3種不同酵母產(chǎn)藍莓酒風(fēng)味物質(zhì)的研究

袁文艷，胡佳星，張璐瑤，滿都拉，孫子羽，賈文野，屈 嬡，郭昊翔，趙雪妮，陳忠軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

藍莓（Vaccinium citisidaea）為杜鵑花科越橘屬，表皮外披白霜，果肉酸甜可口，風(fēng)味獨特；因富含各種營養(yǎng)成分被譽為——“漿果之王”[1]，其果實中的營養(yǎng)成分主要有花青素（其花青素含量是所有水果中最高的[2]）、類黃酮、超氧化物歧化酶等化合物。這些豐富的營養(yǎng)成分使其具有很好的保健功能，還因此被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為世界五大健康食品之一[3-7]。由于藍莓果實柔軟多汁，易破碎、腐爛，導(dǎo)致其保鮮難度和保鮮成本較高，因此提倡以加工為主對其進行綜合利用。果酒是以水果為原料，釀造得到的低度酒精飲料；除含有乙醇外，還富含機體所需多種微量營養(yǎng)素、糖、有機酸等物質(zhì)，因而具有一定的保健功能[8]。藍莓酒作為藍莓的一種加工產(chǎn)品，既在一定程度上保留了藍莓的營養(yǎng)、風(fēng)味，又融合了果酒的營養(yǎng)保健功效，符合現(xiàn)在社會人們的飲食生活習(xí)慣及對健康生活的追求。

藍莓酒的風(fēng)味主要依賴于酒中所含的糖、單寧和酸類物質(zhì)[9]，藍莓本身的風(fēng)味及其在發(fā)酵過程中所呈現(xiàn)的獨特的香氣成分也是藍莓酒風(fēng)味物質(zhì)的重要組成部分。風(fēng)味物質(zhì)的種類、濃度及其融合度直接決定了藍莓酒口感的協(xié)調(diào)性、復(fù)雜性和典型性[10]。此外，不同酵母菌株的最適條件、發(fā)酵性能的差異對藍莓酒的風(fēng)味物質(zhì)也有影響。因此，本實驗采用氣相色譜法和液相色譜法對不同酵母菌株發(fā)酵的藍莓酒的風(fēng)味物質(zhì)進行探究[11-13]，并以電子舌對藍莓酒進行感官分析[14-16]，為藍莓酒的研究及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生藍莓鮮果（鮮果總糖12.46%，總酸2.37 g/kg）：內(nèi)蒙古根河野生資源開發(fā)公司；產(chǎn)酯酵母菌T1、耐酸酵母菌FK3-2、耐糖酵母菌LM6：本實驗室篩選保藏；偏重亞硫酸：天津化學(xué)試劑三廠；白酒混合標(biāo)樣-15組分（色譜純）：蘭州東立龍信息技術(shù)有限公司；甲醇（分析純）：天津市鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

美嘉寶A-103多功能榨汁攪拌機：購于華聯(lián)超市；FA2104N電子分析天平：奧豪斯儀器上海有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PAL-1糖度儀：日本TOKOY ATAGO公司；GC-7900氣相色譜（gas chromatography，GC）分析儀：上海天美科學(xué)儀器有限公司；G7129A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析儀：新加坡安捷倫科技；SA402B電子舌：北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藍莓酒發(fā)酵及檢測

將酵母菌分別接種于滅菌的酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基中進行活化。將活化的T1、FK3-2和LM6菌液以3%接種量接種于藍莓與水1∶1的藍莓汁中，添加偏重亞硫酸鉀240 mg/L、白砂糖（使初始糖度達到32.2°Bx）等進行成分調(diào)整，并將藍莓醪液的pH調(diào)至3.8。在28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵，分別在主發(fā)酵7 d、14 d、21 d及28 d取樣進行氣相色譜、液相色譜及電子舌檢測。為保持成品酒口感，至殘?zhí)?.0°Bx后終止發(fā)酵，將藍莓酒過濾除菌，于14 ℃培養(yǎng)箱中靜置。

