轉(zhuǎn)α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代的生理生化特性分析

陳教云 KHANQaisar 韋江璐 唐麗華 董登峰 李楊瑞

摘 ?要：本研究對(duì)已獲得的轉(zhuǎn)α-微管蛋白基因SoTUA的T2代甘蔗株系進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，從檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因甘蔗中選6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）與非轉(zhuǎn)基因野生型甘蔗對(duì)照（WT）進(jìn)行了低溫脅迫（4 ℃）處理，在處理0、5、10 d測(cè)定甘蔗葉片丙二醛（MDA）和滲透調(diào)節(jié)物（可溶性糖、可溶性蛋白）含量以及過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并采用RT-qPCR法分析了低溫處理下甘蔗葉片α-微管蛋白基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：在4 ℃低溫處理下，6個(gè)轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗與WT中α-微管蛋白的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)上調(diào)表達(dá)。脅迫后5、10 d轉(zhuǎn)基因株系的相對(duì)表達(dá)量始終高于WT甘蔗，低溫處理10 d時(shí)轉(zhuǎn)基因T1顯著高于其他株系（P<0.05）。在低溫脅迫下，甘蔗的MDA含量逐漸增高，而轉(zhuǎn)基因甘蔗增幅顯著低于WT甘蔗，10 d時(shí)轉(zhuǎn)基因株系MDA的含量比WT低41.77%（P<0.05）;POD活性在不同株系之間變化趨勢(shì)不同，但轉(zhuǎn)基因甘蔗POD活性顯著高于WT甘蔗（P< 0.05）;轉(zhuǎn)基因T1、T2、T4、T6株系的SOD活性隨著脅迫天數(shù)增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而WT與轉(zhuǎn)基因T3、T5的SOD活性逐漸升高;甘蔗的可溶性糖含量逐漸上升，轉(zhuǎn)基因甘蔗的可溶性蛋白含量在0 d顯著高于野生型甘蔗，脅迫后變化趨勢(shì)在株系之間有所差異;轉(zhuǎn)基因甘蔗SoTUA相對(duì)表達(dá)量與可溶性糖含量呈極顯著的正相關(guān)。利用隸屬函數(shù)綜合分析評(píng)價(jià)，抗寒性排序結(jié)果為：T3>T2>T1>T5>T6>T4>WT。在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因甘蔗SoTUA基因的上調(diào)表達(dá)能提高甘蔗的抗寒性，且具有遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：甘蔗;SoTUA基因;抗寒性;生理生化;遺傳穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：S556.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Six SoTUA transgenic lines （T1， T2， T3， T4， T5， T6） were selected from the positive SoTUA transgenic sugarcane lines of T2 generation after PCR amplification and sequencing. The transgenic lines and control （wild type， WT） were treated with low temperature stress （4 ℃）， and the level of malondialdehyde （MDA） and osmotic adjustment substances （soluble sugar， soluble protein） and activities of peroxidase （POD） and superoxide dismutase SOD was were determined， and RT-qPCR analysis was done for SoTUA gene expression in sugarcane leaves at 0， 5 and 10 days of the treatment. The relative expression of α-tubulin transcription factor in the SoTUA transgenic sugarcane and WT was up-regulated， getting higher with the cold stress time under low temperature treatment at 4 ℃. The relative expression level was always higher in the SoTUA transgenic lines than that in WT at 5 and 10 days of the treatment. At the 10th day， the relative expression level of the transgenic line T1 was significantly higher than that of other transgenic strains （P<0.05）. The content of MDA increased gradually under cold stress， but it was found significantly lower in the transgenic sugarcane than that in WT by 41.77% （P<0.05）. The trend of POD activity varied among different lines， but it was higher in the SoTUA transgenic lines than in WT （P<0.05）. The SOD activity of transgenic lines T1， T2， T4 and T6 increased first and then decreased while SOD activity of WT and transgenic lines T3 and T5 increased gradually. The soluble sugar content increased gradually and the trend of soluble protein varied in different strains. The expression of SoTUA gene was positively correlated with soluble sugar. Using the membership function comprehensive analysis statistic method， the ranking result for cold resistance was obtained as T3 > T2 > T1 > T5 > T6 > T4 > WT. Up-regulated expression of SoTUA gene in the transgenic sugarcane could improve cold resistance， and the genetic stability is good.

