采樣拭子材質(zhì)與洗脫方式對(duì)表面微生物收集效果的影響

吳岳琴，王 珍，彭醒醒，章 虎，陸 雯

(綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310052)

微生物采樣涉及各個(gè)領(lǐng)域，如食品、餐飲、醫(yī)療等方面，而物體表面微生物采樣更是其中極重要的一個(gè)方面[1-2]。GB 14934—2016食(飲)具消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌及大腸菌群為餐飲具檢測(cè)指標(biāo)。目前的表面微生物采樣主要是借助拭子擦拭待檢物表面，再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌回收率的高低是一個(gè)由多因素相互作用的過(guò)程，受拭子材質(zhì)、取樣方法、洗脫方式等因素的影響[3]。然而，現(xiàn)有市場(chǎng)上的拭子材質(zhì)種類(lèi)繁多，拭子采樣轉(zhuǎn)移過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致較大的微生物計(jì)數(shù)誤差[4]。此外，不同材質(zhì)的拭子及不同的洗脫方式對(duì)物體表面微生物的回收率有較大的影響[5]。拭子材質(zhì)中常見(jiàn)的有植絨、海綿和棉簽等，其中植絨拭子是由尼龍短纖維絨毛頭和ABS塑料桿構(gòu)成的一種一次性采樣拭子，在病毒和DNA等采集方面，已有研究發(fā)現(xiàn)植絨拭子表現(xiàn)出較好的吸附和釋放能力[6-8]，而未見(jiàn)對(duì)植絨、海綿和棉簽這3種材質(zhì)的驗(yàn)證比較報(bào)道。因此，如何選擇性?xún)r(jià)比高的拭子材質(zhì)以及合適的洗脫方式來(lái)提高表面微生物采樣效率成為關(guān)鍵。本文中，筆者以這3種拭子為對(duì)象研究評(píng)估拭子材質(zhì)與洗脫方式對(duì)表面微生物收集效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium，CMCC(B)50115)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 6538)，南京便診生物科技有限公司；不銹鋼板(規(guī)格6 cm×6 cm)、不同材質(zhì)的拭子(植絨拭子、海綿拭子和棉簽拭子)。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，青島海博生物公司；0.85%無(wú)菌NaCl溶液，自制。

精密移液器，Eppendorf中國(guó)有限公司；HFSafe-1200TE型生物安全柜，力康生物醫(yī)療科技股份有限公司；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器公司；WG-2XJ型細(xì)菌濁度儀，上海昕瑞儀器儀表有限公司；HTY-302型微生物限度檢驗(yàn)儀，杭州泰林生物技術(shù)股份有限公司；Lab dancer S25型漩渦振蕩器，德國(guó)IKA公司；VHX-1000 系列超景深三維顯微系統(tǒng)，日本基恩士(KEYENCE)公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 菌懸液制備

接種大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于36 ℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)物用0.85%無(wú)菌NaCl溶液適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)測(cè)定菌液OD值并結(jié)合GB 4789.2—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定》方法，制成含菌量分別為1 000、500和100 CFU/mL左右的菌懸液。

1.3 洗脫方法驗(yàn)證

1.3.1 拭子接菌

用精密移液器移取250 μL上述不同含菌量的菌液分別至3種無(wú)菌干燥的拭子材質(zhì)(植絨、海綿和脫脂棉)上，注意滴加時(shí)緩慢，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)拭子，使菌液均勻分布于拭子上并使其完全吸收，不同濃度的每種菌液分別對(duì)應(yīng)以上3種材質(zhì)拭子，每組3個(gè)平行。

1.3.2 菌液洗脫

將上述染有不同濃度菌的拭子用滅菌剪刀剪去拭子與手接觸的部分，將拭子頭分別置于裝有20 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，分別采用人工手部振蕩100次、渦旋振蕩1 min和40 kHz超聲清洗1 min，3種不同洗脫方式洗脫后通過(guò)孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾，再用20 mL無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)洗大試管，將潤(rùn)洗液繼續(xù)抽濾，重復(fù)4次。用無(wú)菌鑷子將濾膜取出，平鋪在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，避免濾膜和培養(yǎng)基之間夾留氣泡，進(jìn)行36 ℃、48 h培養(yǎng)并記錄菌落數(shù)，具體計(jì)算見(jiàn)式(1)。

菌數(shù)回收率=洗脫的菌落數(shù)/制備菌落數(shù)×100%

(1)

1.4 模擬采樣后洗脫驗(yàn)證

1.4.1 不銹鋼板接種

取不銹鋼材質(zhì)的無(wú)菌板81塊，分為3組，每組27塊，吸取100 CFU/mL左右的待測(cè)菌懸液1 mL，每種供試菌懸液分別接種在1組不銹鋼板上，且接種面積為5 cm×5 cm的正方形，用無(wú)菌生理鹽水替代菌液接于不銹鋼板表面，作為陰性對(duì)照，并于層流臺(tái)下吹干待用。

1.4.2 擦拭取樣

1)實(shí)驗(yàn)組。取3種材質(zhì)拭子分別擦拭接有同種供試菌的不銹鋼板，每組3個(gè)平行。將拭子用0.85%無(wú)菌NaCl溶液浸潤(rùn)，分別以30°傾斜角來(lái)回均勻涂抹3次[3,9]。用滅菌剪刀剪去拭子與手接觸部分，將拭子頭置于裝有20 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中。

