芝麻粕蛋白酶法提取工藝優(yōu)化及組分分析

皮詩宇，王常高，杜 馨，蔡 俊

（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430068）

芝麻（Sesamum indicumL.）是一種被廣泛利用的油料種子作物，屬胡麻科（Pedaliaceae）胡麻屬（Sesamum），是胡麻的籽種，我國四大食用油料作物之一[1-2]。芝麻提油后的副產(chǎn)物稱為芝麻粕，其中含有豐富的蛋白質(zhì)[3]。芝麻粕中蛋白質(zhì)平均含量為42.5%～47.9%[4]，營養(yǎng)價值較高，具有良好的乳化性、乳化穩(wěn)定性、吸油性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性等功能特性[5-6]。但芝麻在利用傳統(tǒng)方法提油后，得到的芝麻粕蛋白變性嚴(yán)重，并且殘留的油脂和纖維素形成物理屏障作用造成芝麻粕蛋白利用困難[7]，一直被作為劣質(zhì)飼料或廢物，造成資源的浪費(fèi)。

當(dāng)今日益增長的食物資源供給需求矛盾，開發(fā)新的蛋白質(zhì)資源并合理利用迫在眉睫，尤其是植物性蛋白資源的開發(fā)利用已成為世界各國解決食物資源匱乏的重要途徑。花生蛋白、玉米蛋白和大豆蛋白已經(jīng)普遍應(yīng)用于市場中，但對芝麻粕蛋白的利用還沒有引起足夠的重視[8]。目前，芝麻粕蛋白的提取方法[9-11]對其提取率影響較大，生物法提取的芝麻粕蛋白含量較高[12-13]，但植物蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相對分子質(zhì)量較大，不易于人體的消化吸收；通過酶解制備蛋白多肽有利于人體的吸收，并具有抗氧化、降血壓、提高機(jī)體免疫力的生理功能[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，表面活性劑與蛋白質(zhì)同時存在時可以競爭吸附蛋白質(zhì)，使乳狀液不穩(wěn)定，繼而過濾除油[15-16]。同時，表面活性劑能降低酶解過程木質(zhì)素對酶的非特異性吸附，從而提高酶解效率[17]。

本研究以芝麻粕為原料，采用表面活性劑吸附油脂法對芝麻粕進(jìn)行脫脂預(yù)處理，并結(jié)合水劑法去除表面活性劑，得到蛋白質(zhì)含量較高的芝麻粕。但蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量較大，不利于其在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用，因此，選取最佳蛋白酶對芝麻粕蛋白進(jìn)行水解，并利用單因素輪換法和正交試驗(yàn)提高芝麻粕蛋白溶出率，確定最佳酶解條件。最后，利用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析水解產(chǎn)物中氨基酸的含量及組成，以期為后續(xù)開發(fā)利用芝麻粕提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻粕：市售；堿性蛋白酶（10萬U/g）、中性蛋白酶（10萬U/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶（80萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；吐溫80、十二烷基硫酸鈉、石油醚（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硬脂酸（分析純）：上海三消化工有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：武漢市華順生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN-12C消化爐、KDN-1000全自動定氮儀：上海昕瑞儀器儀表有限公司；FD-2型真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DD5M型低速大容量多管架離心機(jī)：長沙平凡儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本SHINADZU公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芝麻粕主要成分分析

灰分含量：參照GB5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》測定[18]；粗纖維含量：參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》測定[19]；還原糖含量：參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》測定[20]；脂肪含量：參照GB5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》測定[21]；總蛋白含量：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》測定[22]；水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》測定[23]。

1.3.2 芝麻粕脫脂處理[24-27]

選用硬脂酸、十二烷基硫酸鈉和吐溫80作為芝麻粕脫脂預(yù)處理所用脫脂劑，反應(yīng)結(jié)束后利用水劑法去除溶液中的脫脂劑，得到蛋白含量較純的芝麻粕。

稱取一定量的未脫脂芝麻粕，測定粗脂肪含量（m1）。稱取3份未脫脂芝麻粕5.00 g，粉碎，加入100 mL蒸餾水，分別加入1%的吐溫80、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸，在50 ℃磁力攪拌水浴鍋中恒溫加熱，浸提時間30 min。脫脂反應(yīng)結(jié)束后在4 000 r/min條件下離心15 min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗3次，置于烘箱中烘干。取出一定量的脫脂芝麻粕，測定脫脂后樣品中的脂肪含量（m2）及蛋白含量，計算3種表面活性劑處理芝麻粕的脫脂率，比較吐溫80、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸的脫脂效果，選擇脫脂效果最好的表面活性劑作為芝麻粕脫脂劑。