Keywords： sugarcane; SoTUA gene; cold resistance; physio-biochemical characteristic; genetic stability

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.008

甘蔗（Saccharum spp. hybrids）是熱帶、亞熱帶作物，是最重要的糖料作物[1]。低溫寒潮導(dǎo)致甘蔗生產(chǎn)和制糖工業(yè)發(fā)展受阻，經(jīng)濟(jì)受損[2-3]。培育甘蔗抗寒性品種是減緩低溫?fù)p傷的重要途徑，其研究倍受關(guān)注，然而傳統(tǒng)的甘蔗育種方法周期長(zhǎng)，無法滿足經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的需求[4]。隨著基因工程技術(shù)的不斷成熟，各種優(yōu)良的基因不斷被發(fā)現(xiàn)和利用，為甘蔗抗寒育種提供了有效的途徑[5]。

微管是細(xì)胞骨架的重要成分，植物微管由微管蛋白構(gòu)建而成，包括α、β和γ 共3個(gè)亞基[6]。微管蛋白是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ?，干擾微管的形成會(huì)影響與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起細(xì)胞凋亡[7]。近年來，關(guān)于微管與植物抗寒關(guān)系的研究受到高度重視。研究發(fā)現(xiàn)，溫度是影響微管聚合狀態(tài)的最敏感因素之一[8]。植物微管在低溫脅迫下迅速解聚，通過調(diào)控微管蛋白改變其生理機(jī)能抵御低溫[9]。Nyporko等[10]將嗜冷藻類Chloromonas綠單胞菌的α-微管蛋白268位氨基酸殘基插入牛筋草微管蛋白序列中，使得該蛋白表面與綠單胞菌蛋白表面結(jié)構(gòu)相似，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-微管蛋白分子表面局部疏水性發(fā)生改變，認(rèn)為其位點(diǎn)可提高植物的抗寒性。Schwarzerová等[11]研究表明，低溫下煙草中細(xì)胞核內(nèi)微管蛋白逐漸積累，復(fù)溫后核內(nèi)微管蛋白消失，核外微管蛋白重建。Bokros等[12]認(rèn)為，微管蛋白的極端羧基末端是植物微管蛋白調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵元件，低溫下可調(diào)節(jié)植物微管穩(wěn)定性。Paul等[13]從常綠樹茶中克隆α-微管蛋白基因CsTUA發(fā)現(xiàn)，低溫下α-微管蛋白表達(dá)上調(diào)，對(duì)維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定性起重要的作用。低溫脅迫下，在黃瓜根尖細(xì)胞中不同部位的微管穩(wěn)定性有所差異，且不抗寒品種冷穩(wěn)定性明顯低于抗寒品種，同時(shí)抗寒鍛煉后微管蛋白的含量有所增加[14]。

隨著TUA基因陸續(xù)報(bào)道，本課題組張保青[15]首次從甘蔗品種GT28葉片中克隆得到甘蔗α-微管蛋白基因SoTUA，對(duì)磷酸化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，在低溫下其位點(diǎn)能調(diào)節(jié)微管蛋白的穩(wěn)定性。孫波[16]運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將SoTUA基因成功導(dǎo)入煙草品種K346和甘蔗品種ROC22中，通過PCR檢測(cè)獲得了T0代植株。唐麗華等[17]得到轉(zhuǎn)α-微管蛋白基因SoTUA植株，低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因的植株的可溶性蛋白、可溶性糖的含量顯著高于對(duì)照，MDA含量顯著低于對(duì)照。本研究已獲得的轉(zhuǎn)SoTUA基因T2甘蔗株系需鑒定是否仍保持陽性，并需鑒定其遺傳穩(wěn)定性。因此對(duì)轉(zhuǎn)SoTUA基因的甘蔗T2代株系進(jìn)行低溫處理，測(cè)定其生理生化特性，并檢測(cè)SoTUA基因的表達(dá)，篩選出具有良好性狀的轉(zhuǎn)基因甘蔗株系，為轉(zhuǎn)基因分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為轉(zhuǎn)α-微管蛋白基因SoTUA的T2代甘蔗（ROC22）6個(gè)株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）和非轉(zhuǎn)基因甘蔗對(duì)照（WT）。

1.2 ?方法

試驗(yàn)于2018年在廣西大學(xué)甘蔗研究所溫室進(jìn)行。選擇無病害蔗莖切成單芽莖，用1%多菌靈滅菌30 min后放進(jìn)沙盤進(jìn)行沙培，待甘蔗長(zhǎng)出2～3葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的甘蔗苗移栽桶中，每桶2株，每株系5桶。待甘蔗長(zhǎng)至6～7葉時(shí)，放置于人工氣候室[光照強(qiáng)度250～300 μmol/（m2·s）]，14 h光周期，相對(duì)濕度為60%～70%進(jìn)行4 ℃低溫處理，在處理0、5、10 d等3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定甘蔗+1葉各項(xiàng)生理生化指標(biāo)和SoTUA基因表達(dá)量。

