tengmei Decoction，TMD）能夠有效緩解膠原誘導(dǎo)性（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況，改善關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，能夠抑制大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性分子的表達，緩解模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜局部炎性損傷。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)炎局部突變型P53（Mutant P53，mt-p53）既能夠抑制成纖維細胞的凋亡、促進細胞增殖[14]，又能夠通過激活NF-kB 途徑，參與細胞外基質(zhì)降解及關(guān)節(jié)軟骨破壞[15]。增殖誘導(dǎo)配體（a proliferation-inducing ligand，APRIL）則能夠通過與相應(yīng)受體結(jié)合，直接/間接促進T、B 細胞的形成、增殖，參與關(guān)節(jié)滑膜局部炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)[17]。因此，本實驗通過觀察TMD 對CIA 模型大鼠APRIL、mt-P53、IL-2表達水平的影響，探討其改善RA 模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜免疫炎性病理損傷的分子機制是否與調(diào)控滑膜局部mt-P53 信號途徑，抑制炎性細胞浸潤，改善滑膜組織過度增殖有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物

實驗所需要的動物為：SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體重210±10 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012－0001。其中6 只為正常組，剩余均為造模組，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度21℃-22℃，相對濕度60%-70%，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物

實驗所需要的藥物為：藤莓湯[6]（忍冬藤30 g、蛇莓15 g、烏梢蛇10 g、沒藥10 g、桑枝15 g、穿山龍15 g 等）濃煎成50 mL，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥劑科提供；來氟米特片（10 mg，蘇州長征－欣凱制藥有限公司，批號：130126）。

1.3 試劑與儀器

實驗所需要的試劑與儀器為：牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex，批號：130087），完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號：CAS9007-81-2），Anti-P53 antibody（英國Abcam 公司，批號：ab131442），IL-2 ELISA 試劑盒（美國eBioscience 公司，批號：87728012），Beta-Actin 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab6276），GAPDH、目標(biāo)上下游引物為(上海)英駿公司合成。

定量PCR 儀（美國ABI 公司），DYY-10C 電泳儀（北京六一儀器廠），5810R 臺式冷凍離心機（德國Eppendorf 公司），JY-2Y1 轉(zhuǎn)膜儀（北京君意東方公司），UV-2000 紫外分光光度計（上海尼柯公司），RT-6000型酶標(biāo)儀（深圳雷杜公司）。

1.4 模型制備、分組及干預(yù)方法

根據(jù)造模方法[5-6]取牛CⅡ乳劑于大鼠尾根部皮內(nèi)注射，0.2 ml/只，記錄當(dāng)天為初次免疫，9 天后，每只大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.1 ml乳化劑，作為加強免疫，正常組兩次分別注射0.2 ml、0.1 ml生理鹽水，免疫16 d時，根據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分（arthritisindex，AI），進行模型成功評判，具體判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[7]，AI 評分≥4 分視為造模成功。本次實驗成模率為83.33%。

采用隨機數(shù)字表法選取成模大鼠24只參與后續(xù)實驗研究，中藥給藥組每組6只分為TMD高劑量組（High dose of TMD group，HTMD）、TMD 低劑量組（Low dose of TMD group，L TMD），以TMD 生藥量31.8、15.9 g/(kg·d-1)灌胃；模型組（Model group，MG）、陽性對照組（Positive drug group，PDG）每組6只分別予去離子水10 mL/(kg·d-1)、來氟米特1.87 mg/(kg-1·d-1)灌胃；另設(shè)正常對照組（Normal group，NG），6 只，予去離子水10 mL/(kg·d-1)，各組連續(xù)干預(yù)12 周。陽性對照藥組及TMD 高、低劑量組藥量相當(dāng)于臨床常人用藥劑量5.6、11.2、5.6倍。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

