不同甘蔗品種根際土壤酶活性及微生物群落多樣性分析

農(nóng)澤梅 史國(guó)英 曾泉 葉雪蓮 秦華東 胡春錦

摘 ?要：通過(guò)桶栽試驗(yàn)，比較了8個(gè)甘蔗品種吸氮效率的差異以及不同品種根際土壤酶活性和微生物群落多樣性的差異，以期為甘蔗生產(chǎn)上的選種以及蔗地土壤生產(chǎn)力的維持提供科學(xué)支持。在甘蔗大生長(zhǎng)期末期收集甘蔗植株和根際土壤，比較不同品種甘蔗植株的吸氮效率和氮肥利用率、測(cè)定根際土壤蔗糖酶以及脲酶活性、利用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)甘蔗根際細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明，不同甘蔗品種在大生長(zhǎng)期末期的吸氮效率存在一定差異，8個(gè)品種的植株平均吸氮效率為17.95%～27.57%，氮肥利用率為22.15%～34.02%，其中吸氮效率及氮肥利用率最高的品種是‘桂糖44號(hào)，最低的是‘桂選B9;8個(gè)品種的根際土壤蔗糖酶活性3.51～6.56 mg/（g·d），脲酶活性1.12～ 1.42 mg/（g·d），不同品種間存在一定差異，土壤酶活性表現(xiàn)較高的品種為‘桂糖48號(hào)和‘新臺(tái)糖22號(hào)，而‘粵糖93159的土壤酶活相對(duì)較低。高通量測(cè)序分析結(jié)果顯示，8個(gè)不同品種甘蔗根際土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)存在一定差異，不同品種間在優(yōu)勢(shì)菌群組成上差異不顯著，主要差異表現(xiàn)在優(yōu)勢(shì)菌屬的豐度上，其中‘桂糖44號(hào)和‘粵糖93159均以Bacillus為最主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，而其他6個(gè)品種的主要優(yōu)勢(shì)菌屬均為Chryseolinea。冗余分析結(jié)果顯示，甘蔗氮吸收率、土壤堿解氮含量以及土壤pH對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響最大;相關(guān)性分析表明，不同甘蔗品種吸氮效率的差異以及部分土壤理化指標(biāo)均與根際土壤微生物群落中不同優(yōu)勢(shì)菌門(mén)存在一定的相關(guān)性;根系微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異可能在一定程度上影響了甘蔗的吸氮效率。本研究結(jié)果初步揭示了不同甘蔗品種氮肥利用率與根際微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)關(guān)系，為深入研究甘蔗根際微生物多樣性及功能與環(huán)境因子之間的關(guān)系提供了借鑒。

關(guān)鍵詞：甘蔗;根際土壤;土壤酶活;微生物群落多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S154 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to provide scientific support for the selection of sugarcane production and the maintenance of sugarcane soil productivity， the differences in nitrogen uptake efficiency of eight sugarcane varieties and the effects of different varieties on the enzyme activities and microbial community diversity in the rhizosphere soil were compared through the barrel cultivation experiment. Sugarcane plants and rhizosphere soils were collected at the end of large growth stage of sugarcane， and nitrogen utilization efficiency， invertase and urease activities in the rhizosphere soil of different sugarcane varieties were measured and compared. Meanwhile， the bacterial community structure of the sugarcane rhizosphere soil was determined and analyzed by the Miseq high-throughput sequencing technology. The nitrogen uptake efficiency of different sugarcane varieties was different. The average nitrogen uptake efficiency of the eight varieties was 17.95%27.57%， and the nitrogen use efficiency was 22.15%34.02%. The highest nitrogen uptake efficiency was for GT44， and the lowest was for B9. The invertase activity of the rhizosphere soil was 3.516.56 mg/（g·d）， and there were significant differences among different cultivars. But the urease activity was 1.121.42 mg/（g·d）， and there was few differences among different varieties. GT48 and ROC22 were the two varieties with higher soil enzyme activity in the rhizosphere. The results of high-throughput sequencing showed that there were some differences in the bacterial population structure in the rhizosphere soil of the eight sugarcane varieties， but there was no significant difference among different varieties in the composition of the dominant bacteria， and the main difference was in the abundance of the dominant genera. Bacillus was the dominant genus for GT44 and Y93159， while Chryseolinea was the dominant genus for the other six varieties. Redundancy analysis （RDA） showed that the nitrogen absorption efficiency of sugarcane， the content of available N and pH value of soil had the greatest effect on the soil microbial community structure. Correlation analysis showed that the nitrogen absorption efficiency of sugarcane and soil physiochemical characteristics were significantly correlated with different dominant microbial communities. This study would deepen the understanding of the microbial community in the sugarcane rhizosphere and provide references for the relation between the microbial composition and diversity with environmental factors.