1.3 ?轉(zhuǎn)基因甘蔗植株鑒定

1.3.1 ?甘蔗DNA提取 ?甘蔗移栽成活后，采集甘蔗+1葉，利用改進(jìn)的SDS法提取甘蔗葉片總DNA[18]，用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3.2 ?PCR檢測(cè) ?根據(jù)pCAMBIA3300載體[16]上的標(biāo)記基因bar設(shè)計(jì)1對(duì)引物，分別為bar F（5-C?G?G-ATGAGCCCAGAACGACGCCC-3）和bar R（5- CGGTCAGATCTCGGTGACGGGCAC-3），擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為549 bp。以提取的轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片DNA為模版，進(jìn)行PCR檢測(cè)。以pCAMBIA3300- SoTUA-Bar重組質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，甘蔗品種ROC22野生型植株（WT）為陰性對(duì)照，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。切膠后使用膠回收試劑盒（Biospin Gel Extraction Kit，Bioflux公司）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 ?轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗低溫脅迫下基因的表達(dá)分析

1.4.1 ?總RNA的提取及cDNA的合成 ?采用Trizon試劑（康為世紀(jì)，中國(guó)）提取甘蔗葉片總RNA，具體操作按Trizon試劑盒說明書進(jìn)行。以RNA為模板，參照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，日本）進(jìn)行，cDNA于80 ℃保存。

1.4.2 ?低溫脅迫處理下SoTUA基因的RT-qPCR分析 ?以轉(zhuǎn)基因甘蔗株系及野生型（WT）甘蔗不同處理天數(shù)（0、5、10 d）葉片的cDNA為模板，以甘蔗GADPH基因作為內(nèi)參[16]，SoTUA為目的基因，采用Primer Express 3.0分別設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行篩選。內(nèi)參基因和SoTUA基因的基因熒光定量的引物見表1。

1.4.3 ?低溫脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因甘蔗株系中SoTUA基因的RT-qPCR分析 ?分析采用SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa，日本）試劑盒，共20 μL體系包括cDNA模板（50 ng/μL） 2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa，日本）10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.8 μL，RNase Free ddH2O 6.4 μL。內(nèi)參和目的基因分別設(shè)技術(shù)重復(fù)3次。參照張保青[15]報(bào)道利用2CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ?測(cè)定項(xiàng)目及方法

可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[19]，可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法[19]測(cè)定，丙二醛（MDA）含量采用TCA法測(cè)定[20]，超氧化物歧化酶（SOD）活性用NBT化學(xué)還原法測(cè)定[20]，過氧化物酶（POD）活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[21]，均以鮮重計(jì)。

1.6 ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并制作出柱狀圖，利用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)低溫脅迫0、5、10 d的α-微管蛋白表達(dá)量與各生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析[22]，在P<0.05水平上進(jìn)行方差分析。運(yùn)用隸屬函數(shù)分析低溫脅迫10 d時(shí)各生理指標(biāo)的結(jié)果，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因6個(gè)株系和對(duì)照的抗寒性的綜合評(píng)價(jià)[15]，計(jì)算方法如下：

2.2 ?PCR檢測(cè)結(jié)果

甘蔗PCR結(jié)果如圖2所示，在正對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系條帶在549 bp位置，H2O與野生型甘蔗549 bp無條帶，出現(xiàn)2條帶的原因可能是由于引物特異性較差。將轉(zhuǎn)基因PCR 549 bp處產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后測(cè)序，結(jié)果顯示與目的基因擴(kuò)增片段的序列一致，說明6個(gè)甘蔗株系均為轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗。

2.3 ?RNA提取結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3）所示，WT野生型甘蔗和6個(gè)轉(zhuǎn)基因甘蔗株系28S與18S、5S條帶清晰、銳利、無拖尾彌散現(xiàn)象，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 ?低溫脅迫下SoTUA基因RT-qPCR分析

