茉莉酸對萊茵衣藻代謝降解殺菌劑三氯生的影響機制

張晨怡，毛佳昊，苗馨文，劉 汀，熊曉輝，盧一辰

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800)

三氯生(triclosan,TCS)的化學(xué)名稱為2,4,4′-三氯-2′-羥基二苯醚,被廣泛應(yīng)用于個人護理產(chǎn)品、醫(yī)療用品中[1]。長期以來，隨著生活污水大量排放，殘留在各種環(huán)境中的三氯生被大量檢出，對水體環(huán)境造成極大污染。近年來，三氯生對水生動植物的急慢性毒性效應(yīng)和致畸作用被廣泛報道和關(guān)注[2-3]。2013年美國食品藥品監(jiān)督局宣布在日化用品中禁止使用三氯生。環(huán)境中大量殘留的三氯生可以通過食物鏈傳遞對人類健康構(gòu)成潛在威脅。因此，迫切需要研究高效綠色的三氯生降解方式。

微藻不僅是水生動物賴以生存的營養(yǎng)來源，也是水體環(huán)境中重要的代謝分解者。大量研究表明藻類能夠富集、濃縮和降解水體中化學(xué)污染物，例如：重金屬、農(nóng)藥和可持續(xù)性有機污染物等[4-5]。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一種生長周期和傳代時間短、可固體或液體培養(yǎng)的單細胞真核綠藻，由于其具有遺傳背景和基因結(jié)構(gòu)清晰、易于分子生物學(xué)研究等特點，常被用作理想的模式生物[6]。梁永莉等[7]發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻對雙酚A具有一定的富集和降解能力。因此，激發(fā)藻類富集降解雙酚A等化學(xué)污染物的能力在環(huán)境修復(fù)應(yīng)用中具有很大的潛在價值。

茉莉酸類物質(zhì)(jasmonates，JAs)廣泛存在于高等植物體內(nèi)，主要包括茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸及其衍生物可作為信號分子誘導(dǎo)植物體內(nèi)防御基因的表達，調(diào)節(jié)植物對外源生物或者非生物脅迫的防御響應(yīng)。Armagan等[8]發(fā)現(xiàn)茉莉酸處理可提高煙草細胞內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、抗壞血酸過氧化物酶等抗氧化酶系的活力，緩解了甲咪唑煙酸對煙草的毒性作用。然而茉莉酸對微藻代謝外源有機污染物方面的研究還未見報道。本文中，筆者以萊茵衣藻為受試物，茉莉酸為研究對象，三氯生為處理試劑，從植物生理、酶學(xué)響應(yīng)以及毒物積累代謝3個方面研究茉莉酸對萊茵衣藻應(yīng)答三氯生脅迫反應(yīng)和代謝降解三氯生的影響機制，旨在建立一種通過激發(fā)微藻內(nèi)源代謝來提高水體中三氯生降解效率的綠色環(huán)境修復(fù)方式。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LRH-150-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；SW-C-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；5471R型臺式離心機，德國Eppendorff公司；GL-20G-II型冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；SPECTRUMLAB型紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊科技有限公司；JY92-IID型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝科器研究所；DL型24位固相萃取裝置，上海秉越電子儀器有限公司；Agilent2000型高效液相色譜儀，蘇州賽恩斯儀器有限公司。

分析純的NH4Cl、K2HPO4和KH2PO4，西隴化工股份有限公司；分析純的冰醋酸、甲醇、乙醇和丙酮，上海凌峰化工有限公司；文中所用試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 萊茵衣藻的培養(yǎng)和實驗設(shè)置

參考文獻[9]方法配制TAP藻培養(yǎng)基，并于121℃滅菌20 min，冷卻備用。接種一定體積的藻液至TAP培養(yǎng)基內(nèi)，25±2 ℃、相對濕度50%±5%、8 h/16 h的光/暗條件進行培養(yǎng)。待萊茵衣藻生長至對數(shù)期(OD600為0.6～0.8)后，按照實驗設(shè)置需求以每瓶50 mL進行分裝。