2)對(duì)照組。分別吸取100 CFU/mL左右的大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL，分別加入至裝有20 mL無(wú)菌生理鹽水的大試管中，每組2個(gè)平行?；靹蚝?，通過(guò)孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾，再用20 mL無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)洗大試管，將潤(rùn)洗液繼續(xù)抽濾，重復(fù)4次。用無(wú)菌鑷子將濾膜取出，平鋪在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，避免濾膜和培養(yǎng)基之間夾留氣泡，進(jìn)行36 ℃、48 h培養(yǎng)并記錄菌落數(shù)。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)定

將獲取的裝有帶菌拭子的試管，分別選擇人工振蕩、渦旋和超聲3種不同洗脫方式洗脫后，通過(guò)孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾，再用20 mL無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)洗大試管，將潤(rùn)洗液繼續(xù)抽濾，重復(fù)4次。用無(wú)菌鑷子將濾膜取出，平鋪在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，避免濾膜和培養(yǎng)基之間夾留氣泡，進(jìn)行36 ℃、48 h培養(yǎng)并記錄菌落數(shù)。

拭子細(xì)菌回收率(DRR)的計(jì)算見(jiàn)式(2)。

(2)

1.5 顯微鏡樣品觀察

將3種材質(zhì)的棉簽頭取下，置于200倍超景深顯微鏡下觀察構(gòu)造及形態(tài)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用2016版Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 洗脫方式對(duì)細(xì)菌回收率的影響

對(duì)不同拭子材質(zhì)在人工振蕩、渦旋及超聲波這3種不同洗脫條件下收集的菌進(jìn)行培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，并根據(jù)式(1)計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～3。

表1 植絨拭子在不同洗脫方式下的細(xì)菌回收情況

表2 海綿拭子在不同洗脫方式下的細(xì)菌回收情況

表3 棉簽拭子在不同洗脫方式下的細(xì)菌回收情況

由表1～3可知，在負(fù)荷一定試驗(yàn)菌后的不同材質(zhì)經(jīng)不同方式洗脫，3種材質(zhì)結(jié)合3種洗脫方式回收率均達(dá)到70%以上，3種洗脫方式均符合驗(yàn)證要求[10]。其中，渦旋振蕩和超聲洗脫回收率均高于人工振蕩洗脫回收率。同時(shí)，由表1～3可以發(fā)現(xiàn)，植絨拭子取樣后，這3種方法來(lái)洗脫，洗脫后不同試驗(yàn)細(xì)菌的回收率都超過(guò)87%，遠(yuǎn)高于海綿和脫脂棉這2種拭子取樣的效果。由此可知，植絨拭子是最佳的采集拭子。

2.2 模擬采樣后不同材質(zhì)拭子洗脫方式對(duì)細(xì)菌回收率的影響

通過(guò)采用大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌人工接種至不銹鋼板，分別用不同材質(zhì)拭子模擬采樣過(guò)程，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 模擬采樣后不同拭子材質(zhì)在不同洗脫方式下的細(xì)菌收集情況

由表4可知，3種洗脫方式對(duì)供試菌的回收率為50%～85%，對(duì)于3種材質(zhì)的拭子，同一種供試菌進(jìn)行試驗(yàn)后，不同洗脫方式對(duì)細(xì)菌回收率的效果從小到大為振蕩洗脫、旋渦洗脫、超聲洗脫，即通過(guò)人工振蕩洗脫方式得到的回收率明顯低于旋渦洗脫和超聲洗脫，超聲洗脫方式與旋渦洗脫方式的效果接近。但是人工振蕩洗脫雖然簡(jiǎn)單方便，但是受人的力度及頻次影響，很難達(dá)到滿(mǎn)意的洗脫效果。超聲洗脫儀體積較龐大，需要及時(shí)更換無(wú)菌水，無(wú)菌操作較繁瑣。而漩渦振蕩器體積較小、操作便捷、易清潔，所以是相對(duì)優(yōu)選的洗脫方式。

2.3 拭子材質(zhì)對(duì)細(xì)菌回收率的影響

通過(guò)對(duì)3種材質(zhì)分別負(fù)荷相同菌量，并經(jīng)過(guò)洗脫收集，發(fā)現(xiàn)不同拭子材質(zhì)對(duì)細(xì)菌的收集能力不同。在同一種洗脫方式下，3種不同拭子材質(zhì)對(duì)回收同一種供試菌能力不相同，其中植絨材質(zhì)的拭子的回收率明顯高于其他2種材質(zhì)的拭子。通過(guò)超景深顯微鏡200倍鏡下觀察3種拭子結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可以發(fā)現(xiàn)：①植絨拭子頭結(jié)構(gòu)為整齊的尼龍短纖維束；②海綿拭子頭結(jié)構(gòu)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；③棉簽拭子頭結(jié)構(gòu)為雜亂的絲狀。在這3種材質(zhì)中，植絨拭子是由尼龍短纖維絨毛頭和ABS塑料桿構(gòu)成的一種一次性采樣拭子，尼龍纖維束之間的毛細(xì)管作用促進(jìn)液體樣品的強(qiáng)液壓吸收，樣品保持在表面，使洗脫更容易，海綿拭子由層層網(wǎng)狀棉絲構(gòu)成，樣品進(jìn)入內(nèi)層網(wǎng)后較難釋放，而傳統(tǒng)的棉拭子，收集的大部分樣品仍然被捕獲在頭部的纖維基質(zhì)中，不容易釋放或釋放量小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，相較其他2種材質(zhì)拭子，植絨拭子能達(dá)到最大限度的收集能力及釋放能力。

圖1 3種材質(zhì)在超景深顯微鏡200倍鏡下的結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

綜上所述，用植絨拭子采樣后經(jīng)漩渦振蕩1 min，可獲得最佳的微生物洗脫效果，可作為醫(yī)療器具及餐具等表面微生物安全監(jiān)控的采樣技術(shù)參考，確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。