復方斑蝥通過miR-520d/Beclin1信號軸逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌化療耐藥的機制研究＊

李紅昌，劉維燕，王建法，潘高峰，陸景鋒，劉嘉哲，胡麗萍

（上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院普外科 上海 201100）

三陰性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體（HER-2）均為陰性的一類乳腺癌，約占所有乳腺癌病理類型的15%，其預后差、復發(fā)轉(zhuǎn)移率高、死亡率高。由于TNBC 的內(nèi)分泌治療效果不佳，化療為其重要治療手段，目前常用化療藥物包括紫杉類（紫杉醇，多西紫杉醇又名多西他賽，白蛋白合成紫杉醇)，蒽環(huán)類（阿霉素、表阿霉素，各類脂質(zhì)體阿霉素），抗代謝類（卡培他濱、吉西他濱）。TNBC 容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，嚴重影響療效[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，臨床化療藥物多西他賽（Docetaxel，Doc）長期應用可以誘導TNBC 細胞自噬水平異常升高，進而誘導細胞耐藥，而降低細胞自噬水平可以增強腫瘤細胞對多西他賽的敏感性[2]。miRNA 是一類長度為19-25nt 的非編碼單鏈小分子，可以與其靶基因的mRNA 3′非編碼區(qū)（3′UTR）特異性結(jié)合，抑制靶基因表達。近年來關于非編碼RNA 如miRNA 在調(diào)控腫瘤自噬過程中的作用研究越來越受到重視。研究顯示miRNA 可以通過調(diào)控細胞自噬水平進而影響腫瘤細胞的耐藥[3]。

中醫(yī)藥治療對乳腺癌術后并發(fā)癥及減輕乳腺癌放化療毒副反應有著重要的臨床意義。其中，復方斑蝥注射液（Compound Cantharis Injection，CCI），又名艾迪注射液，是臨床上TNBC 常用的化療輔助藥物[4]，目前關于復方斑蝥抑制自噬抗TNBC 耐藥的機制尚未見報道。因此，本研究觀察復方斑蝥逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌耐藥的藥理學作用并探討miRNA-自噬信號軸是否是CCI逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌耐藥的關鍵機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；多西他賽（Docetaxel，Doc）購自美國MedChemExpress 公司；TRIzol 試劑、TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國ThermoFisher公司；TaKaRa 6210A反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司；miR-520d mimics 及inhibitors 購自美國Qiagen 公司；pGL3-Beclin1/BECN13′UTR-promotor 重組質(zhì)粒構(gòu)建由上?；粕镉邢薰驹O計完成；Beclin1/BECN1 及LC3 抗體購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）標記的山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術有限公司。PCR 擴增儀購自美國Applied Biosystems公司，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人三陰性乳腺癌MDA-MB-231 及MDA-MB-468細胞株購自美國標準細胞庫（American type culture collections，ATCC），相應的多西他賽（Docetaxel, Doc）耐藥株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 誘導于本實驗室。均培養(yǎng)于10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，及37℃并含有5% CO2培養(yǎng)環(huán)境。為了保持耐藥株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 的耐藥表型，多西他賽（終濃度為2 μM）始終加在耐藥細胞的培養(yǎng)基中，實驗前一周停止加藥。

1.3 MTT法檢測細胞活性

8 × 103cell/well 密 度 的MDA-MB-231 及MDAMB-468、MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 細胞接種到96孔板。到細胞完全貼壁后，加入不同濃度的多西他賽，置37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 小時后每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，4 小時后吸棄上清，加入100 μL/孔的DMSO，振蕩1 min。待MTT 還原產(chǎn)物溶解完全后，以492 nm 為實驗波長，630 nm 為參照波長運用酶標儀檢測其光吸收度。通過計算細胞的存活率，并確定藥物的IC50。

1.4 Western blot檢測蛋白表達

用RIPA 裂解液提取各組細胞蛋白。用BCA 試劑盒檢測各組總蛋白濃度，調(diào)平蛋白濃度后，取等量蛋白用10%SDS-PAGE 分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜。5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h，隨后加入一抗，4℃封閉過夜，第2天棄去一抗，加入HRP標記的山羊抗兔二抗室溫封閉1 h，滴加顯色液顯色，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片。

