枸杞丹參對RCS大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2、Bid表達的影響＊

彭 俊，王 英，蔣鵬飛，劉家琪，潘 坤，周亞莎，徐 劍，彭清華1，

（1. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 長沙 410007；2. 湖南中醫(yī)藥大學 長沙 410208；3. 中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室 長沙 410208）

原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性（Retinitsi Pigmentosa，RP）是一組以進行性光感受細胞及視網(wǎng)膜色素上皮功能喪失為共同表現(xiàn)的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病，本病以夜盲、進行性視野損害、眼底色素沉著和視網(wǎng)膜電圖異常或者無波形為主要臨床特征[1]，中醫(yī)稱為“高風內障”。本研究選擇皇家外科學院大鼠（Royal College of Surgeons rat，RCS）灌胃建模，通過免疫組化、RT-PCR、WB 檢測Bcl-2、Bid 表達，在抗細胞線粒體凋亡途徑層面上探討枸杞、丹參對RP 模型大鼠RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠的干預效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠，32 只，雌性、雄性均16只，質量140-160 g，鼠齡28-42 d，空白對照：RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠8 只，鼠齡28-42 d（并與RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠鼠齡匹配），雌性、雄性各4只，質量200-240 g。昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司提供，SPF 級。 質 量 合 格 證 號：NO. 201512444，NO.201600559。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF 房，室溫22℃± 2℃，濕度50%-55%，定期更換墊料，自由飲食。

1.1.2 實驗藥品

枸杞子中藥配方顆粒，每袋裝3.0 g（相當于臨床使用量飲片10 g），生產(chǎn)廠家：廣東一方制藥有限公司，許可證號：粵20110214，產(chǎn)品批號：5103761。丹參中藥配方顆粒，每袋裝1.8 g（相當于臨床使用量飲片10 g），生產(chǎn)廠家：廣東一方制藥有限公司，產(chǎn)品批號：5100631。

1.1.3 實驗試劑

苯巴比妥鈉（湖南中醫(yī)藥大學病理實驗室提供）、4%多聚甲醛（湖南中醫(yī)藥大學病理實驗室提供）、Harris 蘇木素（北京中杉金橋生物技術公司提供）、二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司提供）、DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司提供）、3%過氧乙酸（北京中杉金橋生物技術公司提供）、Bcl-2 抗體（武漢博士得生物工程有限公司提供）、Bid 抗體（武漢博士得生物工程有限公司提供）、APS（美國Sigma公司提供）、SDS（美國Sigma 公司提供）、TEMED（美國Sigma公司提供）。

1.1.4 實驗器材

輪轉石蠟切片機，數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（型號：Motic 6.0），臺式冷凍離心機，熒光定量RCP 儀，熒光PCR板，電泳儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組方法

采用隨機數(shù)字表法將RCS（rdy-/-，p-/-）雌性及雄性大鼠均隨機分為4 組（n=8），分別為：模型組、枸杞組、丹參組和枸杞加丹參組（杞參組）四組，每組雌雄均4 只，共8 只；選擇鼠齡及性別匹配的RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠雌雄各4 只，共8 只：為空白對照組。

1.2.2 動物給藥方法

所有RCS大鼠適應性飼養(yǎng)1周后給予灌胃。藥物及劑量如下：空白組、模型組大鼠以0.9%生理鹽水12 mL/kg 灌胃；枸杞組：10 g 枸杞提取物溶于50 mL 滅菌蒸餾水中，則枸杞濃度為0.2 g/mL，大鼠灌胃劑量為1.08 g/kg·d。（雄性大鼠灌胃量為1.5 mL/d，雌性大鼠為1 mL/d）；丹參組：10 g 丹參提取物溶于40 mL 滅菌蒸餾水中，則丹參濃度為0.25 g/mL，灌胃劑量為1.35 g/kg·d。（雄性大鼠灌胃量為1.5 mL/d，雌性大鼠為1 mL/d）；杞參組：10 g 枸杞及10 g 丹參溶于40 mL 滅菌蒸餾水中，則藥物濃度為0.5 g/mL，大鼠灌胃劑量為2.43 g/kg·d。（雄性大鼠灌胃量為1.5 mL/d，雌性大鼠為1 mL/d）。所有動物給藥劑量按“人-動物體表面積等效劑量比值表”折算，折算系數(shù)W =0.018，折算公式：W ×成人用量（g）/動物體重（kg）。所有RCS（rdy-/-，p-/-）雌性、雄性大鼠及RCS（rdy+/+，p+/+）雌性、雄性大鼠均灌胃28天。

