基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探析瑞香狼毒活性成分治療晚期肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制＊

魏飛力，吳夢(mèng)麗，郭 麗，謝棒祥，杜宇瓊，陳德喜，劉曉霓

（1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 北京市肝病研究所 北京市肝炎與肝癌精準(zhǔn)醫(yī)療及轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心 北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 北京 100069）

肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，近年來，發(fā)病率逐年上升，死亡率也位居前列[1]。多數(shù)肝癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，由于缺乏有效的治療措施，因此，晚期肝細(xì)胞癌在臨床治療中仍是一個(gè)亟待解決的難題[2]。在我國(guó)草藥被廣泛用于腫瘤防治，特別是在晚期肝細(xì)胞癌治療中，發(fā)揮著重要的作用。瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）為瑞香科狼毒屬植物狼毒的干燥根，其治療腫瘤在我國(guó)古代醫(yī)學(xué)典籍中早有記載，近年來發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒中的許多成分在體內(nèi)外均具有抗腫瘤作用[3-9]，是一種潛在的抗腫瘤藥物，但其具體的抗腫瘤活性成分及作用機(jī)制目前尚不清楚。瑞香狼毒自身也具有明顯的毒性，有研究發(fā)現(xiàn)，隨著炮制方法的改變，瑞香狼毒中化學(xué)成分的含量及有效成分均發(fā)生著相應(yīng)的變化，導(dǎo)致其毒性程度也作出相應(yīng)改變，因此在臨床中使用十分謹(jǐn)慎[10-14]。如果能探明瑞香狼毒的活性成分，明確其治療晚期肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制，對(duì)于瑞香狼毒增效減毒，開發(fā)利用以及晚期肝細(xì)胞癌的治療都具有重要的意義。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過篩選瑞香狼毒的活性成分，利用IPA 軟件，預(yù)測(cè)其治療晚期肝細(xì)胞癌的分子及信號(hào)通路，為探索其多靶點(diǎn)治療晚期肝細(xì)胞癌的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 瑞香狼毒活性成分篩選

通過檢索TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/），在“Herb name”詞條框中輸入“瑞香狼毒”，點(diǎn)擊search，獲取單味中藥化合物條目，點(diǎn)擊進(jìn)入并獲取中藥分子信息，包括活性成分的分子名（molecule name）、相對(duì)分子質(zhì)量（MW）、類藥性（DL）、口服生物利用度（OB，%）、小腸上皮細(xì)胞滲透率（Caco-2）[15]。本研究中瑞香狼毒選用以化合物的口服生物利用度（OB）≥10%，化合物的類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件。

1.2 活性成分對(duì)應(yīng)靶蛋白信息獲取

根據(jù)1.1項(xiàng)下篩選出符合條件的活性成分，在TCMSP 平臺(tái)中，點(diǎn)擊“Related Targets”，獲取成分的“Targets Infomation”，從獲取的信息中得到該成分作用的靶蛋白名（targetname=protein names），在Uniprot（universal protein knowledgebase）（www.Uniprot.org）中，使用Uniprot KB 檢索功能，在檢索框中輸入靶蛋白名（target name），檢索條件為“organism:homo sapiens 和reviewed: yes”，獲取基因名（gene name），該部分?jǐn)?shù)據(jù)中包括中藥活性成分中對(duì)應(yīng)人類的相關(guān)靶蛋白。

1.3 構(gòu)建瑞香狼毒活性成分靶蛋白及晚期肝細(xì)胞癌基因分子網(wǎng)絡(luò)

將檢索到的瑞香狼毒活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白在線提交至Ingenuity Pathway Analysis（IPAhttp://www.ingenuity.com/）生物分析軟件。構(gòu)建瑞香狼毒活性靶蛋白分子網(wǎng)絡(luò)，并展示分子網(wǎng)絡(luò)的核心分子、生物功能及信號(hào)通路。同時(shí)，利用IPA 自帶的查詢功能，以“Advanced HCC”為關(guān)鍵詞，從數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢晚期肝細(xì)胞癌相關(guān)基因，構(gòu)建晚期肝細(xì)胞癌基因分子網(wǎng)絡(luò)，并展示分子網(wǎng)絡(luò)的核心分子、生物功能及信號(hào)通路。

