新蒲飲聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑對幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃炎中TLR-2/MyD88/NF-κB信號通路的影響＊

胡藝麗，金小晶，劉智群，李媛媛，楊 勤

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇 210046；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院 江蘇 210001）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一種革蘭陰性、嗜微氧的細(xì)菌，它可以在人胃中定植并具有持續(xù)感染性，是造成慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤和胃癌等消化道疾病的最常見致病因素[1-2]，據(jù)統(tǒng)計幾乎全球半數(shù)以上的人口都存在幽門螺桿菌感染，并且在近幾年幽門螺桿菌的感染率仍保持升高趨勢，因此，根除幽門螺桿菌是預(yù)防和治療消化道疾病的關(guān)鍵所在。目前美國胃腸病學(xué)學(xué)院（ACG）提出，在克拉霉素耐藥性低于15%的地區(qū)，建議將含克拉霉素的三聯(lián)療法（14天）作為一線治療方案，而耐藥性較高的地區(qū)，建議使用含鉍四聯(lián)療法為一線治療方案。據(jù)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計可知全球的克拉霉素耐藥率幾乎都到達(dá)了應(yīng)用的臨界點(diǎn)[3]。在我國四聯(lián)療法為一線殺幽方案，這種殺幽方案不被推薦應(yīng)用于部分老人、孕婦及哺乳期人群，因為其副反應(yīng)太大。例如含鉍劑的四聯(lián)療法具有致畸可能，可能會抑制骨生長、導(dǎo)致牙齒變色，因此孕婦及哺乳期患者禁用[4]；一項針對60歲以上幽門螺桿菌感染患者的研究表明，較高劑量抗生素的使用會導(dǎo)致老年人不良反應(yīng)增高[5]。三聯(lián)療法相對于四聯(lián)療法殺幽率有所降低，相對的副反應(yīng)也稍減少，但是仍然存在。例如三聯(lián)療法中的克拉霉素會增加妊娠早期流產(chǎn)風(fēng)險[4]，同時抗生素的使用會導(dǎo)致耐藥性增高，容易引起人類腸道微生物群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起與之相關(guān)的腹瀉、艱難梭菌感染等癥狀[6-7]?？偟膩碚f，目前以西藥為主根除幽門螺桿菌的治療方案都存在副反應(yīng)大，安全性降低等弊端，長期使用必定會造成耐藥性升高，根除率降低，再感染率上升[8-9]等結(jié)果。隨著應(yīng)用人群以及次數(shù)的增加，這些問題日后必定更加顯露。而為了解決這些問題，可能需要通過增加抗生素的用量或種類，但這同時也會增加副反應(yīng)以及其他疾病發(fā)生的風(fēng)險，因此尋找新的殺幽方案迫在眉睫。

目前，中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合方案治療幽門螺桿菌感染成為研究熱點(diǎn)，梁藝鐘等將自擬的清胃祛濕方與常規(guī)西藥三聯(lián)療法相對比，發(fā)現(xiàn)中藥方對幽門螺桿菌的根除率更高，臨床有效率也更加顯著，此外中藥方還能夠增加血清表皮生長因子EGF 以及胃蛋白酶原PG的含量，起到保護(hù)胃粘膜的作用[10]；張偉等應(yīng)用半夏瀉心湯治療慢性胃炎伴幽門螺桿菌感染，發(fā)現(xiàn)其根除率高達(dá)95.65%（44/46），總有效率91.30%（42/46）[11]。張嘉璐等認(rèn)為中藥與質(zhì)子泵抑制劑（PPIs）等西藥制劑聯(lián)用具有協(xié)同作用，可能會成為根除幽門螺桿菌的新出路[12]。新蒲飲是由南京市中醫(yī)院已故院長傅宗翰老先生創(chuàng)制的名方青蒲飲化裁而來。在前期的課題中，課題組臨床研究表明新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑?qū)τ拈T螺桿菌的根除率高達(dá)67.3%，臨床總有效率為91.5%，治療后癥狀積分為2.09 ± 2.42；而西藥三聯(lián)幽門螺桿菌根除率為62.7%，臨床總有效率為77.1%，治療后癥狀積分為4.61±5.236，這說明新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑在根除幽門螺桿菌、臨床總有效率、改善臨床癥狀等方面具有顯著優(yōu)勢[13,14]。為了進(jìn)一步研究新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑治療幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃炎的療效及可能機(jī)制，課題組開展了此次的基礎(chǔ)研究。