Keywords： sugarcane; rhizosphere soil; soil enzyme activity; microbial community diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.025

根際是植物根系與土壤交界的微域，是植物-土壤-微生物及其環(huán)境相互作用的一個(gè)特殊界面[1]。土壤酶與土壤微生物以及作物3者之間的關(guān)系是當(dāng)前土壤微生態(tài)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[2-3]。分析和比較不同作物的根際微生態(tài)特性，包括土壤酶活性以及微生物菌群結(jié)構(gòu)，可為從微生態(tài)學(xué)角度挖掘作物的低肥高效栽培潛力提供理論依據(jù)。

甘蔗（Saccharum officinarum）是世界上最重要的糖料和能源作物。我國(guó)是產(chǎn)蔗大國(guó)，其中廣西是中國(guó)最大的蔗糖生產(chǎn)區(qū)，甘蔗和蔗糖產(chǎn)量占全國(guó)的60% 以上[4]。然而，由于我國(guó)甘蔗主產(chǎn)區(qū)的主要耕作土壤類(lèi)型為紅壤土或赤紅壤土，具有pH低、養(yǎng)分含量低、硝化與反硝化活性低等特點(diǎn)，甘蔗生產(chǎn)上一直面臨著產(chǎn)量過(guò)于依賴(lài)化學(xué)肥料投入的困境，產(chǎn)業(yè)缺乏國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力;同時(shí)，大部分老蔗區(qū)還面臨著甘蔗品種退化、土地肥力下降的現(xiàn)狀。近年來(lái)，相關(guān)科研工作者已就甘蔗生產(chǎn)上的“肥藥雙減”問(wèn)題，從不同角度開(kāi)展了大量研究[5]。李文寶[6]和楊榮仲等[7]對(duì)不同氮水平條件下不同甘蔗品種材料的產(chǎn)量、耐低氮脅迫能力等進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)不同品種間存在顯著差異。但是，由于甘蔗遺傳背景比較復(fù)雜，目前關(guān)于甘蔗氮素高效利用機(jī)制的研究進(jìn)展比較緩慢。近年來(lái)，植物根際微生物區(qū)系與土壤可持續(xù)生產(chǎn)力的關(guān)系等相關(guān)研究受到越來(lái)越多的關(guān)注[8-9];對(duì)作物根際微域的研究，可以挖掘具有潛力的微生物資源、探究植物病害發(fā)生的機(jī)制[10]。不同作物、或者同一作物不同品種間的差異也可通過(guò)根際土壤酶活性和土壤微生物多樣性的差異表現(xiàn)出來(lái)，如具有不同抗逆性或抗病性存在差異的品種間的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也存在明顯的差異[11-16]。目前關(guān)于甘蔗根際土壤微生態(tài)區(qū)系的研究，多集中在不同栽培模式下對(duì)甘蔗的影響。前人研究表明，間、套種等種植模式可改善宿根蔗的土壤生態(tài)環(huán)境，而單一的宿根甘蔗連作容易導(dǎo)致其根際土壤總微生物量及酶活性下降，從而導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量下降，而宿根蔗套種大豆對(duì)其根際土壤微生物區(qū)系具有明顯的改善作用，從而使宿根蔗具有明顯的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)[17-20]。然而，關(guān)于不同甘蔗品種間根系微生態(tài)區(qū)系的差異，特別是氮效率不同的甘蔗品種間的根際微生物群落結(jié)構(gòu)及土壤酶活性的差異等，目前尚無(wú)系統(tǒng)的研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)分析和比較不同甘蔗品種吸氮效率的差異及其對(duì)根際土壤酶活性和微生物群落多樣性的影響，以期為甘蔗生產(chǎn)上的選種以及蔗地土壤生產(chǎn)力的維持提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年在廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地進(jìn)行，供試土壤為廣西甘蔗產(chǎn)區(qū)的典型紅壤土，為減少土壤的粘性，方便取甘蔗的根際土壤進(jìn)行分析，向紅壤土中混合了一定比例的菌糠作為甘蔗栽培土。將混合后的土壤分裝于甘蔗栽培桶內(nèi)，每桶15 kg?；旌显耘嗤恋膒H 6.89，速效氮含量為228.2 mg/kg。