干預(yù)結(jié)束后，10%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血、離心、提血清，用于ELISA 檢測；大鼠死亡后，將其置于冰面，取右踝關(guān)節(jié)，置于4%固定液中，以備病理學(xué)觀察。取雙膝關(guān)節(jié)滑膜，迅速放入凍存管中，置于液氮中保存以備Real-time PCR、Western Blot 技術(shù)檢測。

1.5.1 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織mt-P53、APRIL、IL-2基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

檢測取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本，使用TR Izol試劑提取RNA 后，進行一步法Real-time PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體積為25 μL，反應(yīng)體系含樣本RNA 2 μL，POWER SYBR GREEN 17.2 μL，10 pmol 引物各0.8 μL。反應(yīng)條件為：42℃滅活5 min，95℃變性10 s，95℃退火5 s，60℃延伸34 s，共40個循環(huán)。結(jié)束后終止循環(huán)，計算三個重復(fù)均值并記錄。使用Sequence Detection System軟件分析PCR 過程各檢測樣本的Ct 值。引物設(shè)計及合成情況見表1。以β-actin 作為內(nèi)參基因，采用相對定量方法，根據(jù)以下公式計算各基因的起始模板濃度。起始模板相對表達量=2-ΔΔCt

表1 引物設(shè)計及合成情況

1.5.2 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中mt-P53 蛋白表達水平檢測

取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織30 mg，預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，取1 ml RIPA加入樣品中，混合添加蛋白抑制劑，混勻后充分震蕩以助于裂解，待混合液體，清透為止。置于冰塊上孵育20 min，孵育后，離心4℃，13000 rpm離心20 min，吸取上清，測定蛋白濃度，煮沸變性5 min，-20℃保存。配制12%分離膠，5%濃縮膠，加定量后蛋白樣本，跑電泳。濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜放入封閉袋中，加入含5%脫脂奶粉封閉液TBST，搖床搖動2 h。按照1∶1000孵育一抗，4℃過夜。次日，用封閉液稀釋孵育二抗（1∶5000），稀釋過后將其與膜共同孵育2 h。孵育結(jié)束，將ECL 小心滴加到膜的蛋白上，反應(yīng)180 s；將膠片曝光時長控制在10 s-5 min范圍（注：曝光時間隨不同光強度而調(diào)整），先顯影2 min，之后再定影，詳細流程參照[5]。

采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對Western Blot 蛋白雜交條帶進行掃描，并用gel-pro 軟件對圖像進行灰度分析。相對含量的變化=目的蛋白灰度/actin灰度。

1.5.3 大鼠血清中IL-2蛋白表達水平檢測

大鼠經(jīng)腹主動脈取血后，放入15 ml 離心管中，常溫靜置2 h，離心（4℃，3000 rmp，15 min），采用ELISA技術(shù)檢測大鼠血清中IL-2細胞因子的表達水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進行具體實驗操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，各組間兩兩比較采用LSD 檢驗，方差不齊時，則采用Tamhance'sT2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中APRIL mRNA 轉(zhuǎn)錄水平比較

與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中APRIL mRNA 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，各治療組關(guān)節(jié)滑膜組織中APRIL mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)（P＜0.01）（見表2，圖1）。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中APRIL mRNA轉(zhuǎn)錄水平x±s，cpm

圖1 各組大鼠滑膜組織中APRIL mRNA轉(zhuǎn)錄水平

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中mt-P53mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平比較

與正常組比較，模型組關(guān)節(jié)滑膜組織中mt-P53mRNA及蛋白表達水平上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，各治療組關(guān)節(jié)滑膜組織中mt-P53mRNA 及蛋白表達水平下調(diào)（P＜0.01）（見表3，圖2-圖4）。

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜、血清中IL-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平比較

與正常組比較，模型組滑膜組織、血清中IL-2 mRNA 及蛋白表達水平均上調(diào)（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，各治療組IL-2 mRNA 及蛋白表達水平均水平下調(diào)（P＜0.01，P＜0.05）（見表4，圖5、圖6）。

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中mt-P53mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平±s