本實驗采用幽門螺桿菌菌液灌胃造模法，采取雙重診斷（快速尿素酶及Gimse染色）確定幽門螺桿菌感染情況。通過給予小鼠模型新蒲飲、新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑，西藥三聯(lián)治療后，測定胃組織中TLR-2、MyD88、NF-κB 以及血清中TNF-α、IL-1β的水平，進(jìn)而探討TLR-2/MyD88/NF-κB信號通路、炎癥因子TNF-α、IL-1β在幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃炎中可能發(fā)揮的作用以及新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑治療幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃炎的可能機(jī)制，為臨床治療幽門螺桿菌感染提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料

1.1 動物品系及菌株

6-8 周C57BL/6 小鼠，SPF 級，體重約（20 ± 2）g，共50 只，雌雄各半。由江蘇省中醫(yī)院藥理實驗室所購，實驗單位使用許可證號（SYXΚ（蘇）2017-0069）。幽門螺桿菌悉尼菌株SS1系南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省人民醫(yī)院惠贈，-80℃冰箱保存。小鼠造模、組織取材于江蘇省中醫(yī)院藥理實驗室，指標(biāo)測定于江蘇省人民醫(yī)院。

1.2 藥物與試劑

奧美拉唑腸溶膠囊（批號H10950086 常州四藥制藥有限公司20 mg）；阿莫西林膠囊（批號H20003263珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司500 mg）；克拉霉素分散片（批號H9990376揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司250 mg）。新蒲飲方（大血藤30 g，仙鶴草30 g，黃連9 g，蒲公英20 g，百合30 g，木香10 g，連翹10 g，炙甘草20 g，黃柏6 g，檳榔10 g；中藥鑒定人：頓文亮，職稱：副主任藥師，單位：南京市中醫(yī)院臨床藥學(xué)）購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中醫(yī)院。用蒸餾水將新蒲飲方煎成新蒲飲藥液，再用濃煎機(jī)將其濃縮為1.5 g原生藥·1 mL-1的藥液，于4℃冰箱保存使用。

Anti-TLR2 antibody（批號：666451 武漢三鷹公司）、Anti-MyD88 antibody（批號：232301 武漢三鷹公司）、Anti-NF-κB antibody（批號：MAB72261 美國R&D公司）、Anti- IκK-a antibody（批號：AF3768 美國R&D公司）、Anti- p-IκB-a antibody（批號：MAB3768 美國R&D公司）。

1.3 儀器

蔡司倒置顯微鏡（型號：Primovert，Cari Zeiss 公司）、恒溫培養(yǎng)箱（型號：HWS-250，上海精宏公司）、超凈臺（型號：VS，AIRTECH 公司）、制冰機(jī)（型號：SIMF40AY-PC，日本松下公司、酶標(biāo)儀（型號：ND5000，北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司）、天平（型號EX125ZH，OHAUS 公司）、烘箱（型號MDL115 德國Binder 公司）、渦旋混勻器（型號：VORTEX3，德國IΚA公司）、定軌搖床（型號：ΚD-HBC，科迪公司）、離心機(jī)（型號：ST 40，賽默飛公司）、電泳儀（型號：SC12 北京，cavoy 公司）、電泳槽（型號：i12，上海BIO-RAD 公司）、實時熒光定量PCR 儀（型號：StepOnePlusReal-Time PCR，賽默飛公司）、全自動成像分析儀（型號：Alphalmager HP，美國PS公司）。