脫脂率計算公式如下：

1.3.3 芝麻粕蛋白水解酶的選擇

稱取3份脫脂芝麻粕樣品10 g，按料液比1∶4（g∶mL）加入蒸餾水制備懸濁液，分別加入脫脂芝麻粕質(zhì)量的0.01%的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶。按各酶的適宜pH值、溫度水解5 h后，8 000 r/min離心15 min，取上清液，采用凱氏定氮法[22]測定可溶性蛋白含量，計算芝麻粕蛋白溶出率，選擇最優(yōu)芝麻粕蛋白水解酶。蛋白質(zhì)溶出率計算公式如下：

1.3.4 芝麻粕蛋白酶解條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

選取最優(yōu)水解蛋白酶，確定蛋白酶的初始水解條件為料水比1∶8（g∶mL），酶解時間5 h，酶解溫度40 ℃，加酶量0.01%。在此基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法依次考察酶解時間為（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、料水比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）、酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）及加酶量（0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%）對芝麻粕蛋白溶出率的影響，確定最適酶解條件。

1.3.5 芝麻粕蛋白酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度（A）、酶解時間（B）、料水比（C）、加酶量（D）為考察因素，蛋白質(zhì)溶出率（Y）為評價指標(biāo)，選擇L9（34）正交表進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 堿性蛋白酶水解芝麻粕蛋白條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for hydrolysis conditions optimization of protein from sesame meal by alkaline protease

1.3.6 芝麻粕蛋白水解物組成成分分析

采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法檢測芝麻粕蛋白水解物中的游離氨基酸[28]。

檢測條件：流動相A為0.04 mol/L無水乙酸鈉溶液，流動相B為體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈水溶液，檢測波長為360 nm，流速為1 mL/min，色譜柱為C18VP-ODS（5 μm，250 mm×4.6 mm），梯度洗脫：0～20 min，70%A；20～26 min，64%A；26～41 min，45%A；41～46 min，35%A；46～48 min，10%A；48～54 min，2%A；54～60 min，30%A。

根據(jù)保留時間定性，采用外標(biāo)法定量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件設(shè)計正交試驗(yàn)方案，采用Excel 2013版軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻粕原料的主要成分分析

芝麻粕原料的主要成分見表2。

表2 芝麻粕的主要成分Table 2 Main components of sesame meal

由表2可知，芝麻粕中灰分和粗纖維含量較高，分別為14.05%和17.11%。植物纖維素可作為一種可再生原料，被再加工成甜味素等功能材料[29]；灰分含量較高表明芝麻粕中礦物質(zhì)元素豐富，含有的礦物元素中鐵含量豐富[30]，可用于人體的生長發(fā)育。由此可知，芝麻粕有很好的利用價值。芝麻粕中粗蛋白含量最高（42.21%），較豆粕中蛋白質(zhì)含量高9%[31]，較棉籽餅粕中蛋白含量高5%[32]，可作為蛋白質(zhì)資源利用。但芝麻粕中含有3.98%的脂肪，該脂肪是芝麻在榨油后殘留的，油相將芝麻粕蛋白包裹也是造成芝麻粕蛋白提取困難的原因之一。因此，本試驗(yàn)針對芝麻粕進(jìn)行脫脂預(yù)處理，提高芝麻粕蛋白提取率。

2.2 3種表面活性劑脫脂效果的比較

芝麻粕是芝麻壓榨生產(chǎn)油料后的廢棄物，其中殘留部分油脂，如果酶解產(chǎn)物含有較多的脂肪會造成其在溫度較高時容易焦化，并對氮含量的測定結(jié)果有一定的影響。因此，先將芝麻粕脫脂，脫脂后利用水劑法[27]除去脫脂劑，得到蛋白質(zhì)含量較純的芝麻粕。比較3種表面活性劑對芝麻粕脫脂率的影響，結(jié)果見表3。

表3 3種表面活性劑對芝麻粕脫脂率的比較Table 3 Comparison on degreasing rates of 3 surfactants on sesame meal

