四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅理化指標(biāo)及有機(jī)酸變化分析

于 華 ，唐 姣，趙佳麗，梅小慶，周 鑫，陳夢(mèng)媛，張 紅

（1.四川工業(yè)科技學(xué)院食品學(xué)院，四川德陽(yáng) 618500；2.四川老川東食品有限公司，四川成都 610500）

食醋是我國(guó)飲食生活中必不可少的一種酸性調(diào)味品[1]，它的發(fā)明、發(fā)展和傳播是對(duì)人類(lèi)飲食文化的一大貢獻(xiàn)[2]。在中國(guó)有“四大名醋”的說(shuō)法，即四川麩醋、鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋以及福建紅曲醋[3]。作為四大名醋之一的四川麩醋，其主要特點(diǎn)是以麥麩為釀造主要原料，藥曲為糖化發(fā)酵劑，采用糖化、酒化、醋化同池進(jìn)行的生料固態(tài)開(kāi)放式天然多菌種混合發(fā)酵工藝，發(fā)酵結(jié)束后其醋醅需要經(jīng)過(guò)2～3年時(shí)間的曬制[4]，其風(fēng)味及功能性物質(zhì)的形成主要是通過(guò)各種微生物的代謝作用共同實(shí)現(xiàn)的，在發(fā)酵過(guò)程中微生物將原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)降解為還原糖、氨基酸等，同時(shí)還分泌大量的揮發(fā)性物質(zhì)（醇類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)等）、有機(jī)酸（乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸等）和功能性物質(zhì)（川穹嗪、黃酮等）等[5]。這些物質(zhì)的共同存在賦予了四川麩醋特有的風(fēng)味和良好的保健功能。由于四川麩醋釀造生產(chǎn)完全依賴(lài)于自然接種和發(fā)酵，因此存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定以及產(chǎn)量低等問(wèn)題，要進(jìn)行有效的生產(chǎn)控制和工藝改造，就必須對(duì)現(xiàn)行傳統(tǒng)工藝進(jìn)行分析研究[6]。

食醋中有機(jī)酸的種類(lèi)與含量既決定著其酸味質(zhì)量，又與產(chǎn)品特色密切相關(guān)[1]。有機(jī)酸是構(gòu)成食醋風(fēng)味的主要成分，影響著食醋的滋味、口感，因此對(duì)食醋中有機(jī)酸的組成與含量的分析有利于評(píng)價(jià)食醋品質(zhì)[7-8]。

目前，關(guān)于四川麩醋的研究多為功能菌株的篩選及產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)的分析，對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)及有機(jī)酸變化規(guī)律的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道，本研究對(duì)四川某麩醋釀造廠(chǎng)的醋醅跟蹤采樣，研究其發(fā)酵過(guò)程中水分含量、pH值、總酸、揮發(fā)酸、不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖、淀粉含量等理化指標(biāo)和有機(jī)酸組成與含量的變化規(guī)律，以期對(duì)生產(chǎn)控制和工藝改造提供較為系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

麩醋醋醅樣品均采集自四川某著名傳統(tǒng)麩醋廠(chǎng)，該廠(chǎng)生產(chǎn)的麩醋是采用最傳統(tǒng)的麩醋釀造方式發(fā)酵，是傳統(tǒng)四川麩醋生產(chǎn)的典型代表。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取3個(gè)發(fā)酵正常的池子進(jìn)行取樣，分別取發(fā)酵0、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d共6個(gè)階段的醋醅樣品，-20 ℃保存。

1.1.2 試劑

石油醚、無(wú)水乙醇、鹽酸、乙酸鉛、硫酸鈉、葡萄糖、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、磷酸、（NH4）2HPO4、甲醛、NaOH、硫酸鋅、亞甲基藍(lán)（均為分析純）、甲醇（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乳酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、草酸、富馬酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子天平、Starter 2C pH計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；TW-2000W可控調(diào)溫電爐：成都市永信電器廠(chǎng)；DZTW電子調(diào)溫電熱套：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；78HW-1恒溫磁力攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；Agilent 1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫公司；Gemini 5u C18110A色譜柱（250 nm×4.6 mm）：美國(guó)菲羅門(mén)公司；Sep-Pak C18Cartridge固相萃取小柱：美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅理化指標(biāo)的測(cè)定