1.5 miRNA芯片分析

首先運用Trizol 法抽提取終濃度1 mg·ml-1復方斑蝥及溶劑組處理的MDA-MB-231/Doc細胞中總RNA。隨后進一步使用mirVanaTM 的miRNA 分離試劑盒（購買于Ambion公司）純化總RNA中的miRNA部分，最后將提取好的miRNA 樣品送至上海生物芯片中心進行芯片分析，使用安捷倫公司的人miRNA 芯片（v.12.0）進行雜交。

1.6 實時定量PCR（RealtimePCR）檢驗miRNA表達

運用Trizol 從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，用TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，每條miRNA 的相對量均以細胞中U6 snRNA 的含量為標準，用PCR 進行擴增，根據(jù)試劑盒說明書用TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒或?qū)崟r定量PCR 試劑盒進行定量分析。實驗所用到的引物均由上海生工設計合成。所以數(shù)據(jù)均平行3次取平均值。

1.7 熒光素酶報告實驗

通過生物信息預測miR-520d 上存在Beclin1/BECN1 的結(jié)合位點，用RT-PCR 擴增Beclin1/BECN1上含有miR-520d 結(jié)合位點的3′UTR 區(qū)域基因片段，將該片段插入pGL3-promoter 熒光素酶載體，構(gòu)建Beclin1/BECN13′UTR 野生（wild type，WT）質(zhì)粒；再利用基因位點突變技術對結(jié)合位點的部分核苷酸進行突變，構(gòu)建Beclin1/BECN13′UTR 突變（Mutation，Mut）質(zhì)粒。用Beclin1/BECN13′UTR WT 質(zhì)?；駼eclin1/BECN13′UTR Mut質(zhì)粒，海腎熒光素酶對照質(zhì)粒pRLSV40 與miR-520d mimics 對MDA-MB-231/Doc 細 胞進行共轉(zhuǎn)染，根據(jù)Dual Luciferase 報告基因試劑盒說明書避光測定熒光素酶活性。

圖1 自噬相關蛋白Beclin1/BECN1在TNBC耐藥細胞中表達增高

圖2 復方斑蝥通過抑制自噬逆轉(zhuǎn)TNBC化療耐藥

1.8 統(tǒng)計學方法

用SPSS 24.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用GraphPad Prism 8 軟件繪制圖片。實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，組間差異用One-Way ANOVA 檢測。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 自噬相關蛋白Beclin1/BECN1 在TNBC 化療耐藥細胞中表達增高

運用MTT 法檢測TNBC 細胞MDA-MB-231 及MDA-MB-468 及 其 耐 藥 株MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc 對于Doc 的敏感性。結(jié)果顯示，對于MDA-MB-231的半數(shù)抑制濃度（IC50）為4.5 μM，相比于其耐藥株（IC50 =45 μM）具有顯著性差異，表明MDA-MB-231/Doc 具有良好的耐藥性；同樣，MDAMB-468 的耐藥株MDA-MB-468/Doc 也具有良好的耐藥性（圖1A）。WB 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于親本株，TNBC 耐藥細胞株（MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc）中自噬相關蛋白Beclin1/BECN1 表達明顯上升（圖1B），提示Beclin1/BECN1的高表達可能是TNBC耐藥細胞株產(chǎn)生耐藥的主要原因之一，也進一步驗證了臨床化療藥物多西他賽長期應用可以誘導TNBC 細胞自噬水平異常升高，進而誘導細胞耐藥的這一研究結(jié)果。（圖1）

2.2 復方斑蝥通過抑制自噬逆轉(zhuǎn)TNBC化療耐藥

MTT 檢測Doc 和CCI 聯(lián)合使用多TNBC 耐藥細胞株的增殖影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCI 能夠顯著降低Doc 作用下耐藥細胞株的IC50（圖2A），提高TNBC 耐藥細胞株化療敏感性，提示復方斑蝥具有逆轉(zhuǎn)TNBC 化療耐藥的能力。隨后運用免疫印跡法（Western bloting，WB）發(fā)現(xiàn)，CCI能夠濃度依賴性的抑制TNBC耐藥細胞的自噬水平，明顯下調(diào)自噬相關蛋白Beclin1/BECN1，及自噬水平標注蛋白LC3II（圖2B），表明復方斑蝥通過抑制自噬逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌化療耐藥，提高對于多西他賽的藥物敏感性。

