扶正祛邪抑癌方治療大鼠原發(fā)性肝癌的實(shí)驗(yàn)研究＊

雷 丹，黃素瓊，李 波，王曉棟，劉友平，魏 嵋

（1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 瀘州 646000）

我國每年約30 萬-40 萬人死于肝癌，約占全球肝癌死亡人數(shù)的50%[1]。而原發(fā)性肝癌（Primary liver cancer，PLC）起病隱匿，早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，位居我國癌癥死亡率第二位。癌癥最常發(fā)生在慢性炎癥環(huán)境中[2]，通過轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，包括趨化因子和細(xì)胞因子。細(xì)胞因子激活炎性細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的相同關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)并產(chǎn)生癌癥相關(guān)的炎性微環(huán)境。病毒感染、飲酒、藥物、細(xì)菌等情況下，巨噬細(xì)胞的活化以及大量炎癥因子參與肝臟慢性炎癥環(huán)境的形成，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生，并且大量促炎因子為腫瘤生長提供優(yōu)勢環(huán)境[3-4]。

扶正祛邪抑癌方是我院全國名中醫(yī)孫同郊教授幾十年治療肝癌的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，臨床應(yīng)用收效甚佳，主要針對臨床上肝癌常見的氣陰兩虛，瘀毒互結(jié)的證型，該方由黃芪、枸杞子、女貞子、白術(shù)、土鱉蟲、丹參、莪術(shù)、半枝蓮、香附等十余味藥物組成。方中重用黃芪、枸杞子為君藥，注重氣陰雙補(bǔ)，臣以白術(shù)健脾益氣、女貞子養(yǎng)肝腎之陰，以上藥物共建扶正之基。半枝蓮性苦、微寒，有清熱解毒、活血化瘀之功；土鱉蟲、莪術(shù)等藥物具有破血逐瘀、消積止痛的功效；香附為使，疏肝理氣，引藥入經(jīng)，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、清熱解毒之效。

本實(shí)驗(yàn)通過扶正祛邪抑癌方干預(yù)二乙基亞硝胺（Diethylnitrosamine，DEN）導(dǎo)致的PLC 大鼠，通過檢測肝功及相關(guān)細(xì)胞因子評估該方的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品試劑及主要儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品、試劑：清潔SD 雄性大鼠200 只，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。扶正祛邪抑癌方由我院制劑室統(tǒng)一制作為濃縮膏，每毫升含生藥1.5 g,其中黃芪、白術(shù)等采用水提法，枸杞子、女貞子、土鱉蟲、香附等藥物采用醇提法。復(fù)方斑蝥膠囊：貴州益佰制藥股份有限公司，批號(hào)：Z52020238，0.25 g/粒。試劑：DEN：美國sigma 公司，0.95 g/mL。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（Gamma-glutamyl transpeptidase，GGT）、堿性磷酸酶（Alkaline phospbatase，ALP）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）試劑盒：南京建成生物工程研究所。白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-10（Interleukin-10，LI-10）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFNγ）：茁彩生產(chǎn)。環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）多克隆抗體proteintech中國武漢。

主要儀器：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5424R）、全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（常熟市學(xué)科電器有限公司）、AU 2700全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus）、酶標(biāo)儀Multlskan MK3(賽默飛世爾儀器有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

造模：清潔雄性SD大鼠200只，體質(zhì)量150-180 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為兩組，正常組20 只，干預(yù)組180 只，正常組予以生理鹽水2 mL/kg 腹腔注射；干預(yù)組予以DEN 腹腔注射，50 mg/kg，每周1次。至第13周開始，每周處死模型組大鼠2只，取肝臟行HE染色，至第17 周末病理學(xué)檢查證實(shí)PLC 造模成功。造模成功后正常組剩余18 只，干預(yù)組剩余130 只，將干預(yù)組隨機(jī)分為模型組、斑蝥組、高劑量組、中劑量組和低劑量組共5組。正常組、模型組予以生理鹽水灌胃，斑蝥組予以復(fù)方斑蝥膠囊灌胃,低、中、高劑量組分別予以扶正祛邪抑癌方浸膏5 mL/kg、10 mL/kg、20 mL/kg，等體積稀釋后進(jìn)行灌胃。