2 方法

2.1 幽門螺桿菌培養(yǎng)、菌液制備及藥液制備

前期制備7%瓊脂羊血培養(yǎng)基（材料：哥倫比亞培養(yǎng)基、選擇性抗生素、無菌脫纖維養(yǎng)血、選擇性抗生素），將菌株SS1系復(fù)蘇后接種其中。之后將培養(yǎng)基放回37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在微需氧條件下（10%CO2、5%O2、85%NO2）24 h換氣一次，共培養(yǎng)72 h。經(jīng)快速尿素酶鑒定后，將菌落刮下溶于搖菌液中，制成幽門螺桿菌菌液。酶標(biāo)儀計測定菌液濃度，當(dāng)其測定的OD550值在4.8-8.4之間時，菌液濃度約為1*109CFU·ml-1。

2.2 模型制備、分組及給藥

將適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周的50 只健康C57BL/6 小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，即正常組、模型組、新蒲飲組、新蒲飲加PPI組、西藥三聯(lián)組。

西藥三聯(lián)成人每日每次用藥量為：奧美拉唑20 mg，阿莫西林1 g，克拉霉素0.5 g，中藥成人每日每次用藥量為87.5 g/kg。根據(jù)徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學(xué)》[15]可知成人與動物間按體表面積折算的等效劑量比值為0.0026，按單位體重的劑量來算，得出小鼠等效劑量=9.1*成人用藥量（mg·kg-1），換算后小鼠每次用藥量分別為西藥奧美拉唑3 mg·kg-1,阿莫西林150 mg·kg-1，克拉霉素75 mg·kg-1；新蒲飲方13.3 g·kg-1。

除正常組外，剩余各組均按以下方法處理：禁食不禁水24 h后予5%碳酸氫鈉溶液0.3 mL灌胃,30 min后予幽門螺桿菌菌液0.2 mL灌胃，隔天1次，共3次[15]。待4周后從各組抽取兩只（一雄一雌）進(jìn)行快速尿素酶法以及Giemsa染色法檢驗HP定植是否成功。之后開始進(jìn)行藥物干預(yù)，新蒲飲組予新蒲飲方（13.3 g·kg-1）干預(yù)，予新蒲飲+PPI 組予中藥（13.3 g·kg-1）加奧美拉唑（3 mg·kg-1）干預(yù)，西藥三聯(lián)組予奧美拉唑（3 mg·kg-1）+阿莫西林（150 mg·kg-1）+克拉霉素（75 mg·kg-1）干預(yù)，均2/日，持續(xù)2 周。末次給藥4 周后采取摘眼球取血法取小鼠血清，之后處死全部小鼠。沿胃小彎縱軸將部分胃竇部取下做快速尿素酶試驗，余下分為三部分，一部分做Giemsa染色，一部分置于4%多聚甲醛固定備測，一部分放凍存管置于-80攝氏度冰箱備測。

2.3 幽門螺桿菌根除評估方法

各小鼠胃組織做快速尿素酶試驗以及Giemsa 染色，二者HP均為陰性才可判定幽門螺桿菌根除。

2.4 小鼠胃組織形態(tài)學(xué)改變

取材，甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯透化，浸蠟，石蠟包埋，切片，展片，烤片，脫蠟復(fù)水，HE 染色，乙醇再脫水，二甲苯再透明，中性樹脂封片，光鏡檢查。

2.5 免疫組化法檢測TLR2、MyD88、NF-κB水平

石蠟切片脫蠟水化，沖洗，滴加過氧化物酶阻斷溶液，沖洗，滴加非免疫性動物血清，孵育后甩去血清，滴加一抗4℃過夜，PBS 沖洗，滴加二抗，PBS 沖洗,滴加新鮮配制的DAB，沖洗，復(fù)染，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明封片。根據(jù)平均光密度值法分析細(xì)胞核漿中TLR2、MyD88、NF-κB表達(dá)含量,計算核/漿光密度比值。

表1 TLR2、MyD88、NF-κB引物序列

2.6 qRT-PCR 檢 測 胃 粘 膜TLR2、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)