供試甘蔗品種為：‘新臺(tái)糖22號(hào)（ROC22）、‘粵糖93159（Y93159）、‘桂選B8（B8）、‘桂選B9（B9）、‘桂糖42號(hào)（GT42）、‘桂糖44號(hào)（GT44）、‘桂糖46號(hào)（GT46）、‘桂糖48號(hào)（GT48）。甘蔗采用種莖單芽育苗，選取生長(zhǎng)基本一致的甘蔗幼苗進(jìn)行移栽，每桶種3個(gè)單株，每品種種植4桶，甘蔗桶栽后擺放于試驗(yàn)地中，自然條件下生長(zhǎng)。

甘蔗于2018年4月初移栽，6月初施肥1次，參照大田管理施肥用量，每桶施復(fù)合肥54 g，尿素14 g，氯化鉀15 g，進(jìn)行穴施，同時(shí)每桶培土5 kg;于9月上旬在甘蔗伸長(zhǎng)期末期對(duì)甘蔗植株進(jìn)行整株采收同時(shí)采集根際土壤用于實(shí)驗(yàn)分析。因此，甘蔗每桶栽培土壤的重量固定為20 kg，栽培土速效氮含量為228.220=4546 mg，約4.55 g;根據(jù)相關(guān)比例測(cè)算結(jié)果每桶施肥含氮量為19.46 g。

1.2 ?方法

1.2.1 ?甘蔗植株及根際土樣的收集與處理 ?去除每桶甘蔗表層5 cm的浮土，然后將整桶土壤拍散并取出完整的甘蔗植株，將根系上的土壤抖落回栽培桶的中，植株解析成根、莖、葉，分別清洗干凈并晾干后進(jìn)行稱(chēng)量、用切割機(jī)切碎并混合均勻，根據(jù)測(cè)定指標(biāo)需要取一定量烘干后粉碎，用于甘蔗植株氮素含量的測(cè)定。根據(jù)下式計(jì)算各處理甘蔗的氮素吸收效率以及氮素的相對(duì)利用率：

植株氮素累積量=植株干物重氮素含量

氮素吸收效率=[植株氮素累積總量/土壤的速效N（肥料N+土壤N）]100%

氮肥利用率=（植株N累積總量/肥料N）100%

由于取樣時(shí)甘蔗的根系已經(jīng)遍布整個(gè)栽培桶，故此除去表層土的整個(gè)栽培桶的土壤均作為根際土壤，每桶土樣混合均勻后，過(guò)1 mm篩，按擬分析指標(biāo)的需要分裝到無(wú)菌封口袋中保存?zhèn)溆?。土樣分別用于根際細(xì)菌種群多樣性分析、土壤pH、土壤總N、速效N含量和土壤酶活性測(cè)定等。

1.2.2 ?土壤pH和氮素含量測(cè)定 ?土壤風(fēng)干后用于pH和土壤氮素含量測(cè)定，參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[21]，其中土壤總氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法，土壤速效氮含量測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法，土壤pH測(cè)定采用電位測(cè)定法，水壤質(zhì)量比2.5∶1。

1.2.3 ?土壤脲酶及蔗糖酶活性測(cè)定 ?土壤樣本風(fēng)干后用于土壤酶活性的測(cè)定，其中土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法[22]測(cè)定，土壤蔗糖酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法[23]測(cè)定。