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中mt-P53mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平±s

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05。

組別正常對照組模型組陽性對照組藤莓湯高劑量組藤莓湯低劑量組N 6 6 6 6 6 mt-P53 mRNA 91.74±9.92326.98±12.37##151.03±11.02**193.25±11.62**262.91±11.88**蛋白12.13±1.0921.70±2.05##14.76±0.93**16.43±0.66**18.04±0.91**

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜、血清中IL-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平±s

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜、血清中IL-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平±s

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05。

組別蛋白35.78±13.2454±10.63##32±10.11**44.86±12.63*59.8±18.67**正常對照組模型組陽性對照組藤莓湯高劑量組藤莓湯低劑量組N 6 6 6 6 6 IL-2 mRNA 92.01±6.73199.78±10.81##110.04±12.95**145.86±10.20**147.56±6.86**

圖2 各組大鼠滑膜組織中mt-p53 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖3 各組大鼠血清中mt-p53蛋白表達水平

圖4 各組大鼠血清中mt-p53蛋白表達水平

圖5 各組大鼠滑膜組織中IL-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖6 各組大鼠血清中IL-12蛋白表達水平

3 討論

RA 在中醫(yī)屬“痹病”范疇，傳統(tǒng)中醫(yī)認為，本病的發(fā)生發(fā)展是由于人體正氣不足、衛(wèi)外不固，風(fēng)寒濕熱等外邪乘虛而入，留置經(jīng)脈關(guān)節(jié)，引起關(guān)節(jié)、筋骨疼痛、腫脹。古代醫(yī)家對本病病因的認識包括內(nèi)因、外因兩個方面。內(nèi)因主要是正氣不足，正氣不足是導(dǎo)致RA 發(fā)病的決定性內(nèi)在作用，機體正氣不足，則外來風(fēng)寒濕熱之邪乘虛侵襲經(jīng)絡(luò)、關(guān)節(jié)、肌肉、四肢等?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云：“正氣存內(nèi)，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，因此“正虛”才是本病發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。外因包括飲酒當(dāng)風(fēng)，冒雨涉水，或久居濕地等，則寒濕、濕熱等外邪乘虛入侵，壅滯經(jīng)絡(luò)、關(guān)節(jié)，導(dǎo)致疾病發(fā)生。故感受外邪是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。邪盛正虛，內(nèi)外因合，發(fā)為此病。

近代醫(yī)家對痰濁、瘀血互結(jié)致病頗為重視。宋代醫(yī)家陳無擇在《敘痹論》中提到：“榮衛(wèi)不清，氣血敗濁，凝結(jié)而成”。清代喻昌《醫(yī)門法律》曰：“風(fēng)寒濕三痹之邪，每借人胸中之痰為相援”。故痰濁留竄骨節(jié)經(jīng)絡(luò)，閉阻氣血，凝而為痹。清代王清任在《醫(yī)林改錯》中也有“瘀血致痹”說。痰濁和瘀血既是機體在病邪作用下的病理產(chǎn)物，又是機體進一步病變的因素。本病日久，痰濁和瘀血互結(jié)，以致病情纏綿難愈，出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大變形僵硬，皮下結(jié)節(jié)，肢體麻木，病處固定而拒按，日輕夜重，局部腫脹或有硬結(jié)，口干不欲飲，舌質(zhì)紫黯或有瘀斑，舌下靜脈迂曲延長，脈細澀等證。