用Trizol 法提取組織RNA，分光光度計檢測RNA濃度計純度，根據(jù)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄體系、PCR 擴(kuò)增體系設(shè)定，最后分析擴(kuò)展曲線與溶解曲線。測試時均做3個復(fù)孔，所測基因均用GAPDH作內(nèi)參，用2-△△CT方法計算目的基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

2.7 Western blot 檢測胃組織TLR2、MyD88、NF-κB、IκK-α、p-IκB-α蛋白表達(dá)

應(yīng)用Wester blot 印跡技術(shù)，以GAPDH 抗體為內(nèi)參，檢測胃組織粘膜TLR2、MyD88、NF-κB、IκK-α、p-IκB-α蛋白表達(dá)。首先制備10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠，然后進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育。最后應(yīng)用凝膠成像儀成像，采用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度，計算各蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值。

2.8 ELISA法定量檢測血清中TNF-α、IL-1β水平

嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書操作，包被抗體，洗滌，加樣，溫育、洗滌、顯色、終止，在波長450-570 nm處測定吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD 值計算各組樣品血清中TNF-α、IL-1β的含量。

2.9 統(tǒng)計方法

應(yīng)用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用Student-Newman-Κeuls（SNΚ）檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

表2 H.pylori根除率(n = 8)

3.1 基本情況

未造模之前，所有小鼠均精神可，善活動，納食飲水正常，二便正常，皮毛光滑有色澤，體重略增長。造模后，除正常組外，各組小鼠飲食減少，精神不佳，少動多臥喜聚，小便黃，大便塘，皮毛粗糙欠光澤，體重不增。給藥干預(yù)以后模型組狀態(tài)無明顯變化,新蒲飲組、新蒲飲+PPI組、西藥三聯(lián)組在予藥物灌胃后精神狀況好轉(zhuǎn)，食欲飲水較前增加，大便不溏，小便淡黃，體重較模型組稍有增長。

3.2 HP定植及胃粘膜病理學(xué)檢查

電鏡下HE 染色胃黏膜病理觀察：與正常組比較，模型組小鼠胃黏膜局部變薄，多為充血腫脹，可見較多的炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，新蒲飲組、新蒲飲+PPI 組及西藥三聯(lián)組胃黏膜局部變薄情況得到改善，少數(shù)有輕度充血水腫，炎性細(xì)胞減少；與新蒲飲比較，新蒲飲+PPI 組及西藥三聯(lián)組胃粘膜炎性病理改變減輕。見圖1（A-E）。Giemsa 染色幽門螺桿菌定植情況：正常組均未觀測到幽門螺桿菌定植，其余組均可見呈深藍(lán)色、棒狀、兩端彎曲的幽門螺桿菌，說明除正常組外其余組幽門螺桿菌均定植成功。見圖2（A1-E1）

3.3 幽門螺桿菌根除率

正常組、模型組、新蒲飲組、新蒲飲+PPI 組、西藥三聯(lián)組尿素酶陰性率分別為100%、0%、50%、75%和87.5%；Giemsa 染色陰性率分別為100%、0%、37.5%、62.5%和75%。綜合兩種檢測方法，幽門螺桿菌根除率結(jié)果分別為:正常組100%，模型組0%,新蒲飲組37.5%,新蒲飲+ PPI 組62.5%，西藥三聯(lián)組75%。見表2。

3.4 免疫組化染色結(jié)果

免疫組化黃褐色區(qū)域為各指標(biāo)陽性表達(dá)。如圖所見：模型組小鼠胃組織TLR2、MyD88、NF-κB 表達(dá)均明顯多于正常組、新蒲飲組、新蒲飲+PPI 組以及西藥三聯(lián)組。新蒲飲組小鼠胃組織TLR2、MyD88、NFκB 表達(dá)均多于新蒲飲+PPI 組以及西藥三聯(lián)組，新蒲飲+PPI 組與西藥三聯(lián)組TLR2、MyD88、NF-κB 表達(dá)無明顯差異。結(jié)果見圖3（A2-E2）、圖4（A3-E3）、圖5（A4-E4）。