1.4 比對(duì)瑞香狼毒活性成分靶蛋白及晚期肝細(xì)胞癌基因共同作用的生物學(xué)通路及作用位點(diǎn)

本研究利用IPA 軟件中Comparison 模塊，比較二者的生物學(xué)通路，并選取共同作用的通路進(jìn)行深入研究，分析二者在共同作用的生物學(xué)通路中的位點(diǎn)，預(yù)測(cè)瑞香狼毒治療晚期肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 瑞香狼毒活性成分對(duì)應(yīng)靶蛋白及晚期肝細(xì)胞癌相關(guān)基因

通過檢索，本研究共篩選出中藥瑞香狼毒4個(gè)活性成分，分別為胡蘿卜苷（daucosterol）、二氫山奈酚（dihydrokaempferol）、鵝掌楸樹脂酚（lirioresinol）、茴芹香豆精（pimpinellin）。其對(duì)應(yīng)的靶蛋白共18個(gè)，從IPA 軟件中選出晚期肝細(xì)胞癌相關(guān)基因共40個(gè)（表1）。

表1 瑞香狼毒活性成分對(duì)應(yīng)靶蛋白及晚期肝細(xì)胞癌相關(guān)基因

2.2 瑞香狼毒活性成分對(duì)應(yīng)靶蛋白及晚期肝細(xì)胞癌基因分子網(wǎng)絡(luò)

利用IPA 網(wǎng)絡(luò)分析功能，構(gòu)建瑞香狼毒活性成分靶蛋白及晚期肝細(xì)胞癌基因的分子網(wǎng)絡(luò)，圖中紅色標(biāo)記為篩選出的靶蛋白分子或相關(guān)基因，灰色為構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖參與分子(圖1、圖2)。

活性成分靶蛋白共構(gòu)建出3個(gè)分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，參與分子最多的功能主要與組織損傷、機(jī)體異常及心血管疾病相關(guān)，這些分子參與的信號(hào)通路主要為NOS相關(guān)信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路、ERK/MAPK 信號(hào)通路、PPAR受體信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路，圖1 展示了這些分子的相互關(guān)系特征。晚期肝細(xì)胞癌基因共構(gòu)建出6個(gè)分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，圖2中主要展示了與癌癥、消化道疾病及肝臟疾病相關(guān)分子的相互關(guān)系特征。提示這些分子參與了肝臟腫瘤的調(diào)控，參與的信號(hào)通路主要為VEGF家族配體-受體互作信號(hào)通路、eNOS 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、PDGF信號(hào)通路、PAK信號(hào)通路、NF-кB信號(hào)通路等。

圖1 瑞香狼毒靶蛋白分子網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 晚期肝細(xì)胞癌相關(guān)基因分子網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 瑞香狼毒靶蛋白和晚期HCC相關(guān)基因共同作用的信號(hào)通路

2.3 瑞香狼毒靶蛋白和晚期肝細(xì)胞癌基因共同作用的信號(hào)通路比較

按照瑞香狼毒活性成分靶蛋白與作用通路相關(guān)性（－logP）從大到小進(jìn)行排列，對(duì)比瑞香狼毒活性成分靶蛋白和晚期肝細(xì)胞癌相關(guān)基因作用的信號(hào)通路，前5 位共有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分別為cAMP 介導(dǎo)信號(hào)通路、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、Gαq 信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路(圖3)。

2.4 信號(hào)通路作用分子位點(diǎn)比較

根據(jù)以上結(jié)果，重點(diǎn)觀察瑞香狼毒活性成分靶蛋白在PI3K 信號(hào)通路中的分子位點(diǎn)，在PI3K/AKT 信號(hào)通路中，紅色分子（PI3KCG、HSP90，PTGS2）是瑞香狼毒活性成分靶蛋白分子，灰色為晚期肝細(xì)胞癌相關(guān)基因分子（圖4）。

圖4 PI3K/AKT信號(hào)通路中作用位點(diǎn)