RA 顯著地病理變化為滑膜增生：滑膜層增多，由正常的3～5 層增厚到10～20 層且以襯里層細胞異常增生最為明顯[2]，成纖維樣滑膜細胞是其主要的增殖細胞，同時也是滑膜組織中促炎性細胞因子及基質(zhì)降解酶的主要來源，其具有自主增生、無錨定生長、缺乏接觸抑制和表達原癌基因等腫瘤細胞的生長特點。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，RA 關(guān)節(jié)滑膜中成纖維細胞過度增殖與p53 基因突變有關(guān)[12]。p53 是一種腫瘤抑制基因，在人體存在兩種表達形式：野生型（wild type p53，wt-p53）與mt-p53。wt-p53 可以急速機體受損的DNA 或異常增殖的癌基因細胞凋亡。mt-p53 蛋白是wt-p53 基因發(fā)生突變后表達的蛋白，因分子構(gòu)象發(fā)生變化而半衰期延長，mt-p53 不僅失去了促細胞凋亡等能力，還可干擾wt-p53 基因的功能[13]。而在RA患者關(guān)節(jié)滑膜中發(fā)現(xiàn)wt-p53 功能喪失。在AA 大鼠模型中，mt-P53 通過調(diào)控細胞周期，影響FLS 的凋亡[14]。mt-P53 通過NF-KB 途徑，介導(dǎo)MMP-9 表達，參與細胞外基質(zhì)降解及關(guān)節(jié)軟骨破壞[15]。APRIL 是腫瘤壞死因子配體家族成員，主要由單核細胞、巨噬細胞、B 細胞、T 細胞產(chǎn)生。APRIL通過與相應(yīng)受體結(jié)合，促進腫瘤的形成、增殖及存活，同時參與機體的炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等[16]。在RA患者的血清中出現(xiàn)高表達的APRIL。APRIL刺激RA 患者通過FLS 產(chǎn)生白細胞介素-1β（Lnterleukin1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNFα）、以及IL-6，加速局部炎癥反應(yīng)。同時異常增殖的FLS 能夠分泌APRIL，進一步通過刺激信號加速T 細胞活化，形成正反饋[17]。此外，RA 患者滑膜中的FLS產(chǎn)生APRIL，并與其受體結(jié)合，通過自分泌和旁分泌的形式，促進FLS 增殖，通過細胞網(wǎng)絡(luò)的相互作用，加速T 細胞活化，形成正反饋[18]。IL-2 是一種活化并維持T 細胞分化和增殖的生長因子，參與炎癥和自身免疫性反應(yīng)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者血清中IL-2、TNF-a及白細胞介素-13（Lnterleukin13，IL-13）均明顯升高，且與RA 疾病活動度密切相關(guān)[20]。中藥能夠降低CIA模型大鼠血清中IL-2、TNF-a 及IL-1 表達水平，改善大鼠關(guān)節(jié)腫脹度[21]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TMD 能夠改善通過激活PPARr/NF-ΚB 途徑，抑制IL-6、TNF-α等炎性因子表達[5]，還能夠激活TRAF3，抑制NF-ΚB 入核，改善CIA大鼠免疫炎性損傷[6]。因此，TMD 改善CIA 模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)是明確的，結(jié)合當(dāng)前研究熱點，我們設(shè)計了本次實驗，目的是探究TMD 是否能夠抑制關(guān)節(jié)滑膜過度增殖，減少關(guān)節(jié)局部滑膜免疫炎性細胞過度聚集，進而改善關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)局部免疫炎性反應(yīng)？本研究發(fā)現(xiàn)，CIA 模型大鼠滑膜組織中mt-P53、APRIL、IL-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及mt-P53、IL-2mRNA 蛋白表達水平明顯高于正常組，提示mt-P53、APRIL 參與關(guān)節(jié)滑膜免疫炎性損傷，與相關(guān)文獻報道一致。經(jīng)TMD 干預(yù)后，各劑量組APRIL mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，IL-2、mt-P53mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平顯著下調(diào)，表明TMD 能夠抑制mt-P53、IL-2、APRIL 表達水平。因此，我們認為TMD 能夠降低大鼠關(guān)節(jié)滑膜、血清中mt-P53、IL-2、APRIL 表達水平，改善關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜免疫炎性損傷，可能與TMD 抑制關(guān)節(jié)滑膜過度增殖，降低炎癥因子的表達有關(guān)。相關(guān)研究將進一步進行。