指標(biāo)檢測：灌胃觀察12 周后計(jì)算大鼠生存率，腹腔注射10%的水合氯醛0.3 g/kg，腹主動(dòng)脈采血，并取肝脾組織，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。通過全自動(dòng)生化儀檢測γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）；Elisa檢測白介素-6（IL-6）、白介素-10（LI-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）；免疫組化檢測AFP、COX-2。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

統(tǒng)計(jì)描述性分析：①計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示；②計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

各組間差異比較：①多組計(jì)量資料以單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)；多重的組間比較以LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行；②計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DEN對SD大鼠原發(fā)性肝癌造模

造模17周后，取大鼠肝臟行HE染色：可見肝細(xì)胞變性壞死，局部區(qū)域腫瘤形成，腫瘤細(xì)胞周圍大量纖維組織增生形成包囊，證明肝癌造模成功。見圖1。

3.2 取材時(shí)肝臟大體觀

肉眼觀察：正常組大鼠肝組織質(zhì)地柔軟，顏色淡紅,表面光滑,邊緣銳利；模型組大鼠肝臟表面見彌漫性結(jié)節(jié)，存在結(jié)節(jié)出血，肝葉之間黏連不清，結(jié)節(jié)間正常肝組織少；低劑量組大鼠肝臟可見彌漫性結(jié)節(jié)或散在結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)較大，并且有相互融合，部分可見結(jié)節(jié)內(nèi)出血；中劑量組肝臟見多發(fā)結(jié)節(jié)，但在結(jié)節(jié)數(shù)量及大小較其余各給藥組明顯好轉(zhuǎn)；高劑量組大鼠肝臟表面散在多個(gè)較大的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)之間存在彼此融合，部分可見結(jié)節(jié)內(nèi)出血情況；斑蝥組大鼠肝臟結(jié)節(jié)大小不一，結(jié)節(jié)數(shù)量較模型組減少，與中劑量組最接近。見圖2。

3.3 取材時(shí)肝臟組織病理檢查

肝組織HE染色,鏡下觀察可知，正常組：大鼠肝小葉、細(xì)胞形狀結(jié)構(gòu)正常，大小均勻、邊界分明、呈放射狀整齊排列。模型組：肝索排列紊亂，肝細(xì)胞變性壞死。局部區(qū)域腫瘤形成，大量異形細(xì)胞增生，腫瘤細(xì)胞排列密集，分化程度低，異形性大，部分腫瘤細(xì)胞內(nèi)可見多個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞間可見大量增生纖維組織，腫瘤內(nèi)部呈片狀壞死，局部區(qū)域亦可見灶狀炎細(xì)胞浸潤，血管增生明顯。低劑量組：與模型組相比，肝細(xì)胞壞死程度稍減輕，腫瘤細(xì)胞排列相對疏松，腫瘤細(xì)胞壞死程度稍減輕。中劑量組：與模型組相比，腫瘤細(xì)胞分化程度高，排列緊密，類似肝細(xì)胞，體積較大，腫瘤細(xì)胞壞死不明顯。高劑量組；與模型組相比腫瘤細(xì)胞分化程度高，腫瘤細(xì)胞壞死好轉(zhuǎn)。斑蝥組：與中劑量組基本相似。見圖3。

圖1 大鼠肝臟行HE染色（*100）

圖2 肝臟大體觀

圖3 肝組織HE染色（*100）

3.4 各組大鼠一般情況、生存率比較

在灌胃過程中，除正常組外，各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的生長緩慢或體質(zhì)量下降、精神差、怠動(dòng)，毛色晦暗無光澤等情況，但總體而言，正常組＞中劑量組＞高劑量組/斑蝥組＞低劑量組＞模型組。各組大鼠生存率與模型組相比有增加趨勢，其中模型組與中劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1、表2和圖4）。

表1 大鼠生存率比較

表2 大鼠死亡數(shù)量與時(shí)間關(guān)系表

圖4 生存曲線圖

3.5 體質(zhì)量、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)

3.5.1 體質(zhì)量

如表3、圖5 和圖6 所示，在大鼠開始灌胃時(shí)，除正常組外，各組大鼠體質(zhì)量接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至灌胃第13周取材時(shí)體質(zhì)量分析發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠與其余各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組與斑蝥組、高劑量組、中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與低劑量組比較差異無意義。

3.5.2 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)情況

如表4 和圖7 所示：與正常組相比，各組大鼠肝臟、脾臟指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，斑蝥組、高劑量組、中劑量組的肝臟、脾臟指數(shù)均有不同程度下降（P＜0.05），其中以中劑量組下降最明顯。