1.2.3 取材方法

取材時相為灌胃第28 天結束后1 天。1%苯巴比妥鈉3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，75%酒精消毒RCS 大鼠雙眼眼瞼周圍，眼科彎組織剪直接分離球周組織，剪斷視神經(jīng)后摘除眼球，置于冰浴的1 ×PBS溶液中清洗眼球周圍血液。解剖顯微鏡視野操作臺區(qū)，光口玻璃皿置于冰塊上，將眼球放于玻璃皿中，眼科顯微剪沿角鞏膜緣剪開，去除眼前節(jié)，小心拭除玻璃體，用眼科顯微鑷子剝離出視網(wǎng)膜組織，保存于-80℃冰箱中，供WB及PCR檢測Bcl-2、Bid表達。

1.3 指標檢測

1.3.1 免疫組化法檢測RCS 大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bid 表達

圖1 RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白組BCL-2

圖2 RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組BCL-2

圖3 RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠枸杞組BCL-2

高倍鏡下觀察Bcl-2、Bid 蛋白的表達情況，判斷標準：免疫組化反應后陽性標記的細胞胞漿著色呈棕色或深棕色。高倍鏡下隨機選取5個視網(wǎng)膜視野，用圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析處理。

1.3.2 RT-qPCR 檢 測RCS 大 鼠 視 網(wǎng) 膜Bcl-2、Bid mRNA表達

1.3.3 Western Blot（WB）法檢測RCS大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bid蛋白相對表達量

剪取100 mg 視網(wǎng)膜組織，用冰預冷PBS 清洗組織，加入125 μL RIPA 裂解液于勻漿器中反復研磨組織直至看不見組織塊；冰上，蛋白裂解30 min；4℃，12000 rpm 離心15 min。（提前開離心機預冷）；將離心后的上清分裝轉移倒0.5 mL 的離心管中，部分用于實驗，多余的存于-20℃；按照BCA 蛋白定量試劑盒（Wellbio）使用說明操作，測定蛋白濃度。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 23.0分析實驗數(shù)據(jù)，根據(jù)不同的數(shù)據(jù)特點采用不同的檢驗法：計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，兩組比較，如果滿足正態(tài)及方差齊性，采用成組t檢驗，不滿足者采用秩和檢驗；多組比較，滿足正態(tài)及方差齊性，采用ANOVA（LDS）分析，不滿足者采用秩和檢驗。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RCS大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bid免疫組化結果

2.1.1 RCS大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白

RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白組：視網(wǎng)膜全層厚度正常，神經(jīng)節(jié)纖維層，內、外核層等各層以及視網(wǎng)膜色素上皮層結構排列有序，形態(tài)規(guī)則。視網(wǎng)膜上Bcl-2蛋白陽性表達較少，視網(wǎng)膜各層散在可見（圖1）。

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組：大鼠視網(wǎng)膜明顯較RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠視網(wǎng)膜各層結構紊亂萎縮變薄，尤其以外層視網(wǎng)膜變化顯著。病變主要位于視網(wǎng)膜外層，視錐、視桿細胞萎縮變性。視網(wǎng)膜HE 染色圖片上，視網(wǎng)膜色素上皮條帶的連續(xù)性破壞，大部分RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠視網(wǎng)膜色素上皮條帶喪失。視網(wǎng)膜外層結構紊亂變薄，部分外核層光感受器感覺纖毛層完全萎縮消失，光感受器細胞核數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則，小部分區(qū)域核染色集聚成團，大部分區(qū)域未見外層光感受器細胞核染色。脈絡膜組織空泡現(xiàn)象增多。視網(wǎng)膜內層組織可見少量點狀黑色素顆粒。視網(wǎng)膜上Bcl-2蛋白陽性表達非常少。見下圖2。