水分含量[1]：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g醋醅樣品于稱(chēng)量皿中，105 ℃恒溫烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量并計(jì)算醋醅中的水分含量。

pH值[5]：稱(chēng)取100 g醋醅樣品于500 mL燒杯中，加入300 mL蒸餾水，并用保鮮膜將燒杯口封住，浸泡3 h，期間不斷搖動(dòng)，保證酸充分溶解于水中。而后用雙層濾紙過(guò)濾，濾液待用。采用pH計(jì)直接測(cè)定濾液的pH值。

總酸含量[9]：取濾液按照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中電位滴定法測(cè)定。先計(jì)算出濾液的總酸含量，再轉(zhuǎn)化成干醅的總酸含量。

不揮發(fā)酸含量（以乳酸計(jì)）[10]：取濾液按照GB 18187—2000《釀造食醋》測(cè)定。不揮發(fā)酸含量計(jì)算公式如下：

揮發(fā)酸含量（以乙酸計(jì)）[6，11]=總酸-不揮發(fā)酸×0.06/0.09。

氨基酸態(tài)氮含量[12]：取濾液按照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中甲醛值法測(cè)定。

還原糖含量[13]：參照GB/T 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》中的直接滴定法（斐林試劑法）測(cè)定。

淀粉含量[14]：參照GB/T 5009.9—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中淀粉的測(cè)定》中的酸水解法測(cè)定。

1.3.2 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅有機(jī)酸組成分析

醋醅樣品預(yù)處理：稱(chēng)取30.0 g醋醅樣品于250 mL燒杯中，加90 mL超純水，用保鮮膜將燒杯口封住，浸泡3 h，期間不斷搖動(dòng)。用雙層濾紙過(guò)濾，濾液待用。吸取25 mL濾液于100 mL容量瓶中，加入5 mL 30%硫酸鋅溶液和5 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，定容，靜置30 min后雙層濾紙過(guò)濾，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，再經(jīng)Sep-Pak C18固相萃取小柱，流出液供HPLC檢測(cè)[15-17]。

HPLC條件：Gemini5uC18110A色譜柱（250nm×4.6mm），以5%甲醇-95%0.5%（NH4）2HPO4（用H3PO4調(diào)節(jié)pH值為2.7）為流動(dòng)相，流速0.5 mL/min，柱溫35℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μL[17-18]。

定性定量：配制乙酸、富馬酸、乳酸、蘋(píng)果酸、草酸、丙酮酸、檸檬酸、酒石酸和琥珀酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為15.83 mg/mL、0.30 mg/mL、15.33 mg/mL、6.07 mg/mL、0.80mg/mL、1.28mg/mL、8.50mg/mL、4.00mg/mL、6.18mg/mL。分別取0、10 mL、12.5 mL、25 mL、50 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液于100 mL容量瓶中，定容，混勻，得到不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以保留時(shí)間和樣品加標(biāo)定性，再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品中有機(jī)酸的含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、Origin 8.5、SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅理化指標(biāo)的變化

2.1.1 醋醅中水分含量的變化

醋醅中水分含量的高低直接影響著微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝活動(dòng)[19]，其在麩醋發(fā)酵過(guò)程中的變化見(jiàn)圖1。

由圖1可知，醋醅中水分含量隨發(fā)酵的進(jìn)行呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，在發(fā)酵前3 d，水分含量逐漸升高；在發(fā)酵3 d時(shí)達(dá)到最高，為63.90%；第4～15天，前期下降明顯，后期下降緩慢，水分含量均維持在60%以上，總體波動(dòng)不大。分析原因可能是發(fā)酵前期微生物代謝旺盛，產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)、生成水、放熱，使麩醋醋醅溫度逐漸升高，水分呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)；發(fā)酵后期，溫度的升高使得水分被散發(fā)，同時(shí)由于麩皮具有較強(qiáng)的吸水能力導(dǎo)致其水分含量下降緩慢。