2.3 復方斑蝥上調(diào)miR-520d的表達

近年來關于miRNA 在調(diào)控腫瘤自噬過程中的作用越來越受到重視，為了進一步探究miRNA 是否在復方斑蝥逆轉(zhuǎn)TNBC 耐藥起到關鍵的作用，我們對CCI處理前后的TNBC 耐藥細胞采用miRNA 芯片檢測，發(fā)現(xiàn)CCI 能夠顯著上調(diào)miR-520d 水平（圖3A&B），RealtimePCR 在MDA-MB-231/Doc 及MDA-MB-468/Doc中驗證這一結(jié)果（圖3C）。上述結(jié)果提示CCI上調(diào)的miR-520d 可能在復方斑蝥抑制TNBC 耐藥細胞自噬過程中發(fā)揮作用。

圖3 芯片結(jié)果顯示復方斑蝥上調(diào)TNBC耐藥細胞中miR-520d的表達

2.4 MiR-520d 通過作用于Beclin1/BECN13′ UTR 區(qū)域抑制其表達

通過生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)Beclin1/BECN1 是miR-520d 潛在的靶點，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-520d 在Beclin1/BECN1 的3′UTR 含 有1個 作 用 位 點（圖4A）。運用雙熒光素酶報告基因法檢測miR-520d在Beclin1/BECN1 的3′UTR 的結(jié)合作用，將構(gòu)建的質(zhì)粒及miR-520d 模擬物（mimics）共轉(zhuǎn)染進入MDAMB-231/Doc 細胞中。圖4B 顯示miR-520d 可以明顯抑制熒光活性的強度，這表明，miR-520d 能夠抑制Beclin1/BECN13′UTR 區(qū)域活性。同時在沒有含有結(jié)合位點的質(zhì)粒組中，熒光活性沒有受到抑制，這表明miR-520d 抑制Beclin1/BECN1 的位點僅有所預測的這個結(jié)合位點。最后，WB 結(jié)果顯示miR-520d mimics能夠明顯抑制TNBC 耐藥細胞株（MDA-MB-231/Doc及MDA-MB-468/Doc）中Beclin1/BECN1 的蛋白表達。綜上，miR-520d 通過作用于Beclin1/BECN13′UTR 區(qū)域的位點進而抑制Beclin1/BECN1的表達。

2.5 MiR-520d 在復方斑蝥逆轉(zhuǎn)TNBC 化療耐藥過程中起到關鍵作用

運用MTT法檢測miR-520d在CCI逆轉(zhuǎn)TNBC化療耐藥過程中的作用。結(jié)果顯示miR-520d mimics 能夠顯著提高TNBC耐藥性細胞對于多西他賽的敏感性（圖5A&C）；相反，如果運用miR-520d抑制劑（inhibitor）抑制miR-520d的水平能夠明顯減弱CCI所促進的TNBC耐藥性細胞對于DOC的敏感性。