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠枸杞組：RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞組脈絡膜空泡現(xiàn)象較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠減少。其余RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結構同RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠結構類似。視網(wǎng)膜上Bcl-2 蛋白陽性表達較RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組略多。見圖3。

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠丹參組：RCS（rdy-/-，p-/-）丹參組大鼠脈絡膜空泡現(xiàn)象較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠減少。其余RCS（rdy-/-，p-/-）丹參組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結構同RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠結構類似。視網(wǎng)膜上Bcl-2 蛋白陽性表達較RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組略多。見圖4。

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠枸杞加丹參組：RCS（rdy-/-，p-/-）杞參組大鼠視網(wǎng)膜厚度明顯較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠視網(wǎng)膜厚度增加，視網(wǎng)膜色素上皮條帶部分可見，部分外核層光感受器感覺纖毛層部分可見，光感受器細胞核數(shù)目較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組多。脈絡膜組織空泡現(xiàn)象較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠減少。視網(wǎng)膜上Bcl-2 蛋白陽性表達較RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組明顯增多。見圖5。

圖4 RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠丹參組BCL-2

圖5 RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠杞參組BCL-2

2.1.2 RCS大鼠視網(wǎng)膜Bid蛋白

RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白組：視網(wǎng)膜全層厚度正常，神經(jīng)節(jié)纖維層，內、外核層等各層以及視網(wǎng)膜色素上皮層結構排列有序，形態(tài)規(guī)則。視網(wǎng)膜組織上Bid 蛋白陽性表達少量散在可見，視網(wǎng)膜各層可見。見下圖6。

圖6 RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白組Bid

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組：大鼠視網(wǎng)膜明顯較RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠視網(wǎng)膜各層結構紊亂萎縮變薄。病變主要位于視網(wǎng)膜外層，視錐、視桿細胞萎縮變性。視網(wǎng)膜HE染色圖片上，視網(wǎng)膜色素上皮條帶的連續(xù)性破壞，大部分RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠視網(wǎng)膜色素上皮條帶喪失。視網(wǎng)膜外層結構紊亂變薄，部分外核層光感受器感覺纖毛層完全萎縮消失，光感受器細胞核數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則，小部分區(qū)域核染色集聚成團，大部分區(qū)域未見外層光感受器細胞核染色。脈絡膜組織空泡現(xiàn)象增多。視網(wǎng)膜內層組織可見少量點狀黑色素顆粒。視網(wǎng)膜上Bid 蛋白陽性表達大量可見，視網(wǎng)膜各層可見，以視網(wǎng)膜外層為主。見下圖7。

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠枸杞組：RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞組脈絡膜空泡現(xiàn)象較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠減少。其余RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結構同RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠結構類似。視網(wǎng)膜上Bid 蛋白陽性表達較RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組略少。見圖8。

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠丹參組：RCS（rdy-/-，p-/-）丹參組大鼠脈絡膜空泡現(xiàn)象較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠減少。其余RCS（rdy-/-，p-/-）丹參組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結構同RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠結構類似。視網(wǎng)膜上Bid 蛋白陽性表達較RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組略少。見圖9。

RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠枸杞加丹參組：RCS（rdy-/-，p-/-）杞參組大鼠視網(wǎng)膜厚度明顯較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠視網(wǎng)膜增厚，視網(wǎng)膜色素上皮條帶部分可見，部分外核層光感受器感覺纖毛層部分可見，光感受器細胞核數(shù)目較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組多。脈絡膜組織空泡現(xiàn)象較RCS（rdy-/-，p-/-）模型組大鼠減少。視網(wǎng)膜上Bid 蛋白陽性表達較RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組明顯減少。但較RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白對照組多。見圖10。