如圖4所示，隨著低溫脅迫的時(shí)間增加，WT和轉(zhuǎn)基因株系的SoTUA基因的相對(duì)基因表達(dá)量均呈上調(diào)表達(dá)，總體上變化趨勢(shì)一致，其中在0～5 d上調(diào)表達(dá)較為緩慢，5～10 d上調(diào)表達(dá)急劇;0 d時(shí)，T4表達(dá)量最高，T4、T6顯著高于野生型甘蔗;處理5 d時(shí)，WT的SoTUA基因的相對(duì)表達(dá)量低于轉(zhuǎn)基因株系，且與T1、T2、T3、T4、T6株系達(dá)到顯著性差異（P<0.05）;10 d時(shí)，所有轉(zhuǎn)基因株系的SoTUA基因表達(dá)量高于WT，其中T1和T3表達(dá)量分別是WT的2.2和1.7倍。

2.5 ?低溫脅迫下轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗的生理生化變化

2.5.1 ?低溫脅迫下甘蔗葉片可溶性糖含量的變化 ?由圖5可知，在低溫脅迫下，WT和轉(zhuǎn)基因甘蔗的可溶性糖含量均呈上升的趨勢(shì)，上升的幅度隨脅迫時(shí)間不斷增大，株系與株系之間上升幅度有所不同。0 d時(shí)，WT可溶性糖含量顯著高于轉(zhuǎn)基因甘蔗T1、T2、T3、T4、T6，與T5無顯著性差異。5 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因甘蔗T2可溶性糖含量顯著高于WT，是WT的1.7倍。在10 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系T2、T3的可溶性含量急劇增加，顯著高于WT，分別是WT的3.2和2.6倍;轉(zhuǎn)基因株系T1、T5、T6與WT可溶性糖含量增加緩慢，無顯著性差異;WT的可溶性糖含量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系T4。

2.5.2 ?低溫脅迫下甘蔗葉片可溶性蛋白含量的變化 ?如圖6所示，在低溫脅迫下，不同株系甘蔗的可溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)各有不同，野生型甘蔗WT、轉(zhuǎn)基因甘蔗株系T1、T3、T5、T6的可溶性蛋白含量逐漸降低，轉(zhuǎn)基因株系T2、T4呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)。在0 d時(shí)，WT的可溶性蛋白含量與轉(zhuǎn)基因株系T1無顯著差異，但顯著低于其他轉(zhuǎn)基因株系;5 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系T3、T6的可溶性蛋白含量顯著高于其他株系，分別是WT的1.5、1.4倍，而轉(zhuǎn)基因株系T2、T4顯著低于WT;10 d時(shí)，與5 d相比轉(zhuǎn)基因株系T1、T3、T6的可溶性蛋白含量略有下降，轉(zhuǎn)基因株系T2、T4分別為5 d時(shí)的1.6、1.9倍，轉(zhuǎn)基因株系T1、T2、T3、T6顯著高于WT。

2.5.3 ?低溫脅迫下甘蔗葉片MDA含量的變化 ?如圖7所示，在0 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系T6的MDA含量顯著大于其他株系，而其他株系間無顯著性差異。低溫處理后，WT和轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量總體呈一個(gè)上升的趨勢(shì)，5 d時(shí)，WT的MDA含量顯著高于轉(zhuǎn)基因甘蔗T2、T4、T5、T6;10 d時(shí)，WT的MDA含量急劇升高，是5 d的1.7倍，且顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因株系T3的略下降，而在轉(zhuǎn)基因株系中T5的MDA含量較高，與其他轉(zhuǎn)基因株系無顯著性差異。

2.5.4 ?低溫脅迫下甘蔗葉片POD活性的變化 ?由圖8可知，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因甘蔗和WT葉片的POD活性均呈下降的趨勢(shì)。在低溫處理0 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系T1、T2、T5、T6的POD值顯著高于WT、T3、T4。在5 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因甘蔗T1、T2、T3、T5、T6的POD活性顯著高于野生型WT，其中轉(zhuǎn)基因T1的POD值是WT的1.6倍，且顯著高于其他轉(zhuǎn)基因株系。10 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系T3的POD活性急劇下降，且顯著低于WT和其他轉(zhuǎn)基因株系;轉(zhuǎn)基因T5的下降較緩慢，仍顯著高于WT，是WT的1.8倍。

2.5.5 ?低溫脅迫下甘蔗葉片SOD活性的變化 ?由圖9可知，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因甘蔗T1、T2、T4、T6株系呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，而野生型甘蔗、轉(zhuǎn)基因T3、T5株系則呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在0 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因甘蔗T1的SOD活性顯著高于WT，而野生型甘蔗SOD活性顯著高于T2、T3、T4、T5、T6;5 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因甘蔗株系T2、T4、T5的SOD活性急劇升高，且顯著高于WT，分別是WT的2、2.7、1.4倍;10 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系T5的SOD活性達(dá)到最大值，與WT、T4無顯著性差異，而T2達(dá)到最小值，顯著小于WT。