3 討論

肝癌被列為全世界癌癥相關(guān)死亡率的第二大主要原因[16-17]，盡管某些其他形式的癌癥治療取得了成功，但是在我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率都在迅速增加[18]。由于肝細(xì)胞癌早期缺乏特異性癥狀和精確的分子靶點(diǎn)，給肝細(xì)胞癌的早期診斷和治療帶來了嚴(yán)重障礙[19]。三分之二的肝細(xì)胞癌患者最初是在晚期被診斷出來的，此時(shí)幾乎沒有時(shí)間進(jìn)行有效的治療。中藥在肝癌的治療中，特別是晚期肝細(xì)胞癌的治療過程中發(fā)揮著積極的作用。研究報(bào)道，瑞香狼毒許多成分在體內(nèi)外均具有抗腫瘤作用，其中總黃酮提取物具有較強(qiáng)的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用，總木脂素有較強(qiáng)的體外抗腫瘤作用，香豆素類化合物是其特征性成分，不僅毒性強(qiáng)，而且有廣泛的藥理作用，二萜類化合物具有很強(qiáng)的抗癌活性，被公認(rèn)為瑞香狼毒抗腫瘤作用的主要成分[20-21]。在本研究中，首先通過生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷（植物甾醇類）、二氫山奈酚（黃酮類）、鵝掌楸樹脂酚（木質(zhì)素類）、茴芹香豆精（香豆素類）為瑞香狼毒中的有效活性物質(zhì)成分，推測(cè)其可能為瑞香狼毒發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過構(gòu)建有效活性成分靶蛋白和晚期肝細(xì)胞癌基因之間的分子網(wǎng)路，發(fā)現(xiàn)二者在參與分子以及分子功能中存在明顯差異。前者參與分子最多的功能要與組織損傷、機(jī)體異常及心血管疾病相關(guān)。而后者主要分子網(wǎng)絡(luò)則更多參與了癌癥、消化道疾病、肝臟疾病的調(diào)控。從各自獨(dú)立參與的信號(hào)通路看，既有相似，也存在明顯不同。其中，晚期肝癌相關(guān)基因主要通過血管生成信號(hào)通路，如VEGF 家族配體-受體互作信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、PDGF信號(hào)通路促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育。綜合比較兩者共有的信號(hào)通路，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)PI3K/AKT 信號(hào)通路是二者共有的最重要信號(hào)信號(hào)通路[22-24]。PI3K/AKT 信號(hào)通路在多種細(xì)胞中活化，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及血管生成等[25-26]。靶向PI3K/AKT 信號(hào)通路信號(hào)通路是惡性腫瘤治療中的重要方法[27-28]。PI3KCG、HSP90、PTGS2 是瑞香狼毒活性靶蛋白中作用于PI3K/AKT 信號(hào)通路的重要分子，體外研究報(bào)道，MIR-502能通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期停滯和凋亡，顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，肝癌細(xì)胞中PI3KCG是mir-502 的直接下游靶點(diǎn)[29]。肝細(xì)胞hsp90 可能積極參與肝癌的發(fā)展，它可能是監(jiān)測(cè)晚期肝癌的潛在生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[30]。而PTGS2 高表達(dá)與腫瘤晚期、腫瘤體積大、淋巴管侵犯增加、生存期短有關(guān)，塞來昔布通過對(duì)PTGS2 靶向調(diào)控，能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡以及抑制侵襲性發(fā)生，表現(xiàn)出抗腫瘤活性[31]。因此，本研究推測(cè)瑞香狼毒可能通過PI3KCG、HSP90、PTGS2 三個(gè)分子調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路，抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和IPA 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，探析中藥發(fā)揮作用的分子機(jī)制已得到了廣泛應(yīng)用，為中藥藥理、組方機(jī)制及新藥研發(fā)等提供了有益的參考[32-34]。IPA 生物分析軟件能夠分析、整合、理解來自于基因表達(dá)等系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；能夠搜索到有關(guān)基因、蛋白質(zhì)、化學(xué)品和藥物的信息，并能建立起實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的交互模型[35]。但其分析的基礎(chǔ)是基于其數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的已有參考數(shù)據(jù)，使用過程仍會(huì)存在解析信息不夠全面等不足。因此，提供更加全面，綜合的生物信息對(duì)于準(zhǔn)確解析網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)將更有幫助[36]。