2.2 各組RCS大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、BidmRNA表達情況

2.2.1 RCS 大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bid 擴增曲線及熔解曲線

RCS 大鼠視網(wǎng)膜組織Bcl-2mRNA、BidmRNA、actinmRNA 擴增曲線分別見圖11、圖12、圖13。RCS大鼠視網(wǎng)膜組織BCL-2mRNA、BidmRNA、actinmRNA熔解曲線分別見圖14、圖15、圖16。

2.2.2 灌胃后各組視網(wǎng)膜組織Bcl-2mRNA 相對表達量

RCS 大鼠各組灌胃后視網(wǎng)膜組織Bcl-2mRNA 相對表達量各組數(shù)據(jù)輸入SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析，RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞加丹參組大鼠視網(wǎng)膜組織Bcl-2mRNA 相對表達量為1.08594617±0.650080305，明顯高 于RCS（rdy-/- ，p-/-）模 型 組0.40991731 ±0.497733621，行單因素ANOVA LSD 檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（aP=0.015＜0.05）。且RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞加丹參組大鼠視網(wǎng)膜組織Bcl-2mRNA 相對表達量更接近RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白對照組。結果見表1、表2、圖17。

圖7 RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠模型組Bid

圖8 RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠丹參組Bid

圖9 RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠丹參組Bid

圖10 RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠杞參組Bid

圖11 Bcl-2mRNA擴增曲線

圖12 BidmRNA擴增曲線

圖13 actinmRNA擴增曲線

圖14 Bcl-2mRNA熔解曲線

圖15 BidmRNA熔解曲線

圖16 actinmRNA熔解曲線

2.2.3 灌胃后各組視網(wǎng)膜組織BidmRNA相對表達量

RCS 大鼠各組灌胃后視網(wǎng)膜組織BidmRNA 相對表達量各組數(shù)據(jù)輸入SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行分析，RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞加丹參組大鼠視網(wǎng)膜組織BidmRNA 相對表達量為0.16235322 ± 0.265151076，明顯低于RCS（rdy-/-，p-/-）模型組0.51595146 ±0.370461223，行單因素ANOVA LSD 檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（aP=0.034＜0.05）。且RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞加丹參組大鼠視網(wǎng)膜組織BidmRNA 相對表達量更接近RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白對照組。結果見表3、表4、圖18。

表1 各組灌胃后視網(wǎng)膜組織BCL-2mRNA相對表達量平均值

表2 BCL-2mRNA相對表達量方差齊性檢驗

圖17 灌胃后各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2mRNA相對表達量比較箱圖

表3 各組灌胃后視網(wǎng)膜組織BidmRNA相對表達量平均值

表4 BidmRNA相對表達量方差齊性檢驗

圖18 灌胃后各組大鼠視網(wǎng)膜BidmRNA相對表達量比較箱圖

2.3 各組RCS 大鼠視網(wǎng)膜WB 檢測Bcl-2、Bid 蛋白表達情況

Western blot 分析顯示，分別在蛋白相對分子質量為21KD、30KD、42KD 處有表達帶，分別為Bid 蛋白、Bcl-2蛋白和β-actin蛋白的表達（如下圖19）。

圖19 視網(wǎng)膜組織中Bid、Bcl-2、Actin蛋白的表達強度

2.3.1 WB 檢測各組RCS 大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2 蛋白表達情況

RCS 大鼠灌胃后WB 檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 蛋白相對表達量，所有數(shù)據(jù)在SPSS23.0 統(tǒng)計軟件中分析，RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞加丹參組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白相對表達量0.7425±0.11055，明顯高于RCS（rdy-/-，p-/-）模型組0.4588 ± 0.12733，差異有明顯統(tǒng)計學意義（aP= 0.000＜0.01）；RCS（rdy+/+，p+/+）空白對照組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2 蛋白相對表達量0.6075 ± 0.12635，明顯高于RCS（rdy-/-，p-/-）模型組0.4588±0.12733，差異有統(tǒng)計學意義（bP=0.007＜0.01）。且RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞加丹參組視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 蛋白相對表達量為0.7425±0.11055 接近RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白對照組視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 蛋白相對表達量為0.6075±0.12635。WB 檢測Bcl-2 蛋白相對表達量結果與前一部分PCR 檢測Bcl-2mRNA結果吻合。結果提示：用藥物干預后各組Bcl-2 蛋白相對表達量均有所上升，枸杞丹參能有效促進視網(wǎng)膜組織中抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表達?？紤]枸杞丹參減輕視網(wǎng)膜色素變性疾病時視網(wǎng)膜細胞凋亡與增加視網(wǎng)膜組織中抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表達有關。結果見表5、表6、圖20。