2.6 ?不同株系的耐寒性綜合評(píng)價(jià)

2.6.1 ?甘蔗葉片各生理生化指標(biāo)的相關(guān)分析 ?由表2反映了低溫處理0、5、10 d的SoTUA基因相對(duì)表達(dá)量、MDA含量、SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量6個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性。由表2可知，在整個(gè)低溫期間，SoTUA基因相對(duì)表達(dá)量與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，與可溶性蛋白含量、POD活性呈負(fù)相關(guān)，與SOD活性呈正相關(guān)但不顯著，與MDA含量呈顯著正相關(guān);可溶性蛋白含量與SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，與POD活性呈顯著正相關(guān);POD活性與可溶性糖含量、丙二醛含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.6.2 ?隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià) ?植物抗寒能力的強(qiáng)弱是由多種因素相互作用協(xié)同調(diào)控的，綜合評(píng)估多個(gè)指標(biāo)可以彌補(bǔ)單因素評(píng)價(jià)的片面性，綜合反映植物的抗寒性。本研究應(yīng)用處理10 d時(shí)的超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過氧化物酶活性、丙二醛含量指標(biāo)的測(cè)定值，利用隸屬函數(shù)對(duì)不同甘蔗株系進(jìn)行抗寒性的綜合評(píng)估。計(jì)算結(jié)果SOD活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、POD活性、MDA含量的權(quán)重系數(shù)分為20.17、23.90、15.21、22.34、17.96，其中可溶性蛋白的權(quán)重系數(shù)最大，說明可溶性蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因甘蔗抗寒能力影響最大。研究表明，按照綜合評(píng)價(jià)值，各品系抗寒性強(qiáng)弱排序?yàn)門3>T2>T1> T5>T6>T4>WT。綜合評(píng)價(jià)值反映了植株的抗寒能力強(qiáng)弱，數(shù)值越大抗寒能力越強(qiáng)。

3 ?討論

低溫是影響植物生長(zhǎng)的重要非生物因素之一，植物在低溫脅迫下，激活和誘導(dǎo)體內(nèi)的各信號(hào)通路，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)抵抗脅迫[23]。植物受到脅迫時(shí)，抗性強(qiáng)的植株微管會(huì)瞬間解聚與重組來抵御低溫，微管穩(wěn)定性越高[24-25]，抗寒能力越強(qiáng)，使用微管解聚藥劑可以提高植物抗寒能力[26]。張保青[15]研究表明，甘蔗在低溫誘導(dǎo)下，SoTUA表達(dá)量上升，并且抗寒品種比不抗寒品種SoTUA表達(dá)量高。孫波[16]發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)α-tubulin能提高煙草耐低溫性。楊洪等[27]從巴西橡膠樹克隆出HbTUA2基因，并發(fā)現(xiàn)在低溫下HbTUA上調(diào)表達(dá)。本研究中，隨著低溫處理的時(shí)間延長(zhǎng)，甘蔗SoTUA基因相對(duì)表達(dá)量不斷升高，5 d和10 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因甘蔗比野生型甘蔗的SoTUA基因相對(duì)表達(dá)量高，其中轉(zhuǎn)基因甘蔗T1株系在低溫處理10 d表達(dá)量最高，T6表達(dá)量最低。不同株系SoTUA的表達(dá)量有所區(qū)別，這可能與SoTUA基因的拷貝數(shù)和整合方式有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

微管的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)特性對(duì)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬砩顒?dòng)起重要調(diào)節(jié)作用[28]。植物在低溫鍛煉過程中改變生理和代謝從而適應(yīng)低溫[29]?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍资侵参锛?xì)胞中2個(gè)重要的滲透調(diào)節(jié)因子，并能保持細(xì)胞滲透平衡[30]。植物在低溫下大量積累可溶性糖和可溶性蛋白來提高細(xì)胞液濃度，增強(qiáng)植物保水能力，抵抗低溫。在低溫脅迫下，甘蔗的可溶性糖含量逐漸升高，抗寒性品種增幅較大[31];甘蔗不抗寒品種可溶性蛋白含量逐漸降低，而抗寒品種可溶性蛋白含量變化幅度不大[32]。本研究中，在低溫脅迫下，甘蔗可溶性糖含量逐漸增加，與劉光玲[33]研究一致，其中轉(zhuǎn)基因T2與T3增幅最大，不同株系間增幅不同，以野生型增幅較小;可溶性蛋白含量在轉(zhuǎn)基因株系中變化趨勢(shì)各不相同，野生型甘蔗可溶性蛋白逐漸減少，而轉(zhuǎn)基因甘蔗株系T1、T3、T6的可溶性蛋白含量在整個(gè)處理時(shí)期變化相對(duì)穩(wěn)定。本研究中，0 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系可溶性蛋白含量顯著高于野生型甘蔗，可能SoTUA基因過表達(dá)使得甘蔗葉片中的可溶性蛋白增加，隨著脅迫時(shí)間的增加，各株系變化趨勢(shì)沒有明顯的規(guī)律，推測(cè)可能為SoTUA基因插入位點(diǎn)不同，但具體的作用機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。