圖1 胃粘膜炎癥病理情況（電鏡HE染色×50）

圖2 各組小鼠H.pylori定植情況（Giemsa染色×50）

圖3 各組小鼠胃粘膜TLR2表達(dá)量（免疫組化×50）

圖4 各組小鼠胃粘膜MyD88表達(dá)量（免疫組化×50）

3.5 Western blot 胃組織中TLR2/MyD88/NF-κB 通路表達(dá)量

模型組小鼠胃黏膜中MyD88、NF-κB、IκK-α、p-IκB-α的表達(dá)量顯著高于正常組(P＜0.05),新蒲飲組、新蒲飲+PPI 組和西藥三聯(lián)組小鼠胃組織中TLR2、MyD88、NF-κB 、IκK-α、p-IκB-α的表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.05），新蒲飲+ PPI 組、西藥三聯(lián)組小鼠胃組織中TLR2、MyD88、NF-κB 的表達(dá)量顯著低于新蒲飲組（P＜0.05），新蒲飲+ PPI 組MyD88、NF-κB 、IκK-α、P-IκB-α的表達(dá)量低于西藥三聯(lián)組，但無顯著性差異（P＞0.05）。見表3及圖6。

圖5 各組小鼠胃組織NF-κB表達(dá)量（免疫組化×50）

表3 各組小鼠胃粘膜中TLR 2、MyD88、NF-κB、p-IκB α、IκK-α蛋白相對表達(dá)量比較(±S; n = 8)

表3 各組小鼠胃粘膜中TLR 2、MyD88、NF-κB、p-IκB α、IκK-α蛋白相對表達(dá)量比較(±S; n = 8)

注：與正常組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05；與新蒲飲組比較△P＜0.05。

IκK-α/GAPDH 0.281±0.0671.315±0.211*0.829±0.109#0.475±0.089#△0.506±0.103#△30.910.00組別正常組模型組新蒲飲組新蒲飲+PPI組西藥三聯(lián)組n 88888 F P TLR2/GAPDH 0.230±0.0981.648±0.393*0.937±0.055#0.442±0.034#△0.531±0.046#△27.610.00 MyD88/GAPDH 0.324±0.0541.406±0.291*0.897±0.230#0.387±0.016#△0.440±0.086#△21.400.00 NF-κB/GAPDH 0.351±0.0971.456±0.044*0.947±0.139#0.4917±0.169#△0.551±0.129#△39.60.00 P-IκB-α/GAPDH 0.314±0.2501.492±0.339*0.800±0.034#0.370±0.234#△0.397±0.246#△12.550.00

圖6 各組小鼠胃粘膜TLR 2、MyD88、NF-kB、p-IκB-α、IκK-α蛋白表達(dá)電泳

3.6 PCR 檢測胃組織中TLR2/MyD88/NF-κB 通路基因表達(dá)量

模 型 組 小 鼠 胃 黏 膜 中TLR2、MyD88、NF-κB mRNA 的表達(dá)量顯著高于正常組（P＜0.05），新蒲飲組、新蒲飲+PPI組和西藥三聯(lián)組小鼠胃組織中TLR2、MyD88、NF-κB mRNA 的表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.05），新蒲飲+PPI組、西藥三聯(lián)組小鼠胃粘膜組織中TLR2、MyD88、NF-κB mRNA 的表達(dá)量顯著低于新蒲飲組（P＜0.05），新蒲飲+PPI 組與西藥三聯(lián)組胃組織中TLR2、MyD88、NF-κB mRNA 的表達(dá)量比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠胃組織中TLR 2、MyD88、NF-κB mRNA相對表達(dá)量比較(±S; n = 8)

表4 各組小鼠胃組織中TLR 2、MyD88、NF-κB mRNA相對表達(dá)量比較(±S; n = 8)