表5 各組灌胃后視網(wǎng)膜組織Bcl-2蛋白相對表達量平均值

表6 Bcl-2mRNA相對表達量方差齊性檢驗

圖20 WB檢測各組RCS大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2相對含量比較箱圖

表7 WB檢測各組灌胃后視網(wǎng)膜組織Bid蛋白相對表達量平均值

表8 BidmRNA相對表達量方差齊性檢驗

2.3.2 WB 檢測各組RCS 大鼠視網(wǎng)膜Bid 蛋白表達情況

RCS 大鼠灌胃后WB 檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 蛋白相對表達量，所有數(shù)據(jù)在SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件中分析，RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞加丹參組視網(wǎng)膜Bid蛋白相對表達量為0.4638 ± 0.05041，低于RCS（rdy-/-，p-/-）模型組0.6400±0.09666，差異有明顯統(tǒng)計學意義（cP= 0.000＜0.01）；RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞組視網(wǎng)膜Bid 蛋白相對表達量為0.4663 ± 0.07615，低于RCS（rdy-/-，p-/-）模型組0.6400±0.09666，差異有明顯統(tǒng)計學意義（aP= 0.001＜0.01）；RCS（rdy-/-，p-/-）丹參組視網(wǎng)膜Bid 蛋白相對表達量為0.5438 ±0.10501，低 于RCS（rdy-/-，p-/-）模 型 組0.6400 ±0.09666，差異有明顯統(tǒng)計學意義（bP= 0.000＜0.01）；且RCS（rdy-/-，p-/-）枸杞加丹參組視網(wǎng)膜Bid 蛋白相對表達量0.4638 ± 0.05041 更接近RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠空白對照組視網(wǎng)膜Bid 蛋白相對表達量0.3550±0.05831。WB 檢測Bid 蛋白相對表達量結果與前一部分PCR 檢測BidmRNA 結果吻合。結果提示：用藥物干預后各組促進線粒體凋亡途徑的關鍵蛋白Bid 蛋白相對表達量均有所下調，枸杞丹參能有效減少Bid 的表達，考慮枸杞丹參減輕視網(wǎng)膜色素變性疾病時視網(wǎng)膜細胞凋亡與減少Bid的表達有關。結果見表7、表8、圖21。

3 討論

原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性（RP）是一組遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病，大多數(shù)RP 患者在青少年發(fā)病，通常視網(wǎng)膜病變中周部開始，逐漸向后極部黃斑區(qū)進展。據(jù)報道，全球RP 的患病率是1/3000-7000，全世界大約有150 萬RP 患者進行性視功能損害[2]。在RP 發(fā)病后的幾十年，病情逐步進展，視野進行性縮窄，影響中心視力，最終導致嚴重失明，影響生活和工作。原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性與很多神經(jīng)變性疾病一樣，位于視網(wǎng)膜結構中的感光細胞死亡的最終共同路徑為程序化死亡。