由表3可知，吐溫80的脫脂效果最好，脫脂率達(dá)93.49%；其次是十二烷基硫酸鈉，脫脂率為92.39%；硬脂酸的脫脂率僅為51.51%。脫脂后得到的芝麻粕蛋白含量與表面活性劑性能有關(guān)，使用吐溫80脫脂后，芝麻粕蛋白質(zhì)含量提高7.31%。吐溫80作為非離子型表面活性劑與陰離子型表面活性劑相比，穩(wěn)定性高，具有高表面活性、水溶液的表面張力低、臨界膠束濃度低、膠束聚集數(shù)大、增溶作用強(qiáng)以及良好的乳化力和去污力，是提高芝麻粕蛋白質(zhì)含量的主要原因[26]。因此，選用脫脂效果最好的吐溫80作為芝麻粕的脫脂劑。

2.3 芝麻粕蛋白水解酶的選擇

不同蛋白酶對芝麻粕蛋白的酶解效果見表4。

表4 不同蛋白酶對芝麻粕蛋白的酶解效果比較Table 4 Comparison of enzymatic hydrolysis effects of different proteases on protein from sesame meal

由表4可知，堿性蛋白酶對芝麻粕蛋白酶解后的芝麻粕蛋白溶出率最高，為72.61%，其次為木瓜蛋白酶（70.23%），中性蛋白酶最差（66.62%）。分析原因可能是芝麻粕蛋白在堿性溶液中的溶解度較大[13]，酶能充分與蛋白接觸進(jìn)行酶解。因此，選定堿性蛋白酶最佳。

2.4 堿性蛋白酶酶解芝麻粕蛋白條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.4.1 酶解時間對芝麻粕蛋白溶出率的影響

酶解時間對芝麻粕蛋白溶出率的影響見圖1。

圖1 酶解時間對芝麻粕蛋白溶出率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the dissolution rate of protein from sesame meal

由圖1可知，隨著酶解時間的增加，芝麻粕蛋白溶出率也隨之增加，當(dāng)酶解時間為4 h時，芝麻粕蛋白溶出率最高并趨于穩(wěn)定，為70.25%。酶解時間過短會造成芝麻粕蛋白無法完全酶解，導(dǎo)致芝麻粕蛋白溶出率不高；當(dāng)芝麻粕蛋白酶解完畢后酶解過程將終止，酶解時間過長會降低生產(chǎn)效率。因此，確定芝麻粕蛋白的最佳酶解時間為4 h。

2.4.2 料水比對芝麻粕蛋白溶出率的影響

料水比對芝麻粕蛋白溶出率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著料水比的減小，芝麻粕蛋白溶出率隨之增加，當(dāng)料水比達(dá)到1∶10（g∶mL）時，芝麻粕蛋白溶出率達(dá)到最高，為71.21%。料水比較大時，堿性蛋白酶與芝麻粕蛋白沒有足夠的接觸面積，影響芝麻粕蛋白溶出率；當(dāng)料水比達(dá)到1∶10（g∶mL）后，此時的料水接觸面積達(dá)到飽和，進(jìn)一步減小料水比并不會導(dǎo)致芝麻粕蛋白溶出率增大，反而會增加工藝成本。因此，確定料水比為1∶10（g∶mL）。

圖2 料水比對芝麻粕蛋白溶出率的影響Fig.2 Effect of material to liquid ratio on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.4.3 酶解溫度對芝麻粕蛋白溶出率的影響

酶解溫度對芝麻粕蛋白溶出率的影響見圖3。由圖3可知，隨著酶解反應(yīng)溫度的升高，芝麻粕蛋白溶出率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶解溫度達(dá)到50 ℃時，芝麻粕蛋白溶出率達(dá)到最大，為79.20%。這主要是因?yàn)閴A性蛋白酶的酶活受溫度影響，在最適溫度范圍內(nèi)，酶活隨溫度的升高而增大，超過酶活最適溫度時，酶活隨溫度的升高而降低。因此，確定芝麻粕蛋白的最佳酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對芝麻粕蛋白溶出率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.4.4 加酶量對芝麻粕蛋白溶出率的影響

加酶量對芝麻粕蛋白溶出率的影響見圖4。由圖4可知，隨著加酶量的增加，芝麻粕蛋白溶出率隨之增加，當(dāng)加酶量為0.03%時，芝麻粕蛋白溶出率達(dá)到最大，為87.61%。確定酶解底物濃度后，增加酶量會使芝麻粕蛋白溶出率提高，當(dāng)?shù)孜锵耐戤叿磻?yīng)終止，繼續(xù)增加酶量不會提高芝麻粕蛋白溶出率，并且會造成資源浪費(fèi)。因此，確定加酶量為0.03%。

圖4 加酶量對芝麻粕蛋白溶出率的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on the dissolution rate of protein from sesame meal