注：與正常組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05；與新蒲飲組比較△P＜0.05

NF-κB(2-△△ct)0.080±0.0111.032±0.345*0.292±0.084#0.111±0.010#△0.133±0.011#△19.040.000組別正常組模型組新蒲飲組新蒲飲+PPI組西藥三聯(lián)組n 88888 F P TLR 2(2-△△ct)0.116±0.0180.818±0.162*0.418±0.021#0.181±0.010#△0.236±0.043#△41.460.000 MyD88(2-△△ct)0.132±0.0411.085±0.113*0.643±0.076#0.232±0.012#△0.296±0.049#△99.610.000

3.7 Elisa 檢測血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β 的表達(dá)量比較

模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β的表達(dá)量顯著高于正常組（P＜0.05）；新蒲飲組、新蒲飲+ PPI 組和西藥三聯(lián)組小鼠血清中TNF-α、IL-1β的表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.05）；新蒲飲+ PPI 組、西藥三聯(lián)組小鼠血清中TNF-α、IL-1β的表達(dá)量顯著低于新蒲飲組（P＜0.05），新蒲飲+PPI組血清中TNF-α、IL-1β的表達(dá)量低于西藥三聯(lián)組，但比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)量水平比較(±S; n = 8)

表5 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)量水平比較(±S; n = 8)

注：與正常組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05；與新蒲飲組比較△P＜0.05。

組別正常組模型組新蒲飲組新蒲飲+PPI組西藥三聯(lián)組n 88888 IL-1β/(pg·mL-1)203.9±28.00374.5±25.05*291.0 ± 58.32#214.1±28.43#△222.9±24.56#△18.870.000 F P TNF-α/(pg·mL-1)64.74±3.231120.2±22.95*83.56±12.49#62.73±12.05#△64.41±13.44#△16.990.000

4 討論

Toll樣受體（TLRs）是近年來發(fā)現(xiàn)的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，在幽門螺桿菌感染及其所致的相關(guān)疾病中起重要作用[17]。國外研究報道當(dāng)幽門螺桿菌在胃內(nèi)定植時，其致病因子—脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和熱休克蛋白（heatshockprotein，HSP）可以通過Toll受體信號通路誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子[18-20]，從而導(dǎo)致胃粘膜的損傷，引發(fā)胃炎等疾病的發(fā)生。在TLRs家族中，與幽門螺桿菌引起的慢性炎癥反應(yīng)最具有相關(guān)性是TLR2、TLR4 受體。相比較其他受體而言，TLR2 在胃腫瘤細(xì)胞中表達(dá)最廣泛，在識別幽門螺桿菌方面也更占優(yōu)勢[21-22]。因此TLR2 被認(rèn)為是治療幽門螺桿菌相關(guān)疾病的一個治療靶點(diǎn)[23]。NF-κB最早在20 世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)在多種哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要是其亞基p65/p50 異二聚體觸發(fā)活性轉(zhuǎn)錄[24]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB 亞基二聚體通過與被稱為NF-κB 抑制劑（IκB，由IκB-α、IκB-β、NEMO 組成）的抑制蛋白結(jié)合在細(xì)胞溶質(zhì)中。當(dāng)受炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子或?qū)?xì)菌感染有反應(yīng)的受體（如Toll 樣受體（TLRs））的刺激而激活時，IκB 激酶（IκK，由IκK-α、IκK-β、IκKγ 組成）快速活化，引起IκB 磷酸化，從而進(jìn)行蛋白酶體降解并釋放NF-κB 亞基二聚體。研究表明當(dāng)幽門螺旋桿菌和宿主之間的相互作用之后，主要就是通過激活炎性信號通路NF-κB 釋放了促炎細(xì)胞因子[25]。TNF-α和IL-1β是這些促炎細(xì)胞因子的重要成員。二者的高度表達(dá)與胃粘膜幽門螺桿菌感染有著相關(guān)性[26-27]，并且在促進(jìn)幽門螺桿菌感染性炎癥發(fā)展為腫瘤[28-30]的進(jìn)程中發(fā)揮著重大作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)TLR2可以誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，這些都是通過激活NF-κB的結(jié)果[31-32]。Smith[33]等也發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌感染主要通過上調(diào)TLR2，并由銜接蛋白MyD88介導(dǎo)，激活NF-κB 信號通路而發(fā)揮致病作用。因此，根據(jù)以上文獻(xiàn)檢索結(jié)果以及本研究的結(jié)果，本文推測幽門螺桿菌感染引起胃炎的機(jī)制可能是TLR2 識別了幽門螺桿菌的致病因子LPS 和HSP，啟動連接蛋白MyD88 介導(dǎo)的信號通路，促使IκK 活化，使得IκB 磷酸化之后被泛素-蛋白酶體途徑降解之后與NF-κB 解聚，引起TNF-α和IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致胃炎的發(fā)生和發(fā)展。