圖21 WB檢測各組RCS大鼠視網(wǎng)膜組織中Bid相對含量比較箱圖

細胞調亡（Apoptosis）是指機體為了維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡。細胞調亡是細胞受到機體生理性信號刺激以及內外環(huán)境條件的變化或損傷所作出的主動應答產(chǎn)生有序變化的死亡過程。目前，發(fā)現(xiàn)的細胞調亡途徑主要分為三種：死亡受體途徑、內質網(wǎng)途徑和線粒體途徑。死亡受體途徑又稱為外源性途徑即膜受體途徑，是各種導致細胞調亡的剌激，如病毒、細菌毒素、理化因素等，激活細胞膜表面的死亡受體，將調亡信號傳導到細胞內，啟動蛋白酶系統(tǒng)，從而引發(fā)細胞的凋亡；內質網(wǎng)途徑機制主要包括內質網(wǎng)應激誘導凋亡、內質網(wǎng)鈣離子誘導凋亡、內質網(wǎng)凋亡底物介導的凋亡；線粒體途徑是內源性途徑的主要一條，內源性途徑的凋亡是由細胞內的損傷開始的，而線粒體是內源性程序化死亡信號傳導途徑中起關鍵調節(jié)作用的細胞器，線粒體是細胞能量代謝的中心，因此細胞凋亡過程中對線粒體損傷的最直接結果是其正常功能的喪失，線粒體功能障礙可以導致自由基產(chǎn)生增加、鈣離子超載、興奮性氨基酸釋放增多引起細胞凋亡，還可直接誘導細胞凋亡。線粒體的能量儲備在其中起決定性的作用，如果損傷程度相對輕微，ATP 保留以提供細胞凋亡所需的能量，則發(fā)生凋亡。

線粒體途徑凋亡機制主要是線粒體上游信號分子作用于線粒體膜，例如Bcl-2 蛋白家族活化形成蛋白通道，線粒體PT 孔開放，凋亡活性物質釋放引起下游Caspase 家族蛋白活化并作用于相應底物引起細胞凋亡[3]。Bcl-2 是B 細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2）的縮寫，是最早研究的與凋亡有關的一類重要的原癌基因，在凋亡的過程中，Bcl-2 起到了重要的作用。而Bcl-2 基因家族成員在細胞凋亡的線粒體途徑中扮演著關鍵角色。這類基因家族在結構上，有一個或者多個Bcl-2 同源（Bcl-2 Homology，即BH）區(qū)域，并依此結構分為2 類：抗細胞凋亡成員（如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1 和A1），降低線粒體外膜通透性，抑制Cyt C 的釋放，在細胞存活中起著決定性作用；促凋亡成員（如Bax、Bak 和Bok）和只含有一個BH3 區(qū)域的前凋亡蛋白（如Bid、Bad、Bik、Bim和Hrk），增加線粒體外膜通透性，有利于釋放Cyt c，是細胞死亡必需的成分。迄今為止，已在線蟲、病毒和哺乳動物等機體中發(fā)現(xiàn)了20 多個Bcl-2 家族成員，這些家族成員一個最顯著的特征就是具有Bcl-2 同源結構域（Bcl-2 homolog domain，BH），一些家族蛋白還有BH1 至BH4 結構域，還有一些則只有一個或者幾個這樣的結構域。正是由于結構域組成上的差異，使Bcl-2 家族成員具有了不同的生物學功能。典型的抗凋亡成員有Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1 等，這類Bcl-2 家族成員具有抗凋亡活性，可使細胞免于死亡。這些抗凋亡因子的共同特征就是含有完整的四個保守BH 結構域（BH1、BH2、BH3、BH4）和一個疏水的C 端尾狀結構，即膜結構域。另一類Bcl-2家族的成員的最顯著特性就是缺少BH4結構域并且包含BH3 結構域。它們均具有促凋亡活性，這類成員主要包括Bax、Bid 和Bak 等。BH3 是細胞凋亡的關鍵性結構域，Bid是Bcl-2家族中僅有BH3區(qū)域的促凋亡蛋白。在凋亡進程之前，Bid 蛋白非常均勻的分布于整個細胞質內，但當?shù)蛲鲩_始啟動后，Bid 被凋亡通路中激活的caspase-8 切割為具有活性的tBid，從而參與線粒體通路的促凋亡效應，tBid 向線粒體的轉運增加了線粒體膜的通透性，同時Bid還可以促進Bax向線粒體膜的插入和多聚體的形成。大量研究[4-7]證實，Bcl-2與Bid 亦參與了視網(wǎng)膜色素變性疾病視網(wǎng)膜細胞凋亡過程。