在生長量、葉綠素、電導(dǎo)率和丙二醛測定中，實驗設(shè)置7個處理組和1個對照組，具體為①空白對照組(CK)為未處理三氯生和茉莉酸；②0.05 JA為僅0.05 μmol/L茉莉酸處理；③0.15 JA為僅0.15 μmol/L茉莉酸處理；④0.45 JA為僅0.45 μmol/L茉莉酸處理；⑤TCS為僅2 mg/L三氯生處理；⑥0.05 JA+TCS為0.05 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同處理；⑦0.15 JA+TCS為0.15 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同處理；⑧0.45 JA+TCS為0.45 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同處理。每組設(shè)置3個平行。

1.3 萊茵衣藻生長量測定

準確吸取2 mL對數(shù)期的藻液，分別稀釋2、4、6、8、10倍，在750 nm處測定各稀釋度藻液的吸光值。同時取上述1 mL各稀釋度的藻液，經(jīng)過魯哥氏溶液固定后，在普通光學(xué)顯微鏡下，用血細胞計數(shù)板計數(shù)。根據(jù)藻的細胞數(shù)與OD600的線性關(guān)系得細胞數(shù)標準曲線y=18.12x-0.212 7(R2=0.997 4)。

取對數(shù)生長期的藻液按1.2節(jié)實驗設(shè)置進行處理，在0、24、48、72和96 h分別取樣，測定其在750 nm處的吸光值A(chǔ)750，根據(jù)上述標準曲線計算細胞數(shù)[10]。

1.4 細胞光合色素測定

取對數(shù)生長期的藻液按1.2實驗設(shè)置進行處理，處理后96 h取樣，用80%乙醇提取色素，采用光密度法測定665 nm處吸光值，按式(1)來計算細胞總?cè)~綠素含量[11]。

ρ(總?cè)~綠素)=(6.10A665+20.04A649)×0.6

(1)

1.5 電導(dǎo)率的測定

取對數(shù)生長期的藻液按1.2節(jié)實驗設(shè)置進行處理，在24、48、72、96 h分別取樣，并用電導(dǎo)儀測定初始電導(dǎo)率，記為E0。將樣品置于25 ℃下30 min，記錄此刻電導(dǎo)率為E1。再將樣品置于95 ℃水浴20 min，再次測定電導(dǎo)率，記為E2。通過式(2)計算電導(dǎo)率E。

(2)

1.6 丙二醛的測定

取對數(shù)生長期的藻液按1.2實驗設(shè)置進行處理，在0、24、48、72和96 h分別取樣，采用丙二醛(MDA)測試盒(貨號：A0031，TBA法)測定細胞內(nèi)丙二醛含量。

1.7 萊茵衣藻抗氧化酶活力測定

取對數(shù)生長期的藻液設(shè)置對照組和處理組，分別為①空白對照組(CK)為未處理三氯生和茉莉酸；②0.15 JA為僅0.15 μmol/L茉莉酸處理；③TCS為僅2 mg/L三氯生處理；④0.15 JA+TCS為0.15 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同處理，每組設(shè)置3個平行。將各組藻液10 000 r/min離心10 min，去上清液，加入3 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)，混勻后在冰浴保護下進行細胞破碎后10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，保存待用。依照試劑盒操作說明測定各組細胞中過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、多酚氧化酶(PPO)酶活力。

1.8 萊茵衣藻體內(nèi)三氯生積累量測定和代謝產(chǎn)物分析

取對數(shù)生長期的藻液設(shè)置對照組和處理組，分別為①TCS為僅2 mg/L三氯生處理；②0.15 JA+TCS為0.15 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同處理，每組設(shè)置3個平行。每個處理各取80 mL的藻液，10 000 r/min離心20 min，分別收集藻細胞和30 mL上清液待處理。將30 mL上清液完全通過C18固相萃取柱，用3 mL 80%(體積分數(shù))甲醇溶液洗脫并過0.22 μm濾膜后上機檢測。