植物受到逆境脅迫時(shí)，發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)，生成MDA產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性[34]。膜的穩(wěn)定性是植物冷適應(yīng)最主要的特征[35]。在整個(gè)低溫鍛煉過程中，甘蔗的MDA含量總體呈上升的趨勢(shì)，這與何曉童等[36]報(bào)道低溫脅迫下紅蕓豆MDA含量增加的結(jié)果一致。本研究中，WT的MDA含量在5到10 d時(shí)急劇升高，說明甘蔗受到脅迫時(shí)，細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損害，WT甘蔗活性氧的生成速率大于保護(hù)酶的清除速率，導(dǎo)致MDA含量快速升高，而轉(zhuǎn)基因甘蔗MDA含量相對(duì)穩(wěn)定，膜脂受氧化程度較小，說明轉(zhuǎn)基因甘蔗中SoTUA基因過表達(dá)起到了積極的作用。

SOD和POD是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，其活性的變化可以反映植物抗逆能力[37-38]。植物受到逆境脅迫時(shí)，SOD 活性會(huì)迅速升高來清除超氧陰離子自由基保護(hù)細(xì)胞膜[39]。低溫脅迫初期，轉(zhuǎn)基因甘蔗與野生型甘蔗的SOD活性呈上升趨勢(shì)，轉(zhuǎn)基因甘蔗T2、T4、T5的SOD活性增幅顯著高于野生型，推測(cè)過量甘蔗表達(dá)SoTUA基因?qū)Φ蜏孛{迫初期SOD的活性影響較大。在低溫處理前后，野生型甘蔗SOD活性上升，說明甘蔗的SOD對(duì)低溫脅迫做出了應(yīng)激反應(yīng)，而10 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因甘蔗T1、T2、T3、T6的SOD活性和處理前的變化較小，酶的活性也顯著沒有野生型高，說明SOD感知低溫信號(hào)能力較弱，原因有待進(jìn)一步研究。冷脅迫過程中植物體內(nèi)產(chǎn)生POD氧化分解過氧化氫等毒性物質(zhì)[40]。本研究中，在低溫脅迫前后，甘蔗POD活性總體上呈下降趨勢(shì)，這與Tanha等[41]發(fā)現(xiàn)毛苕子種子在低溫下POD活性降低的結(jié)果一致。0 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因T1、T2、T5、T6的POD活性顯著高于其他株系，且顯著高于野生型甘蔗，推測(cè)SoTUA在0 d時(shí)下對(duì)甘蔗的POD的活性有促進(jìn)作用，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型甘蔗POD活性逐漸下降，而轉(zhuǎn)基因甘蔗的相對(duì)穩(wěn)定，說明SoTUA在細(xì)胞內(nèi)起保護(hù)性的作用，從而提高甘蔗耐寒性。

在低溫處理下，不同轉(zhuǎn)基因甘蔗株系的酶活變化趨勢(shì)各不相同。相關(guān)性分析結(jié)果[42]表明，SoTUA基因的相對(duì)表達(dá)量與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，推測(cè)微管參與糖的信號(hào)傳導(dǎo)，SoTUA基因的過表達(dá)有利于可溶性糖的積累。應(yīng)用隸屬函數(shù)分析法[43-44]，對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型甘蔗進(jìn)行排序，抗寒性強(qiáng)弱依次是T3>T2>T1>T5>T6>T4> WT，反映了不同轉(zhuǎn)基因甘蔗株系的抗寒能力。

4 ?結(jié)論

轉(zhuǎn)基因SoTUA甘蔗在低溫下SoTUA基因上調(diào)表達(dá)可提高甘蔗抗寒能力，且轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗T2代具有遺傳穩(wěn)定性。這為深入研究SoTUA在甘蔗抗寒作用的機(jī)理研究提供了參考，為篩選出穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因甘蔗株系提供了理論依據(jù)和育種材料。

參考文獻(xiàn)

[1] 李楊瑞， 楊麗濤. 20世紀(jì)90年代以來我國(guó)甘蔗產(chǎn)業(yè)和科技的新發(fā)展[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2009， 22（5）： 1469-1476.