彭清華教授通過大量的臨床觀察和機理研究，證實本病雖以虛為本，但以實（瘀）為標，在其病理過程中自始至終貫穿著血瘀病理[8-15]。RP 患者為本虛夾瘀之證，臨床多見虛中夾瘀證型，亦可分為陰虛夾瘀、陽虛夾瘀證型。治療方面，基于虛中夾瘀病機，提出了“補虛活血”法來治療視網(wǎng)膜色素變性疾病。補虛活血主要用枸杞、丹參兩味中藥。枸杞性平，歸肝腎經(jīng)?？勺萄a肝腎、益精明目，治療肝腎陰虛證所致的視力減退、內障目昏。《本草經(jīng)集注》曰：“補益精氣，強盛陰道?！薄端幮哉摗酚涊d枸杞：“補益精，諸不足，明目……”枸杞含有多種化學成分，包括糖類、氨基酸、微量元素、超氧化物歧化酶、生物堿類、無機鹽及其他有機物等。其中，枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）是其主要化學成分。LBP 具有免疫促進及免疫調節(jié)作用，抗氧化、抗衰老作用，抗腫瘤作用、降血糖降血脂作用，具有保護生殖系統(tǒng)的作用[16]。研究表明，LBP 還具有抗疲勞、抗輻射、降血壓和促進發(fā)育等作用[17]。丹參善長通行血脈，祛瘀止痛，常用治各種瘀血病證?！侗静荼阕x》曰：“丹參，能祛瘀以生新?！眱伤幒嫌霉沧嘁婺I養(yǎng)肝、活血明目之功，主治肝腎陰虛、瘀血阻絡所致的視網(wǎng)膜色素變性。丹參在心血管疾病領域應用十分廣泛，現(xiàn)代藥理研究其具有內皮修復作用、抗血小板抗凝、擴張冠脈，改善微循環(huán)作用、抗動脈粥樣硬化、抗炎、保護受損心肌、抗心律失常、調節(jié)脂質代謝等作用[18]。丹參具有明顯的抗凝血作用，其有效成分丹參酮類化合物在心血管方面具有抑制血小板聚集和抗血栓形成等作用，并且丹參酮類具有擴張血管，改善微循環(huán)作用[19]。

經(jīng)多年臨床實踐及前期科學研究證實，對于肝腎陰虛、瘀血阻絡等所致的虛中夾瘀證視網(wǎng)膜色素變性。枸杞加丹參兩藥合用共奏益腎養(yǎng)肝、活血明目之功，對視網(wǎng)膜色素變性患者視功能有保持和恢復的效果。故本研究采用視網(wǎng)膜色素變性經(jīng)典動物模型RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠為主要研究對象，在補虛活血原則指導下，給予補虛活血代表藥物枸杞丹參灌胃治療。從檢測視網(wǎng)膜Bcl-2、Bid 表達為切入點，在抗細胞凋亡層面上，通過動物實驗，采用隨機對照的方法，研究枸杞、丹參對虛中夾瘀證視網(wǎng)膜色素變性干預作用及相應的作用環(huán)節(jié)。研究結果顯示枸杞、丹參能減輕視網(wǎng)膜色素變性病變時有害因素導致的視網(wǎng)膜細胞凋亡，促進抗細胞凋亡因子Bcl-2表達，以及減少介導線粒體凋亡途徑的Bid 表達，從而保護了視錐、視桿感光細胞，減少視網(wǎng)膜感光及神經(jīng)細胞凋亡，保護視功能。

綜上所述，以枸杞丹參為代表藥的“補虛活血”法治療原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性的分子生物學機制，在抗線粒體凋亡途徑方面，考慮為枸杞丹參上調RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠視網(wǎng)膜抑制凋亡的Bcl-2 表達并下調介導線粒體凋亡途徑的Bid 表達，從而減輕視網(wǎng)膜色素變性經(jīng)典動物模型RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠視網(wǎng)膜感光及神經(jīng)細胞凋亡，起到保護視功能作用。