新蒲飲中許多中藥具有根除幽門螺桿菌、抗炎以及保護(hù)胃粘膜的作用。例如黃連、黃柏可以抑制多重耐藥的幽門螺桿菌感染[34-36]；以大血藤為主要組成的湯藥可以治療幽門螺桿菌感染慢性萎縮性胃，并降低Κi-67、Bax、Fax 的表達(dá)量[37]；檳榔提取物檳榔堿能夠抗菌及抗炎，興奮膽堿M 受體，促進(jìn)胃腸道蠕動[38]；單味蒲公英飲聯(lián)合14 d 序貫組較單純14 d 序貫組根除率提高了5%，證明了蒲公英具有抗幽門螺桿菌的功效[39]；新鮮仙鶴草汁配上烏賊骨、白芨，對清除幽門螺桿菌、促進(jìn)潰瘍愈合有一定作用[40]。方中中藥還具有抗氧化作用，可以抑制幽門螺桿菌[41]產(chǎn)生大量自由基促進(jìn)胃粘膜氧化調(diào)亡，起到保護(hù)胃粘膜的作用。

在本實驗幽門螺桿菌的根除率結(jié)果中，正常組為100%，模型組為0%，表明兩組之間未發(fā)生交叉感染，幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃炎造模成功。而新蒲飲組、新蒲飲+奧美拉唑組、西藥三聯(lián)組根除率均高于模型組，低于正常組，表明三組治療方案都可以根除幽門螺桿菌，其中以新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑及西藥三聯(lián)根除效果最為顯著。HE 染色結(jié)果顯示正常組炎癥情況最輕，模型組炎癥情況最重，新蒲飲組、西藥三聯(lián)組、新蒲飲+PPI 組炎癥情況依次減輕。在胃組織TLR2、Myd88、NF-κB 蛋白、基因表達(dá)以及血清TNF-α和IL-1β含量的結(jié)果中，正常組表達(dá)最少，模型組表達(dá)最多，結(jié)合二者HE 染色炎癥情況，說明幽門螺桿菌感染引發(fā)的胃炎可能與TLR2/MyD88/NF-κB 信號通路的激活以及促炎因子TNF-α和IL-1β的釋放有關(guān)；三組治療組與模型組對比，TLR2、MyD88、NF-κB 表達(dá)以及TNF-α和IL-1β含量減少，說明三組治療方案均可以通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB 信號通路，減少TNF-α和IL-1β的表達(dá)，減輕胃部炎性癥狀；從實驗結(jié)果可以看出三組治療組TLR2、MyD88NF-κB表達(dá)以及TNF-α和IL-1β含量與HE染色炎癥情況成正相關(guān)，同樣表明了胃組織炎癥的改善與TLR2、MyD88、NF-κB 的表達(dá)和TNF-α、IL-1β的含量減少有關(guān)。模型組較之空白組IκK-α、p-IκB-α蛋白表達(dá)明顯增高，這表明在與HP 感染相關(guān)的TLR2/MyD88/NF-κB 信號通路中，IκK-α、p-IκB-α為正反饋因子，通路的啟動促使了IκK-α、p-IκB-α表達(dá)升高。從實驗結(jié)果中可知二者的表達(dá)與TLR2、MyD88、NF-κB 表達(dá)以及炎癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這與上述文獻(xiàn)查閱以及推測的結(jié)果相同，即TLR2 識別了幽門螺桿菌的LPS 和HSP，啟動MyD88 介導(dǎo)的信號通路，促使IκK 活化，從而導(dǎo)致IκB磷酸化以及降解，使得NF-κB得以釋放。