[2] 李茂枝. 淺談甘蔗抗寒性及防寒措施[J]. 中國(guó)糖料， 1998（2）： 43-46.

[3] 鐘思強(qiáng)， 黃樹長(zhǎng)， 劉任業(yè). 2008年初寒潮低溫對(duì)廣西甘蔗生產(chǎn)的影響[J]. 廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009， 2（5）： 16-20.

[4] 李楊瑞， 楊麗濤， 黃東亮， 等. 甘蔗多用途育種材料創(chuàng)新及應(yīng)用[C/OL] //2014年中國(guó)作物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 北京： 中國(guó)作物學(xué)會(huì)， 2014： 108-109. http：//navi.cnki.net/kN?a-vi/DPaperDetail？pcode=CIPD&lwjcode=CSSC20141?0?0?0?1?&???-hycode=CSSC20140001.

[5] Garg M， Sharma N， Sharma S， et al. Biofortified crops generated by breeding， agronomy and transgenic approaches are improving lives of millions of people around the world[J]. Frontiers in Nutrition， 2018， 5： 12. doi： 10.3389/fnut.2018. 00012.

[6] Hammond J W， Cai D， Verhey K J. Tubulin modification and their cellular functions[J]. Current Opinion in Cell Biology， 2008， 20（1）： 71-76.

[7] Wang L， Nick P. Cold sensing in grapevine-which signals are upstream of the microtubular “thermometer”[J]. Plant Cell and Environment， 2017， 40： 2844-2857.

[8] Fosket D E， Morejohn L C. Structural and functional organization of tubulin[J]. Annual Review of Plant Physiology & Plant Molecular Biology， 1992， 43（1）： 201-240.

[9] Mizuno K. Induction of cold stability of microtubules in cultured tobacco cells[J]. Plant Physiology， 1992， 100： 740-748.

[10] Nyporko A I， Demchuk O N， Blium I B. Analysis of structural characteristics of alpha-tubulins in plants with enhanced cold tolerance[J]. Tsitologiia I Genetika， 2003， 37（6）： 3-11.

[11] Schwarzerová K， Petráek J， Panigrahi K C， et al. Intranuclear accumulation of plant tubulin in response to low temperature[J]. Protoplasma， 2006， 227（2-4）： 185-196.

[12] Bokros C L， Hugdahl J D， Blumenthal S S D， et al. Proteolytic analysis of polymerized maize tubulin： regulation of microtubule stability to low temperature and Ca2+ by the carboxyl terminus of β-tubulin[J]. Plant Cell & Environment， 2010， 19（5）： 539-548.

[13] Paul A， Lal L， Ahuja P S， Kumar S. Alpha-tubulin （CsTUA） up-regulated during winter dormancy is a low temperature inducible gene in tea [Camellia sinensis （L.） O. Kuntze][J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39（4）： 3485-3490.

[14] 趙金莉， 趙志軍， 張 ?紅. 黃瓜根尖細(xì)胞中微管冷穩(wěn)定性和微管蛋白與其抗寒性的關(guān)系[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2006， 26（2）： 188-192.

[15] 張保青. 低溫脅迫下甘蔗后期生理特性及差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2013.

[16] 孫 ?波. 低溫脅迫對(duì)甘蔗幼苗根系生長(zhǎng)代謝的影響和相關(guān)基因 α-tubulin 的功能研究[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2016.

[17] 唐麗華， 黃 ?嬋， 陳教云， 等. 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn) SoTUA 基因甘蔗生理生化特性的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019， 50（5）： 950-956.

[18] 邵 ?敏. 甘蔗宿根矮化病病原菌膜蛋白 Lxx18460 基因的特性研究[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2015.

[19] 李合生， 孫 ?群， 趙世杰， 等. 植物生理生化試驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000： 195-261

[20] 陳建勛， 王曉峰. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第二版）[M]. 廣州： 華南理工大學(xué)出版社， 2006： 121-124.

[21] 楊麗濤， 李楊瑞， 莫家讓. 噴施“多效好”對(duì)甘蔗葉片幾個(gè)生理生化特性的效應(yīng)研究初報(bào)[J]. 廣西農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 1990， 9（1）： 79-83.