收集藻細胞中加入75%(體積分數(shù))的丙酮溶液10 mL，室溫下超聲提取10 min。10 000 r/min離心6 min后取上清液。將上清液氮吹至剩水相，過C18固相萃取柱，用3 mL 80%(體積分數(shù))甲醇溶液洗脫并過0.22 μm濾膜后上機檢測。液相色譜條件：色譜柱C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30.0 ℃；進樣體積20.0 μL；流速1.0 mL/min；流動相甲醇和水(體積比75∶ 25)；檢測器為紫外檢測器；檢測波長230 nm。質(zhì)譜條件為ESI正離子模式；掃描范圍為50～1 000；分析模式為IDA；裂解能量為10 eV。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用單因素分析法進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均使用Excel軟件進行統(tǒng)計處理，采用標準差對各處理組之間的差異進行統(tǒng)計學(xué)處理，并進行顯著性差異分析(P<0.05)，圖中顯著性差異均用字母(a、b、c、d)或*標注。生理指標數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，代謝數(shù)據(jù)至少重復(fù)2次，使用Origin軟件進行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 茉莉酸對三氯生脅迫下萊茵衣藻細胞數(shù)的影響

茉莉酸對三氯生脅迫下萊茵衣藻細胞數(shù)的影響如圖1所示。

圖1 茉莉酸作用對三氯生脅迫下萊茵衣藻細胞數(shù)的影響

由圖1可知，TCS處理組藻細胞數(shù)隨著處理時間增加而逐漸降低。加藥處理24 h的藻細胞數(shù)為對照組的78.60%，48 h時僅為對照組的50.03%。可見，TCS對萊茵衣藻生長有明顯抑制作用。當加入0.05、0.15和0.45 μmol/L茉莉酸處理96 h后，藻細胞數(shù)分別是單獨TCS處理組的2.38、2.50和2.54倍。可見，外源施用茉莉酸緩解了TCS對細胞衰亡的促進作用。然而，從僅JA處理組和對照相比來看，在0.45 μmol/L JA處理24 h的細胞數(shù)僅為CK組的78.40%，到96 h時僅為CK組的52.39%，說明高濃度茉莉酸處理反而抑制了藻細胞生長。

2.2 茉莉酸對三氯生脅迫下萊茵衣藻丙二醛的影響

丙二醛是當組織體內(nèi)的器官衰老凋亡或受到外界逆環(huán)境刺激時，細胞質(zhì)膜發(fā)生的過氧化最終產(chǎn)物之一，是衡量細胞損傷程度的重要因素[12]。茉莉酸對三氯生脅迫下萊茵衣藻(以其鮮質(zhì)量來計算)丙二醛含量的影響如圖2所示。

圖2 茉莉酸作用對三氯生脅迫下萊茵衣藻丙二醛(MDA)含量的影響

由圖2看出，CK組MDA含量僅為TCS組的26.9%，說明萊茵衣藻細胞在三氯生作用下發(fā)生膜脂過氧化。當加入茉莉酸后，被三氯生誘導(dǎo)上升的MDA含量均有明顯下降?？梢?，JA緩和了TCS對萊茵衣藻的氧化脅迫。

2.3 茉莉酸對三氯生脅迫下萊茵衣藻葉綠素含量的影響

葉綠素是萊茵衣藻進行光合作用的重要元素，具有吸收、傳遞以及轉(zhuǎn)化光能的作用。在環(huán)境因素脅迫下，葉綠素含量往往會降低，進而導(dǎo)致光合作用下降[12]。茉莉酸對三氯生脅迫下萊茵衣藻葉綠素含量的影響如圖3所示。

圖3 茉莉酸作用對三氯生脅迫下萊茵衣藻總?cè)~綠素含量的影響

由圖3可知，與對照組(CK)相比，TCS處理顯著降低了萊茵衣藻葉綠素含量。但是，隨著外源添加茉莉酸從0.05 μmol/L升至0.45 μmol/L，萊茵衣藻葉綠素含量也逐漸恢復(fù)。特別在0.45 μmol/L JA處理后，葉綠素含量與TCS處理組相比增加了53.2%。單獨添加0.15 μmol/L JA的萊茵衣藻與對照組相比，葉綠素含量是對照組的1.33倍，進一步說明茉莉酸可以提高萊茵衣藻光合作用。

2.4 茉莉酸對三氯生脅迫下萊茵衣藻電導(dǎo)率的影響

當受到外界環(huán)境的脅迫時，細胞質(zhì)膜往往最先作出反應(yīng)，導(dǎo)致其選擇透過性降低或喪失，因此質(zhì)膜通透性的變化可以反映出細胞功能受損程度[13]?？疾燔岳蛩釋θ壬{迫下萊茵衣藻電導(dǎo)率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 茉莉酸作用對三氯生脅迫下萊茵衣藻電導(dǎo)率的影響