1.2.4 ?根際細(xì)菌群落多樣性測(cè)定 ?收集后的新鮮根際土壤保存于?80℃冰箱，提取土壤微生物DNA，經(jīng)檢測(cè)合格后用于構(gòu)建文庫(kù)，以各土壤樣品微生物總DNA為模板，以細(xì)菌V3+V4區(qū)特異引物（338F/806R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序分析，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序。細(xì)菌種群多樣性則通過(guò)在美吉生物i-sanger云平臺(tái)上提供的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行個(gè)性化分析。

Bacillus、Chryseolinea、Paenibacillus、Lysin?iba?c?i??llus、Truepera、Variibacter、Mesorhizobium和Brevi?bacillus等。根據(jù)以上菌屬在不同樣品中的OTU數(shù)量建立柱狀圖（圖4），結(jié)果顯示，GT44和Y93159均以Bacillus為最主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，而3類(lèi)芽孢菌Paenibacillus、Lysinibacillus、Breviba?cillus也是這2個(gè)品種根際細(xì)菌中的最主要菌屬之一;而其他6個(gè)品種的最優(yōu)勢(shì)菌屬均為Chryseolinea。

2.5 ?甘蔗根際土壤細(xì)菌群落的主要影響因子分析

為明確甘蔗的氮吸收率和土壤理化性質(zhì)（土壤氮素和堿解氮含量、土壤pH以及土壤脲酶和蔗糖酶活性對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響，在細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平上對(duì)土壤微生物群落進(jìn)行冗余分析（RDA），結(jié)果見(jiàn)圖5。RDA分析的前2個(gè)軸總共解釋了87.79% 的群落變化，第1個(gè)軸解釋了71.81%，第2個(gè)軸解釋了15.98%。甘蔗氮吸收率對(duì)土壤微生物群落的影響最顯著，其次是土壤堿解氮含量;6個(gè)不同影響因子總共解釋了92.41% 的群落變化，影響的順序?yàn)楦收岬章?土壤堿解氮含量>土壤pH值>土壤脲酶活性>土壤氮素含量>土壤蔗糖酶活性。

進(jìn)一步分析了6個(gè)不同環(huán)境因子與土壤微生物群落的關(guān)系，對(duì)土壤細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌群（門(mén)水平）和環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)分析，相關(guān)性Heatmap見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，僅甘蔗氮吸收率、土壤堿解氮含量和pH與部分優(yōu)勢(shì)菌群[綠彎菌門(mén)（Chlo?ro?f?l?e?xi）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）]存在顯著或極顯著相關(guān)性，其他4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群（Proteobacteria、Bacteroi??detes、Gemma?timon?a?detes和Deinococcus-Thermus）與相關(guān)環(huán)境影響因子的相關(guān)性均未達(dá)顯著水平。

3 ?討論

3.1 ?不同甘蔗品種的氮效率以及根際土壤部分理化性質(zhì)的差異

本研究分析了8個(gè)甘蔗品種在大生長(zhǎng)期末期的氮肥利用率以及根際土壤部分理化性質(zhì)的差異，結(jié)果表明，不同甘蔗品種的氮肥利用率存在一定差異，其中有2個(gè)甘蔗品種GT42和GT44的氮肥利用率大于30%，氮肥利用率最低的是B9，為22.15%;所有甘蔗品種根際土壤的pH均較種植前提高，品種間存在一定的差異;甘蔗采收以后不同處理間的土壤氮素、堿解氮含量以及土壤酶活性亦表現(xiàn)出一定的差異。分析結(jié)果顯示，甘蔗的氮肥利用率與反映土壤理化性質(zhì)的多個(gè)土壤環(huán)境因子之間未表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，卻一定程度上證明了不同甘蔗品種對(duì)根際土壤微生態(tài)的影響是有差異的。由于甘蔗的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，本研究?jī)H分析了甘蔗伸長(zhǎng)期末期這一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)信息。由于不同品種的生長(zhǎng)特性可能存在一定差異，因此，本研究結(jié)果未能全面反映品種間真實(shí)的差異。但是，由于伸長(zhǎng)期畢竟是甘蔗生長(zhǎng)一個(gè)最重要的時(shí)期，也是氮肥需求量最高的一個(gè)時(shí)期。因此，本研究結(jié)果是具有一定的代表性和參考意義的。