1.3.2 樣品的制備

氣相色譜標(biāo)樣的配制：標(biāo)樣為白酒混合標(biāo)樣15組分，包括乙醛、甲醇、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯、仲丁醇、異丁醇、乙縮醛、正丁醇、異戊醇、丁酸乙酯、乙酸正丁酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、正己醇；內(nèi)標(biāo)物：乙酸正丁酯（0.173 4 mg/mL）。

液相色譜標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL的草酸溶液，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL的酒石酸溶液、DL-蘋果酸溶液、α-酮戊二酸溶液、乳酸溶液、冰乙酸溶液、檸檬酸溶液、L-焦谷氨酸溶液、琥珀酸溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2.0 mg/mL，超聲波脫氣20 min。

氣相色譜法檢測樣品的處理：取樣品20 mL蒸餾，蒸餾至餾出液10 mL，將餾出液用0.22 μm級的濾膜過濾，取1 mL過濾后的餾出液與10 μL內(nèi)標(biāo)液混勻。

液相色譜法檢測樣品的處理：稱取10 mL藍莓酒，加適量活性炭后用玻璃棒攪拌1min，攪拌均勻后靜置10～20min。將靜置后的酒液抽濾，通過0.22 μm的濾頭過濾后裝入進樣瓶備用。

電子舌檢測樣品的處理：將發(fā)酵結(jié)束的藍莓酒使用雙層紗布過濾后倒入電子舌檢測專用杯，酒液倒至內(nèi)緣分界線上端1～3 mm處。

1.3.3 色譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為LZP-930（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；柱溫初始溫度50 ℃保持6 min，再以8 ℃/min升溫至170 ℃，保持8 min；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）；進樣口溫度220 ℃；檢測器溫度230 ℃；載氣為氮氣；進樣量為1 μL。采用內(nèi)標(biāo)法定量分析。通過計算待測組分與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，獲得待測樣品香氣成分的含量。

高效液相色譜條件：色譜柱為Poroshell 120 EC-C18（150 mm×4.6 mm，4 μm）；柱溫40 ℃；流動相為100%的0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液[17]（磷酸調(diào)至pH 2.9）；流速0.30 mL/min；紫外檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母發(fā)酵藍莓酒揮發(fā)性物質(zhì)含量比較

對3種酵母發(fā)酵藍莓酒分別在主發(fā)酵7 d、14 d、21 d及28 d取樣進行15種揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果見表1～表3。

表1 FK3-2酵母發(fā)酵藍莓酒15種揮發(fā)性物質(zhì)含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast FK3-2

由表1可以看出，F(xiàn)K3-2酵母發(fā)酵的藍莓酒在發(fā)酵7 d、14 d及28 d時均可檢測到12種揮發(fā)性物質(zhì)，但在發(fā)酵21 d時僅檢測到9種。在發(fā)酵7 d、14 d和21 d時，正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯及正丁醇含量含量較低，發(fā)酵28 d時明顯增加，這可能是FK3-2酵母菌活力激發(fā)需要較長時間的緣故。

表2 LM6酵母發(fā)酵藍莓酒15種揮發(fā)性物質(zhì)含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast LM6

由表2可以看出，LM6酵母發(fā)酵的藍莓酒發(fā)酵7 d時檢測到8種揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)酵14 d時檢測到13種，發(fā)酵21 d時檢測到10種，28 d時可檢測到11種?？梢奓M6酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類整體呈上升趨勢，其中正丙醇、異丁醇、異戊醇、丁酸乙酯、戊酸乙酯、正丁醇及仲丁醇含量在發(fā)酵28 d時分別為0.475 1 mg/mL、2.377 3 mg/mL、2.131 4 mg/mL、2.0533mg/mL、0.8548mg/mL、0.0420mg/mL、0.3678mg/mL。

表3 T1酵母發(fā)酵藍莓酒15種揮發(fā)性物質(zhì)含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of 15 kinds of volatile substances in blueberry wine fermented by yeast T1

由表3可以看出，T1酵母發(fā)酵的藍莓酒發(fā)酵7 d時可檢測到11種揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)酵14 d時可檢測到12種，發(fā)酵21 d時僅可檢測到7種，28 d時可檢測到12種。正丙醇、異戊醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯及正丁醇含量在發(fā)酵28 d時增加至0.053 9 mg/mL、1.243 1 mg/mL、1.376 3 mg/mL、0.069 3 mg/mL、0.285 5 mg/mL、0.263 7 mg/mL。