圖5 復方斑蝥通過調(diào)節(jié)MiR-520d的表達逆轉(zhuǎn)TNBC化療耐藥

3 討論

中醫(yī)在乳腺癌的辨證論治方面有著獨特的優(yōu)勢，中醫(yī)學認為乳腺癌系情志失調(diào)，肝氣郁結(jié)，經(jīng)絡痞塞，氣機阻滯，痰濁、瘀血內(nèi)生，郁久化熱成毒，或沖任失調(diào)，氣血虧損，痰濁內(nèi)生，阻滯氣機血行，久而成積[5]。病機錯綜復雜，但以痰瘀阻絡、化熱成毒為主要病機，正氣虛弱是乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的基礎，毒痰瘀結(jié)是乳房癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的關鍵因素。因此，從毒痰瘀虛論治三陰乳腺癌是預防復發(fā)轉(zhuǎn)移的中藥治療方法[6]。中醫(yī)藥治療對乳腺癌術后并發(fā)癥及減輕乳腺癌放化療毒副反應有著重要的臨床意義。其中，CCI 是臨床上三陰乳腺癌常用的化療輔助藥物。CCI 是由斑蝥、人參、黃芪、刺五加組成，是現(xiàn)代組方的純中藥制劑。方中以祛邪為主要作用的斑蝥為君藥，斑蝥體內(nèi)含有斑蝥素，是抗腫瘤的主要活性成分；具有扶正為主要作用的人參、黃芪共為臣藥；為增強參芪扶正之功，配以刺五加為佐使之藥。該藥具有破血消瘀、清熱解毒、攻毒蝕瘡、扶正固本功效，可提高免疫力，激活抑癌基因，殺死癌細胞，對化療有協(xié)同和輔助作用。CCI主要成分斑蝥有直接殺傷腫瘤細胞的作用，斑蝥提取物的抗腫瘤活性成分為去甲斑蝥素，它對乳腺癌細胞均有抑制作用[7]，還具有抗癌而不產(chǎn)生骨髓抑制的特點，能對抗放化療中血細胞下降。臨床觀察表明，復方斑蝥對三陰乳腺癌有一定療效，能有效預防術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證實，CCI可通過多途徑多靶點對惡性腫瘤起到治療作用：①干擾腫瘤細胞的DNA 和RNA 的生物合成，直接殺傷腫瘤細胞；②抑制癌基因表達，誘導腫瘤細胞凋亡；③抑制腫瘤血管新生；④逆轉(zhuǎn)多藥耐藥；⑤保護骨髓；⑥調(diào)節(jié)免疫，增強淋巴因子激活性殺傷細胞、自然殺傷細胞活性等[9]。其中，逆轉(zhuǎn)耐藥是CCI 抗腫瘤的作用機制之一，本研究進一步明確了其具體逆轉(zhuǎn)耐藥機制。

細胞自噬的進程主要受自噬相關基因調(diào)控，Beclinl是自噬激活/啟動的一個標志蛋白，通過與不同自噬相關蛋白結(jié)合形成復合物，參與調(diào)控自噬體的形成和成熟。在自噬過程中，Beclin1的表達水平往往會上升[10]。在腫瘤細胞中Beclin1 可以通過調(diào)控自噬參與腫瘤細胞耐藥發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Doc 誘發(fā)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，輕微應激可促進應激活化信號分子c-Jun 氨基末端激酶-1 介導的Bcl-2 的磷酸化，進而導致Beclin1 的釋放促進自噬發(fā)生，同時釋放的Beclin1 可與Bax結(jié)合抑制凋亡，使得腫瘤細胞拮抗凋亡，最終導致腫瘤耐藥[11]。研究證實，在乳腺癌細胞中降低Beclin1 表達水平可提高其化療敏感性。因此，探討B(tài)eclin1 表達調(diào)節(jié)機制對乳腺癌化療耐藥這一臨床難題有極其重要的意義。

本研究應用構(gòu)建的三陰性乳腺癌Doc耐藥細胞株進行化療藥物半數(shù)抑制濃度檢測，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌多西他賽耐藥細胞株相對其親本細胞株半數(shù)抑制濃度明顯上升，自噬相關蛋白Beclin1/BECN1 表達增高，而復方斑蝥處理后能明顯增加多西他賽的敏感性，顯著降低多西他賽半數(shù)抑制濃度，并且抑制自噬標志蛋白Beclin1/BECN1 及LC3II 的表達，提示復方斑蝥可能是通過抑制三陰性乳腺癌耐藥細胞的過度自噬逆轉(zhuǎn)其耐藥作用。