從圖4可知，在0 h時各受試組電導(dǎo)率幾乎無差異。在96 h時，TCS組的相對電導(dǎo)率最高，是CK組的1.03倍；JA組和TCS+JA組的電導(dǎo)率均比TCS處理組低?？梢姡琂A改善了因TCS造成的藻細胞通透性改變。

2.5 茉莉酸作用下三氯生對萊茵衣藻抗氧化酶活力的影響

三氯生處理導(dǎo)致藻細胞中MDA含量增加，并伴隨著電解質(zhì)滲漏增大，顯示細胞膜發(fā)生了膜脂過氧化而被氧化損傷。過氧化物酶(POD)作為抗氧化體系中重要組成之一，主要作用是將植物體內(nèi)過量的活性氧轉(zhuǎn)化為H2O，緩解脅迫。在茉莉酸作用下，三氯生對萊茵衣藻抗氧化酶活力的影響如圖5所示。由圖5(a)可知，TCS處理提高了POD酶活力，比CK增高了1.74%；而外源施用JA后，其酶活力與CK組相比均有下降，分別為30.34%和15.41%?？赡艿脑蚴荍A加強了藻自身對活性氧自由基的清除，緩解了三氯生的氧化脅迫作用，導(dǎo)致POD酶活力降低。

圖5 茉莉酸作用下三氯生對萊茵衣藻抗氧化體系的影響

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是植物體內(nèi)重要的II相解毒酶，其主要功能是催化某些內(nèi)源的或外來有害物質(zhì)的親電子基團與還原型的谷胱甘肽相偶聯(lián)，增強其疏水性，使其易于被排出細胞膜，從而緩解有害物質(zhì)的毒害，達到解毒的目的[14]。由圖5(b)可知，三氯生脅迫激發(fā)了GST的活性，TCS處理組GST活力比CK提高了37.83%。相反，TCS+JA組與TCS組相比，其酶活力下降了26.83%，和 POD酶活力趨勢一致。進一步說明茉莉酸存在下細胞毒性減少，GST酶活力的誘導(dǎo)效應(yīng)減弱。

多酚氧化酶(PPO)，是多酚化合物氧化過程中的關(guān)鍵酶[14]。多酚氧化酶在植物體內(nèi)廣泛存在，當機體內(nèi)自由基大量存在時會誘導(dǎo)PPO大量表達，因此可以作為細胞的氧化指標之一[15]。由圖5(c)可知，與CK組相比，TCS組的PPO活力提高了328.14%，JA組的PPO活力下降了56.20%，TCS+JA組的PPO活力下降了91.15%。進一步表明外源茉莉酸的加入促進了藻細胞對自由基的清除，藻細胞體內(nèi)自由基的積累量下降，PPO活性降低。

2.6 茉莉酸對萊茵衣藻體內(nèi)三氯生積累量的影響

茉莉酸對萊茵衣藻體內(nèi)三氯生積累量的影響如圖6所示。由圖6(a)可得，TCS處理組藻細胞內(nèi)三氯生含量明顯較高，是TCS+JA處理組的1.67倍。然而兩組培養(yǎng)基內(nèi)三氯生含量無顯著差異(圖6(b))。可見，茉莉酸促進了藻細胞內(nèi)三氯生的代謝降解而非促進藻細胞對三氯生的吸收，減輕了三氯生對藻細胞的毒害作用。

圖6 藻細胞內(nèi)三氯生積累量(a)及其培養(yǎng)基中殘留量(b)

2.7 茉莉酸對萊茵衣藻體代謝三氯生的影響

利用高分辨液質(zhì)聯(lián)用鑒定了茉莉酸處理下萊茵衣藻體內(nèi)三氯生的代謝產(chǎn)物(表1和圖7)。通過離子流圖對比，篩出空白對照組(CK)沒有、而在TCS處理組和TCS+JA處理組新增的峰作為三氯生代謝產(chǎn)物，并根據(jù)該峰的質(zhì)譜信息解析化學(xué)結(jié)構(gòu)。