綜上，本研究結(jié)果表明，新蒲飲、新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑、西藥三聯(lián)都能夠通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號通路，減少TNF-α、IL-1β的表達(dá)釋放，改善胃部炎癥反應(yīng)。

此外，三者還可以根除幽門螺桿菌，其根除率與抑制TLR2/MyD88/NF-κB 信號通路的表達(dá)成正比，也與改善炎癥反應(yīng)成正比?？梢钥闯鋈叩目寡庄熜cTLR2/MyD88/NF-κB 信號通路的表達(dá)以及根除HP具有相關(guān)性。相較于新蒲飲，新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑抗炎及根除幽門螺桿菌作用更加顯著，初步猜測可能與質(zhì)子泵抑制劑（PPIs）的抑酸作用有關(guān)。據(jù)報道PPIs可能改變p -糖蛋白在胃腸道中的表達(dá)，進(jìn)而改變幽門螺桿菌對細(xì)胞的粘附[42]，又可與黏膜表層的尿素酶結(jié)合,抑制其活性；另一方面PPIs的抑酸作用可以減少強(qiáng)酸對幽門螺桿菌生長的刺激[43]，并提高胃內(nèi)PH 值，為新蒲飲其穩(wěn)定性以及發(fā)揮藥效作用提供了內(nèi)環(huán)境。因此，中藥與質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)合應(yīng)用具有可行性，二者具有協(xié)同作用[14]。相較于西藥三聯(lián)，新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑抗炎效果可見其優(yōu)勢，幽門螺桿菌根除率雖稍遜，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與樣本數(shù)量較少相關(guān)。

本實驗仍有不足之處，例如：①本實驗研究的目的除了探討新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑的殺幽及抗炎療效以外，還希望通過比較新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑組以及西藥三聯(lián)組（抗生素聯(lián)合奧美拉唑）的實驗結(jié)果，探討新蒲飲能否代替抗生素起到治療作用，但是本實驗并未直觀的將新蒲飲的功效與抗生素的作用進(jìn)行對比，因此不能得此結(jié)論；②從新蒲飲組與新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑組的實驗結(jié)果對比可以看出，PPIs 在新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑治療方案中起到重要作用，查閱文獻(xiàn)可知主要是其抑酸作用輔助新蒲飲發(fā)揮了療效，但因本實驗只考慮到如何證明三組治療方案的療效，并未考慮到奧美拉唑與中藥復(fù)方之間的作用關(guān)系，因此并未設(shè)計奧美拉唑?qū)φ战M，從而導(dǎo)致奧美拉唑的輔助作用以及中藥復(fù)方的作用特點(diǎn)并不能很好的被揭示；③目前四聯(lián)療法為我國的一線療法，雖副反應(yīng)大，但是殺幽療效優(yōu)于三聯(lián)療法，之后應(yīng)該考慮設(shè)計實驗將新蒲飲聯(lián)合PPIs 治療方案與西藥四聯(lián)療法相對比，若實驗結(jié)果表明新蒲飲聯(lián)合PPIs 的療效接近或優(yōu)于西藥四聯(lián)療法，那么則更有臨床意義。由此可見，新蒲飲聯(lián)合奧美拉唑治療方案仍需更多的基礎(chǔ)以及臨床試驗去證明其根除幽門螺桿菌以及抗炎效果，揭示其藥理作用以及機(jī)制，評價其安全性，但希望此次的研究可以為更多相關(guān)殺幽實驗提供有效數(shù)據(jù)以及實驗指導(dǎo)。