隨著miRNA 在調(diào)控腫瘤自噬過程中的作用研究越來越受到重視[12]，此類研究日趨豐富。研究顯示，miRNAs 可以通過調(diào)控自噬相關基因轉(zhuǎn)錄后表達水平，進而調(diào)控細胞自噬水平。如外泌體miRNA-126通過破壞IRS/Glut-4 信號傳導重塑代謝，激活AMPK/自噬途徑并穩(wěn)定即將產(chǎn)生的脂肪細胞中的HIF1α表達。體內(nèi)抑制miRNA-126 可以減少脂肪細胞誘導的腫瘤生長[13]。在MCF-7 乳腺細胞系中，miR-486-5p 抑制劑誘導自噬并通過增加PTEN 表達和抑制AKT信號傳導來增強AdoMet 誘導的自噬過程，從而促進MCF-7凋亡[14]。同時，有研究表明，miR-224-5p 通過靶向MDA-MB-231 細胞中的Smad4 抑制自噬，miR-224-5p/Smad4-自噬信號軸可能是乳腺癌治療的新靶點[15]。此外，在TNBC 中，miR-20a 介導的自噬缺陷可能是乳腺腫瘤發(fā)生過程中miRNA 致癌功能的新機制[16]。小分子miR-376a 可以通過抑制ATG4B 和Beclin1 表達而抑制MCF-7 細胞和Huh-7 細胞因饑餓誘導的自噬[17]。進一步檢索發(fā)現(xiàn)，miRNA 可以通過調(diào)控細胞自噬水平進而影響腫瘤細胞的耐藥，如miR-181 不僅可以抑制乳腺癌MCF-7細胞本底的自噬水平，而且抑制藥物如依托泊苷和雷帕霉素誘導的自噬，進一步逆轉(zhuǎn)耐藥[18]。在乳腺癌中，miR-214 通過抑制自噬從而增強乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性[19]。具有自噬調(diào)節(jié)功能miR-129-5P 可以通過與Beclin1 基因3'UTR 序列結(jié)合下調(diào)后者表達，進而發(fā)揮其抑制多種腫瘤細胞如乳腺癌、肺癌等細胞自噬的作用[20]。

為了進一步探究復方斑蝥逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌耐藥的分子機制，我們對復方斑蝥處理前后的三陰性乳腺癌耐藥細胞MDA-MB-231/Doc 進行microRNA 芯片檢測，發(fā)現(xiàn)復方斑蝥能夠顯著上調(diào)miR-520d 水平，RealtimePCR 也驗證了這一結(jié)果；通過生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)Beclin1/BECN1 是miR-520d 潛在的靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-520d可能是診斷乳腺癌的一個特異性生物標志物，其在乳腺癌中高表達，尤其是HER-2陰性的乳腺癌[21]。近幾年來，miR-520d 與腫瘤的關系也逐漸被重視[22]，miR-520d 通過下調(diào)EphA2 的表達能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[23]；研究發(fā)現(xiàn)，在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 中，過表達miR-520d，可以減弱細胞的增殖和遷移[24]。因此隨后通過雙熒光素酶報告基因方法，我們確認miR-520d 能夠結(jié) 合 到Beclin1/BECN1 mRNA 的3′UTR 區(qū) 域，并 且miR-520d 能夠顯著抑制三陰性乳腺癌耐藥細胞中Beclin1/BECN1蛋白水平的表達。最后通過轉(zhuǎn)染miR-520d 的模擬物及抑制劑進入三陰性乳腺癌耐藥細胞中，結(jié)果顯示miR-520d 模擬物能夠顯著增加多西他賽對于耐藥細胞的敏感性，反之，miR-520d 的抑制劑能顯著抑制復方斑蝥逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌耐藥細胞耐藥的作用。這些結(jié)果明確了miR-520d/Beclin1信號軸是復方斑蝥逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌化療耐藥的主要機制。

總之，本實驗結(jié)果表明復方斑蝥通過上調(diào)三陰性乳腺癌耐藥細胞miR-520d 的表達，靶向Beclin1/BECN1 抑制三陰乳腺癌化療耐藥過程中過度自噬，從而增加三陰乳腺癌耐藥細胞對于化療藥物多西他賽的藥物敏感性，逆轉(zhuǎn)三陰乳腺癌化療耐藥。本課題的研究有助于闡明復方斑蝥、自噬、耐藥之間的內(nèi)在聯(lián)系，進一步了解三陰乳腺癌的化療耐藥機制，為臨床上以復方斑蝥作為輔助聯(lián)合用藥治療三陰乳腺癌提供實驗依據(jù)。