表1 三氯生代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息

使用四級桿飛行時間質(zhì)譜儀進行全掃描，得到其對應(yīng)的離子流圖，將不同加藥處理組的離子流圖進行對比(圖7)，其中CK組和TCS處理組沒有檢出，而TCS+JA樣本組中檢出的產(chǎn)物是JA作用于萊茵衣藻而導(dǎo)致TCS代謝的新產(chǎn)物。

紅色線表示TCS+JA處理組；綠色線表示TCS處理組；藍色線表示空白對照組

不同處理組細胞內(nèi)三氯生代謝產(chǎn)物的相對豐度如圖8所示。由圖8可知，共檢出三氯生代謝產(chǎn)物共6種(M1～M6)，其中僅在TCS+JA組檢出有4種，分別是M1(m/z464)、M2(m/z495)、M3(m/z510)和M4(m/z313)。根據(jù)二級碎片離子信息推斷降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，M1(m/z464)脫落1個OH—Glucose基團(m/z197)形成m/z267的主要碎片離子；M2(m/z495)和M1(m/z464)的主要碎片離子都有m/z267，M2(m/z495)是形成M1(m/z464)的前提化合物，此2種降解產(chǎn)物均為糖基化Ⅱ相代謝物；M3(m/z510)的主要碎片離子為m/z254，推測為脫去一個氯原子的三氯生，因此該化合物M3推測為雙脫氯三氯生結(jié)合物；M6(m/z585)比M3(m/z510)多了75，推測其為M3的甘氨酸結(jié)合物(Ala-M3)；M4(m/z313)的主要碎片離子為m/z153，該碎片離子推測分子式為C8H9OS·，因此M4化合物推測為硫乙基取代的三氯生。

圖8 不同處理組細胞內(nèi)三氯生代謝產(chǎn)物相對豐度

對代謝產(chǎn)物進行相對豐度比較發(fā)現(xiàn)，有茉莉酸處理的藻細胞體內(nèi)代謝產(chǎn)物豐度顯著大于僅三氯生處理組。從質(zhì)荷比看出，藻細胞內(nèi)檢出的代謝產(chǎn)物的質(zhì)荷比均大于母體農(nóng)藥三氯生(m/z287)，因此可推測其降解產(chǎn)物均為Ⅱ相代謝綴合物。Ⅱ相代謝是高等植物解毒外源化學(xué)物的重要生物轉(zhuǎn)化過程。可見，茉莉酸激活了藻體內(nèi)代謝解毒體系，使三氯生向Ⅱ相代謝途徑進行。

3 結(jié)論

1)在2 mg/L TCS加藥處理下，通過對萊茵衣藻細胞數(shù)、葉綠素、電導(dǎo)率和丙二醛4個生理指標測定，發(fā)現(xiàn)外源茉莉酸可以緩解三氯生對萊茵衣藻的氧化脅迫。

2)測定了不同處理條件下，萊茵衣藻細胞內(nèi)POD、GST和PPO的酶活。對比分析發(fā)現(xiàn)，TCS+JA組酶活明顯下降，說明外源茉莉酸的加入促進了藻細胞對自由基的清除，降低了對酶活的誘導(dǎo)效應(yīng)。

3)通過高效液相色譜準確測定了TCS和TCS+JA處理組藻體內(nèi)和相應(yīng)培養(yǎng)液中三氯生的積累量和殘留量。分析發(fā)現(xiàn)，TCS+JA組藻體內(nèi)三氯生含量較TCS組明顯降低，然而培養(yǎng)基內(nèi)TCS殘留量并無顯著性差異，說明茉莉酸通過促進三氯生的降解，而非促進藻細胞對三氯生的吸收，從而緩解三氯生對藻細胞的毒性作用。

4)通過高分辨質(zhì)譜鑒定了三氯生在TCS和TCS+JA處理藻體內(nèi)和相應(yīng)培養(yǎng)液中的降解產(chǎn)物。一共篩查到了6種降解產(chǎn)物。值得注意的是，TCS+JA處理組藻體內(nèi)大多數(shù)降解產(chǎn)物的相對含量顯著大于TCS處理組，進一步說明了茉莉酸促進了三氯生在藻體內(nèi)的代謝。