酯類化合物具有花、果的香味[18]，是果酒香型的特征性成分，可以使酒體柔和、酒香綿長[19-20]。綜合表1～表3可知，3種酵母發(fā)酵藍莓酒的正丙醇和異戊醇含量均明顯增加。發(fā)酵28 d時，LM6酵母發(fā)酵藍莓酒中正丙醇和丁酸乙酯含量高于另外兩種藍莓酒，F(xiàn)K3-2酵母發(fā)酵藍莓酒的異戊醇含量高于另外兩種藍莓酒。而且FK3-2酵母發(fā)酵藍莓酒中正丙醇、丁酸乙酯、正丁醇及異丁醇含量較高；LM6酵母發(fā)酵藍莓酒和T1酵母發(fā)酵藍莓酒均是正丙醇和丁酸乙酯含量較高。這些醇類化合物主要來源于酵母菌的代謝、氨基酸分解轉(zhuǎn)化等，其中的高級醇不但可以賦予酒優(yōu)雅的香氣，還為其他香味物質(zhì)提供了良好溶劑，對酒的香型起著重要作用。

2.2 不同酵母發(fā)酵藍莓酒有機酸含量比較

對3種酵母發(fā)酵藍莓酒分別在主發(fā)酵7 d、14 d、21 d及28 d取樣進行有機酸含量分析，結(jié)果見表4～表6。

表4 FK3-2酵母發(fā)酵藍莓酒有機酸的含量檢測結(jié)果Table 4 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast FK3-2

表5 LM6酵母發(fā)酵藍莓酒有機酸的含量檢測結(jié)果Table 5 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast LM6

表6 T1酵母發(fā)酵藍莓酒有機酸的含量檢測結(jié)果Table 6 Determination results of organic acid contents in blueberry wine fermented by yeast T1

由表4可知，F(xiàn)K3-2酵母發(fā)酵的藍莓酒發(fā)酵7 d、14 d時檢測到10種有機酸，發(fā)酵21 d和28 d時檢測到9種有機酸。隨著發(fā)酵時間的延長，所含酸的種類有所減少，L-蘋果酸及琥珀酸含量在發(fā)酵28 d時分別降至0.1028 mg/mL、0.382 6mg/mL，檸檬酸含量分別由0.619 2 mg/mL和0.766 1 mg/mL降為0，而草酸含量由1.399 2 mg/mL增至2.620 4 mg/mL。

由表5可知，LM6藍莓酒發(fā)酵7 d及14 d時可檢測到10種有機酸，發(fā)酵21 d和28 d時可檢測到9種。隨著發(fā)酵時間的延長，所含酸的種類有所減少，檸檬酸含量由1.188 6 mg/mL逐漸降為0，草酸含量由2.9853mg/mL增至3.1702mg/mL，L-蘋果酸、乳酸及琥珀酸含量降至0.089 5 mg/mL、9.871 5 mg/mL、3.061 2 mg/mL。

由表6可知，T1藍莓酒發(fā)酵7 d、21 d及28 d檢測到9種有機酸，14 d時檢測到10種有機酸。隨著發(fā)酵時間的延長，琥珀酸含量由0.444 8 mg/mL降為0.278 6 mg/mL，檸檬酸含量由0.014 9 mg/mL降為0，而α-酮戊二酸、焦谷氨酸及乳酸含量增至0.233 3 mg/mL、0.029 3 mg/mL、3.368 2 mg/mL。D-蘋果酸和L-蘋果酸在14 d及21 d時含量有明顯增加，增至2.632 8 mg/mL及1.890 5 mg/mL和0.482 8 mg/mL及0.321 4 mg/mL但在28 d時又大幅下降為0.089 4 mg/mL和0.030 7 mg/mL。