3.2 ?甘蔗根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的特征

基于高通量測(cè)序的分析結(jié)果表明，不同甘蔗品種根系微生物的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均存在一定的差異，但不同處理間主要菌群種類(lèi)基本相似，其主要差異表現(xiàn)在菌群的豐度上。在門(mén)分類(lèi)水平以及菌屬水平上，不同處理間優(yōu)勢(shì)菌屬的OUT數(shù)量都存在顯著差異。如不同甘蔗品種的根系微生物中都含以下8種已明確分類(lèi)的菌屬：Bacillus、Chryseolinea、Paenibacillus、Lysini?ba?ci?llus、Truepera、Variibacter、Mesorhizobium和Bre?vi?bacillus，但以上優(yōu)勢(shì)菌屬在不同甘蔗根系土壤樣本中的OTU數(shù)量差別較大。甘蔗品種GT44和Y93159均以Bacillus為最主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，另外3種芽孢桿菌Paenibacillus、Lysinibacillus以及Brevibacillus也是這2個(gè)品種根際細(xì)菌中的最主要菌屬之一，而其他6個(gè)品種的最優(yōu)勢(shì)菌屬均為Chryseolinea。上述多種芽孢桿菌屬細(xì)菌的相關(guān)種群已被研究證明為許多動(dòng)植物的益生菌，并已在生產(chǎn)上大量應(yīng)用[24-26];而Chryseolinea菌屬為一類(lèi)近年發(fā)現(xiàn)的菌群，據(jù)目前相關(guān)研究報(bào)道該菌屬細(xì)菌可能主要與生物降解相關(guān)[27-28]。因?yàn)椴煌荷飳W(xué)和生態(tài)學(xué)功能上的差異，甘蔗根系微生物優(yōu)勢(shì)菌群豐度的差異可能會(huì)最終影響根系土壤微域的生態(tài)學(xué)功能，從而影響不同品種的吸氮特性并導(dǎo)致品種間氮肥利用率的差異。

3.3 ?甘蔗根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系。

甘蔗根際土壤微生物群落與甘蔗氮素吸收率和部分土壤理化因子的冗余分析表明，不同品種甘蔗的氮吸收率對(duì)微生物群落的影響最顯著，其次是土壤堿解氮含量和pH，其他理化因子如土壤酶活性等對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)均有重要的影響，說(shuō)明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境關(guān)系密切。前人研究表明，植物種類(lèi)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有重要影響，相關(guān)研究表明，植株根系分泌物對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成具有選擇塑造作用，不同植物的根際微生物群落結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性和代表性[7-9]。由于本研究中所有供試甘蔗品種在栽培管理上保持一致，盡可能地減少了處理間土壤環(huán)境因子的差異。因此，引起甘蔗品種根際微生物區(qū)系差異的主要因子是由品種間的差異，而品種間的差異也導(dǎo)致了根際土壤理化性質(zhì)的差異。

4 ?結(jié)論

8個(gè)不同甘蔗品種大生長(zhǎng)期的吸氮效率及其氮肥利用率存在一定差異，品種間的差異也表現(xiàn)在根系土壤酶活以及根系微生物區(qū)系上，不同品種間根系微生物主要菌群豐度存在顯著差異。甘蔗氮效率與根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性;同時(shí)，由于不同菌群生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能上的差異，根系微生物優(yōu)勢(shì)菌群豐度的差異可能在一定程度上影響了甘蔗的吸氮效率。從本研究結(jié)果來(lái)看，甘蔗品種GT44的根系微生物菌群組成或許更適合植株的生長(zhǎng)和土壤肥力的維持，其氮肥利用率也是8個(gè)供試甘蔗品種中最高的，為34.02%。在今后研究工作中，將持續(xù)跟蹤不同甘蔗品種在各生育時(shí)期的生長(zhǎng)特性及其根系微域的變化，同時(shí)對(duì)甘蔗根際微生物研究將重點(diǎn)放在分析參與氮循環(huán)相關(guān)微生物菌群的豐度上，并將進(jìn)一步分析甘蔗品種的宿根性表現(xiàn)，擬為建立一套從根際微域環(huán)境的差異篩選適合蔗地土壤生產(chǎn)力維護(hù)的氮高效甘蔗品種的技術(shù)方法提供理論依據(jù)。

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