表3 大鼠體質(zhì)量變化表（單位：g）

圖5 大鼠體質(zhì)量變化曲線圖

圖6 各組大鼠體質(zhì)量比較

表4 肝臟、脾臟指數(shù)比較表

3.6 檢測肝功能指標(biāo)

檢測ALT、AST、ALP、GGT結(jié)果示：與正常組相比，各組ALT、AST、ALP、GGT都明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組均可以不同程度降低ALT、AST、ALP、GGT，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中中劑量組改善以上指標(biāo)最顯著，低劑量組肝功能與模型組最接近。與斑蝥組相比，中劑量組改善AST、ALP、GGT效果更好(P＜0.05)（見表5和圖8）。

圖7 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)比較

表5 大鼠肝功能（ALT、AST、ALP、GGT）比較

圖8 各組ALT、AST、ALP、GGT比較

表6 血清細(xì)胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ）比較

圖9 各組IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 比較

3.7 細(xì)胞因子

通過Elisa 檢測IL-6、IL-10、TNF-α與IFN-γ結(jié)果（見表6 和圖9）所示：與正常組相比，各組的IL-6、IL-10、TNF-α均明顯增高(P＜0.05)。與模型組相比，各給藥組均可以不同程度降低IL-6、TNF-α（P＜0.05）,斑蝥組、高劑量組、中劑量組可以降低IL-10（P＜0.05），以中劑量組降低最為明顯。且中劑量組降低IL-6、TNF-α的作用優(yōu)于斑蝥組（P＜0.05）。與正常組相比，斑蝥組、中劑量組IFN-γ都有所升高（P＜0.05）。與模型組相比，斑蝥組、高劑量組、中劑量組均可以升高IFN-γ（P＜0.05）。

3.8 免疫組化檢測肝組織COX-2、AFP的表達(dá)

免疫組化COX-2、AFP，陰性細(xì)胞呈藍(lán)色，陽性細(xì)胞呈黃色或棕黃色，AFP、COX-2 陽性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞漿。結(jié)果如表7、圖10、圖11和圖12所示：與正常組相比，各組COX-2、AFP 光密度值明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，斑蝥組、高劑量組、中劑量組的AFP、COX-2 光密度值有所下降（P＜0.05），以中劑量組降低最明顯，且中劑量組降低AFP 效果優(yōu)于斑蝥組（P＜0.05）。

4 討論

圖10 大鼠肝臟組織中AFP、COX-2 OD值比較

圖11 大鼠肝組織AFP的表達(dá)（*400）

圖12 大鼠肝組織COX-2的表達(dá)（*400）

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)對SD 大鼠予以DEN 50 mg/kg每周一次腹腔注射[5]。在以往報(bào)道中，對于造模時(shí)間存在13-18周不等[6-8]，造模時(shí)間難以把握，故本實(shí)驗(yàn)自第13 周末開始每周取2 只大鼠肝臟行病理檢查，至第17周證實(shí)大鼠肝癌誘導(dǎo)成功。

表7 AFP、COX-2光密度值比較

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase，AST）主要存在于肝細(xì)胞中，是最常用的肝細(xì)胞破環(huán)和肝功能受損的指標(biāo)。急慢性肝炎或肝硬化等慢性肝病中，ALT、AST 都會(huì)升高；堿性磷酸酶（Alkaline phospbatase，ALP）是主要分布于肝臟、骨骼、腸、腎等組織，經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶，血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（Gamma-glutamyl transpeptidase，GGT）主要來自肝臟，肝癌時(shí)會(huì)出現(xiàn)GGT、ALP 過多產(chǎn)生及排泄障礙，故目前臨床上肝癌患者大多存在ALP、GGT 明顯升高。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[9]，DNE 誘發(fā)大鼠PLC 的過程中，GGT 可被作為肝細(xì)胞變異的陽性標(biāo)志，并且隨著腫瘤的增大，GGT 會(huì)不斷升高。目前研究中多把GGT、ALP 聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物作為肝癌診斷的重要依據(jù)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠ALT、AST、ALP、GGT 有不同程度升高，說明DEN 導(dǎo)致的原發(fā)性肝癌大鼠存在肝功能損傷，且各組大鼠中AST/ALT＞1，因本實(shí)驗(yàn)中對肝癌大鼠觀察時(shí)間為12 周，大鼠處于肝癌晚期，肝細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被打破，線粒體破壞，大量AST 釋放。使用藥物治療后，各組大鼠肝功能指標(biāo)與模型組相比均有不同程度改善，以中劑量組改善以上指標(biāo)更明顯。本研究認(rèn)為，扶正祛邪抑癌方全方具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀，清熱解毒的作用，針對肝癌過程中的虛、瘀、毒的病理特點(diǎn)，從而達(dá)到改善以上指標(biāo)的效果；另外現(xiàn)代藥理研究中發(fā)現(xiàn)方中黃芪、白術(shù)、莪術(shù)等多種藥物具有抗腫瘤、改善肝功能的效果。