綜合可知，發(fā)酵過程中3種酵母發(fā)酵的藍莓酒檸檬酸含量逐漸下降，可能是在發(fā)酵過程中被微生物消耗或作為底物被利用。T1藍莓酒中α-酮戊二酸、焦谷氨酸及乳酸含量增多；LM6及FK3-2藍莓酒中草酸含量增加，L-蘋果酸、乳酸及琥珀酸含量下降。有機酸有助于提高果酒的利口性，使酒體清爽[19]。這些有機酸一部分如蘋果酸、檸檬酸、酒石酸等來自藍莓果實本身，一部分如乳酸、琥珀酸等是發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)物，因此酸的含量的升降反映的是酵母菌的特性，該變化與揮發(fā)也有一定的關(guān)系。通過比較可知T1酵母菌產(chǎn)生的酸的種類略多，增加了口感的復(fù)雜性。

2.3 電子舌圖譜分析

利用電子舌數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（SA402B）對發(fā)酵7 d、14 d、21 d及28 d的三種藍莓酒進行分析，將其響應(yīng)值作雷達圖，結(jié)果見圖1。

圖1 3種不同酵母發(fā)酵藍莓酒主發(fā)酵7 d（A）、14 d（B）、21 d（C）、28 d（D）的電子舌分析數(shù)據(jù)雷達圖Fig.1 Electronic tongue analysis of blueberry wine by three different yeasts at main fermentation for 7 d(A),14 d(B),21 d(C)and 28 d (D)

由圖1可知，發(fā)酵7 d時，3種不同酵母發(fā)酵藍莓酒味感相似，且T1與FK3-2幾乎重合。三者均是咸味突出，鮮味較強，回味B和豐富性也強于其他味感，甜味不明顯。發(fā)酵14 d時，三者澀味強于剩余味感，LM6藍莓酒澀味最明顯，T1藍莓酒回味B比其他9種味感更明顯。發(fā)酵21 d及28 d時，F(xiàn)K3-2藍莓酒和T1藍莓酒的雷達圖幾乎重合，皆是酸味突出，澀味較其他味感更明顯。發(fā)酵21 d時LM6藍莓酒10種味感較均衡，咸味、鮮味、豐富性略強于其他味感，但在發(fā)酵28 d時，LM6藍莓酒的酸味變得突出。

FK3-2和T1酵母發(fā)酵藍莓酒的味感在主發(fā)酵期基本上十分接近，表明兩種酵母菌在發(fā)酵時產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)組合之間的相互作用能產(chǎn)生相似的味道，使人品嘗時難以分辨，二者可相互替代；LM6酵母菌所產(chǎn)藍莓酒的味感在發(fā)酵中趨于均衡但咸味、鮮味、豐富性更為突出，使果酒口感復(fù)雜柔和恰到好處。但在發(fā)酵28 d，該酒的酸味大大增強，可能是產(chǎn)生雜菌，使用時應(yīng)注意避免染菌。

3 結(jié)論

通過氣相色譜法、高效液相色譜法及電子舌檢測發(fā)現(xiàn)不同的酵母菌株對藍莓酒的揮發(fā)性物質(zhì)含量、有機酸含量及咸味、回味、鮮味、豐富性等味感有不同程度的影響。

使用氣相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)酵母菌LM6與酵母菌T1產(chǎn)醇類和酯類較多，形成的風(fēng)味更為復(fù)雜。

使用高效液相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)T1酵母菌產(chǎn)生有機酸的能力略強于FK3-2和LM6。LM6和FK3-2酵母菌產(chǎn)有機酸性能相似，隨著發(fā)酵時間的延長，皆是草酸含量增加，L-蘋果酸、乳酸及琥珀酸含量下降。

使用電子舌檢測發(fā)現(xiàn)FK3-2和T1酵母菌產(chǎn)生的滋味基本一致，酸味明顯；LM6酵母菌產(chǎn)生的鮮味、咸味及豐富性3種味感更明顯，且在28 d時酸味大大增強。

酵母菌T1生產(chǎn)的藍莓酒氣味和利口性較好，酵母菌LM6生產(chǎn)的藍莓酒氣味和口感的復(fù)雜性較好，兩者在香氣、口感方面優(yōu)于酵母菌FK3-2。酵母菌LM6生產(chǎn)的藍莓酒更加馥郁可口。