[22] 李小琴， 張鳳良， 楊 ?湉， 等. 橡膠樹野生種質(zhì)資源抗寒性評(píng)價(jià)及其與生長(zhǎng)的相關(guān)性分析[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 39（2）： 44-51.

[23] Moliterni V M C， Paris R， Onofri C， et al. Early transcriptional changes in Beta vulgarisin response to low temperature[J]. Planta， 2015， 242（1）： 187-201.

[24] Abdrakhamanova A， Wang Q Y， Khokhlova L， et al. Is microtubule disassembly a trigger for cold acclimation[J]. Plant and Cell Physiology， 2003， 44（7）： 676-686.

[25] 王 ?靜. 不同溫度脅迫下西瓜細(xì)胞水平的抗性機(jī)制研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2015： 40-57.

[26] 程仁花. 微管解聚在擬南芥適應(yīng)低溫脅迫中的作用[D]. 沈陽： 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[27] 楊 ?洪， 鄧 ?治， 劉 ?輝， 等. 巴西橡膠樹α-微管蛋白HbTUA2基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2017， 53（1）： 55-65.

[28] Wasteneys G O， Galway M E. Remodeling the cytoskeleton for growth and form： an overview with some new views[J]. Annual Review of Plant Biology， 2003， 54（1）： 691-722.

[29] Renaut J， Hausman J F， Wisniewski M E. Proteomics and low-temperature studies： bridging the gap between gene expression and metabolism[J]. Physiologia Plantarum， 2006， 126（1）： 97-109.

[30] Xiong L， Zhu J K. Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress[J]. Plant Cell & Environment， 2010， 25（2）： 131-139.

[31] 丘立杭. 不同甘蔗品種低溫脅迫下的生理生化特性及其蛋白質(zhì)表達(dá)分析[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2010.

[32] 陸思思. 低溫脅迫下不同耐寒性甘蔗節(jié)間生理生化特性及蛋白表達(dá)分析[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2012.

[33] 劉光玲. 低溫脅迫對(duì)甘蔗幼苗根系生長(zhǎng)和生理生化代謝的影響[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2011.

[34] Sharma N， Arrigoni G， Ebinezer L B， et al. A proteomic and biochemical investigation on the effects of sulfadiazine in Arabidopsis thaliana[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2019， 178： 146-158.

[35] Munns R. Comparative physiology of salt and water stress[J]. Plant Cell and Environment， 2002， 25（2）： 239-250.

[36] 何曉童， 王盛祥， 王玉萍. 低溫弱光對(duì)紅蕓豆幼苗生長(zhǎng)及生理生化特性的影響[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019， 54（1）： 80-88.

[37] Ullah H， OudhAl-Johny B， AL-Ghamdi K M S， et al. Endophytic bacteria isolated from Solanum nigrum L.， alleviate cadmium （Cd） stress response by their antioxidant potentials， including SOD synthesis by sodA gene[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2019， 174： 197-207.

[38] Ma C， He M， Zhong Q， et al. Uptake， translocation and phytotoxicity of antimonite in wheat （Triticum aestivum）[J]. Science of the Total Environment， 2019， 669： 421-430.

[39] Ignatenko A， Talanova V， Repkina N， et al. Exogenous salicylic acid treatment induces cold tolerance in wheat through promotion of antioxidant enzyme activity and proline accumulation[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2019， 41（6）： DOI： 10.1007/s11738-019-2872-3.

[40] 劉零怡， 趙丹瑩， 鄭 ?楊， 等. 植物在低溫脅迫下的過氧化氫代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2009， 36（11）： 1701- 1708.

[41] Tanha Y， Fallah E， Pessarakli S. Effects of seed priming on growth and antioxidant components of hairy vetch （Vicia villosa） seedlings under chilling stress[J]. Journal of Plant Nutrition， 2019， 42（5）： 428-443.

[42] 張 ?建， 蔣細(xì)旺. 利用隸屬函數(shù)法對(duì)不同施肥處理下藜蒿的抗寒性綜合評(píng)價(jià)[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2016， 13（15）： 13-16.

[43] 王一峰， 趙淑玲， 王 ?瀚. 不同核桃種質(zhì)展葉期抗寒性的綜合評(píng)價(jià)[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究， 2019（1）： 50-60.

[44] 于慶帆， 王海琪， 白 ?茹. 隸屬函數(shù)法對(duì)伊犁地區(qū)‘樹上干杏不同株系抗寒性的評(píng)價(jià)[J]. 分子植物育種， 2018， 16（8）： 273-278.