2.5 堿性蛋白酶酶解芝麻粕蛋白條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度（A）、酶解時間（B）、料水比（C）、加酶量（D）為考察因素，以芝麻粕蛋白溶出率（Y）為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表5 堿性蛋白酶水解芝麻粕蛋白條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for hydrolysis conditions optimization of protein from sesame meal by alkaline protease

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal tests results

由表5及表6可知，各因素對芝麻粕蛋白溶出率影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D，即酶解時間＞酶解溫度＞料水比＞加酶量，根據(jù)F比和P值可知，酶解溫度、酶解時間和料水比的影響較為顯著。最優(yōu)水平組合為A2B1C2D3，即酶解溫度50 ℃、酶解時間3 h、料水比1∶10（g∶mL）、加酶量0.04%，與試驗(yàn)組最優(yōu)組合一致，在此條件下芝麻粕蛋白溶出率可達(dá)88.94%。與僅利用蛋白酶直接酶解芝麻粕對比[33]，利用表面活性劑預(yù)處理后，再使用堿性蛋白酶酶解法得到的芝麻粕蛋白溶出率提高18.58%；并且吐溫80作為表面活性劑價格低廉，能在今后的工業(yè)化中起到較好的作用。

2.6 芝麻粕蛋白水解物組成成分分析

2.6.1 芝麻粕蛋白水解物中氨基酸組成分析

芝麻粕蛋白水解物中氨基酸的組成及含量見表7。

表7 芝麻粕蛋白水解物的氨基酸組成與含量Table 7 Composition and contents of amino acid in protein from sesame meal hydrolysate

由表7可知，芝麻粕蛋白水解物中含有20種氨基酸，8種人體必需氨基酸。其中酪氨酸含量（33.01 g/100 g）最高，占總氨基酸含量的21.65%，酪氨酸可用作氨基酸類藥、營養(yǎng)增補(bǔ)劑等工業(yè)生產(chǎn)；其次是半胱氨酸和甲硫氨酸，約占總氨基酸含量的13%～14%，其中半胱氨酸可用于面包、天然果汁中防止食品老化；甲硫氨酸是氨基酸輸液和綜合氨基酸制劑的主要組成之一[34]，價格低廉。但本試驗(yàn)與SINGH K K等[35]的研究結(jié)果相比，賴氨酸和谷氨酸含量較低，酪氨酸和甲硫氨酸含量較高，分析原因可能是由于芝麻生長環(huán)境、遺傳等其他不可控因素造成的。

2.6.2 芝麻粕蛋白水解物中必需氨基酸組成分析

芝麻粕蛋白水解物與不同種類蛋白質(zhì)成分中人體必需氨基酸組成及聯(lián)合國糧農(nóng)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）推薦值的對比與分析見表8。

由表8可知，芝麻粕蛋白水解物中人體必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本高于菜籽粕分離蛋白和花生餅粕分離蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其中甲硫氨酸＋半胱氨酸的含量最高，占總氨基酸含量的28.3%，明顯高于FAO/WHO的推薦值（3.5%）；纈氨酸和異亮氨酸含量均高于其他兩種分離蛋白氨基酸含量，纈氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸的注射液能治療肝功能衰竭以及器官損傷；但蘇氨酸含量低于其他兩種蛋白氨基酸含量，且含量低于FAO/WHO推薦值（4.0%），因此，芝麻粕蛋白水解物不能應(yīng)用于制備有關(guān)蘇氨酸的產(chǎn)品。綜上所述，芝麻粕蛋白水解物中含有的人體必需氨基酸從營養(yǎng)均衡的角度來看，對人體的營養(yǎng)價值較高，可以作為食品添加劑應(yīng)用于食品行業(yè)。

表8 不同種類蛋白質(zhì)成分中必需氨基酸組成對比Table 8 Comparison of essential amino acid composition in different protein components

3 結(jié)論

吐溫80的脫脂效果最好，脫脂率達(dá)到93.49%，脫脂后芝麻粕蛋白含量為（49.00±0.37）%，較未脫脂蛋白含量提高7.31%。堿性蛋白酶為水解芝麻粕蛋白的最佳蛋白酶，其最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解時間3.0 h、料水比1∶10（g∶mL）、加酶量0.04%，芝麻粕蛋白溶出率為88.94%。從脫脂后芝麻粕蛋白水解物中共檢測到20種氨基酸，其中含有8種人體必需氨基酸的含量高于FAO/WHO的推薦值。