慢性炎癥通過提供炎癥因子等生物活性物質(zhì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生或誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制因子誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，并且保護(hù)癌細(xì)胞免受免疫攻擊[12]。在HCC 中，病毒成分或炎性細(xì)胞因子，如TNF-α，通過酪氨酸激酶型受體起作用的生長因子，增強(qiáng)了HCC 細(xì)胞中p-SMAD3L（Ser-213）及其靶基因MMP-9的水平[13]。多項(xiàng)研究證實(shí)，TNF-α可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14-15]。IL-6是炎癥反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子，IL-6與IL-6受體結(jié)合后可以通過IL-6/JAK2/STAT3、Ras/Erk 和PI3K/AKT等多條通路發(fā)揮其致癌活性[16]，有研究表明其IL-6 可促進(jìn)腫瘤生長[17]。IL-10 是目前公認(rèn)的炎癥免疫抑制因子，被認(rèn)為在腫瘤微環(huán)境中通過減少抗腫瘤免疫反應(yīng)使腫瘤逃避免疫[18]。通過抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，下調(diào)共刺激分子以及主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)II 類的表達(dá)來抑制抗原呈遞細(xì)胞（APCs）和T 細(xì)胞功能，被認(rèn)為有助于免疫抑制環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤逃逸[18-20]，葉韻斌等[21]在分析PLC 組織中細(xì)胞因子的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)肝癌組織中IL-10 明顯高于非癌組織。IFN-γ由自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和活化T細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗腫瘤、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫等作用。COX-2催化產(chǎn)物PGE2與腫瘤細(xì)胞上前列腺素受體結(jié)合，通過激活細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[22]，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤血管生成藥物可誘導(dǎo)腫瘤組織缺氧，缺氧期間COX-2的上調(diào)并通過不同的VEGF 途徑誘導(dǎo)血管生成，有研究發(fā)現(xiàn)加用COX2 抑制劑有助于克服子宮內(nèi)膜癌、直腸癌等在治療過程中的耐藥[23-24]。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，扶正祛邪抑癌方各劑量組，特別是中劑量組（等效藥物劑量），能夠降低血清中的IL-6、TNF-α、IL-10 水平，升高IFN-γ水平，降低肝臟組織中AFP、COX-2 的表達(dá)。因扶正祛邪抑癌方注重扶正解毒，研究證明方中黃芪、白術(shù)、土鱉蟲等藥物可以抗腫瘤、提高機(jī)體免疫功能，本研究認(rèn)為可能是該方在一定程度上抑制了過度的炎癥反應(yīng)，提高了機(jī)體免疫水平，減少腫瘤細(xì)胞的逃逸，從而達(dá)到抗癌的效果。

在本實(shí)驗(yàn)中，使用扶正祛邪抑癌方低劑量、中劑量和高劑量進(jìn)行灌胃，其中中劑量為等效藥物劑量，實(shí)驗(yàn)證明其效果最佳。中醫(yī)治病講究的是辯證論治，根據(jù)疾病的病因病機(jī)，遵循“寒者熱之”“熱者寒之”“虛則補(bǔ)之”“實(shí)則瀉之”等用藥原則，但是若劑量過大則可能出現(xiàn)調(diào)整太過，從而效果欠佳，或者出現(xiàn)不良反應(yīng)，故出現(xiàn)高劑量組效果不如中劑量組。所以在臨床使用扶正祛邪抑癌方時(shí)，不宜在加大使用藥物劑量。

綜上所述，一定劑量的扶正祛邪抑癌方可以t 提高DEN 所致的原發(fā)性肝癌大鼠的生存率，改善其肝功能，調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子水平，降低肝臟組織中AFP、COX-2水平，從而對肝癌有一定治療作用。