圖1 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中水分含量的變化Fig.1 Changes of water contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

2.1.2 醋醅中總酸含量和pH值的變化

食醋中影響其酸味的主要因素是pH和總酸。總酸是各種酸性物質(zhì)的總量，其含量是發(fā)酵過(guò)程中的一個(gè)重要理化指標(biāo)，是檢驗(yàn)發(fā)酵是否完成的標(biāo)志[20]。pH所反映的H+濃度決定著食醋酸味的強(qiáng)弱[6]。醋醅中總酸含量和pH值的變化見(jiàn)圖2。

圖2 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中總酸含量和pH值的變化Fig.2 Changes of total acid contents and pH value in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

由圖2可知，醋醅在發(fā)酵過(guò)程中總酸含量一直處于增長(zhǎng)的趨勢(shì)，前期增長(zhǎng)迅速，后期較為緩慢。分析原因可能是在發(fā)酵前期，醋醅適宜產(chǎn)酸微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝活動(dòng)，生成大量的有機(jī)酸，使總酸含量迅速升高；到發(fā)酵后期，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有機(jī)酸的積累，使釀造環(huán)境處于高酸度、低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，從而導(dǎo)致醋酸菌、乳酸菌等產(chǎn)酸菌代謝緩慢，總酸含量增長(zhǎng)緩慢。總酸含量不斷增加，pH值逐漸減小，但變化不明顯，始終維持在4.0～4.4之間，說(shuō)明四川麩醋醋醅在發(fā)酵過(guò)程中形成了一個(gè)緩沖體系，pH值始終處于動(dòng)態(tài)平衡。

2.1.3 醋醅中揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸含量的變化

食醋中有機(jī)酸包括揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸，其中揮發(fā)酸主要是乙酸，不揮發(fā)酸主要是乳酸[11]。醋醅中揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸含量的變化見(jiàn)圖3。

圖3 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中揮發(fā)酸與不揮發(fā)酸含量的變化Fig.3 Changes of non-volatile acid and volatile acid contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

在發(fā)酵過(guò)程中，揮發(fā)酸與不揮發(fā)酸含量均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。在發(fā)酵0～9 d，不揮發(fā)酸的含量高于揮發(fā)酸的含量；在發(fā)酵9～15 d，揮發(fā)酸的含量高于不揮發(fā)酸的含量，分析原因可能是由于在發(fā)酵前期乳酸菌大量繁殖，代謝產(chǎn)生乳酸等不揮發(fā)酸，發(fā)酵后期醋酸菌利用前期酵母菌產(chǎn)生的乙醇代謝生成乙酸。不揮發(fā)酸含量在發(fā)酵前期上升迅速，后期變得緩慢，可能是因?yàn)榘l(fā)酵初期未翻醅，醋醅處于厭氧環(huán)境，有利于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，后期天天翻醅，空氣進(jìn)入使乳酸菌代謝減慢，產(chǎn)物生成降低。揮發(fā)酸含量一直呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)，是由于醋醅發(fā)酵是糖化、酒化、醋化同時(shí)進(jìn)行的，醋酸菌邊繁殖邊利用酵母產(chǎn)生的乙醇代謝生成乙酸，在營(yíng)養(yǎng)充足，每天翻醅供氧的條件下，揮發(fā)酸含量快速上升。

2.1.4 醋醅中氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮是食醋重要的組成部分，反映食醋中氨基酸及小肽總體水平，其含量的高低影響著食醋的質(zhì)量等級(jí)和整體風(fēng)味[21]。醋醅中氨基酸態(tài)氮含量的變化見(jiàn)圖4。

圖4 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.4 Changes of amino acid nitrogen contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，且在發(fā)酵前期升高的快，后期相對(duì)緩慢。氨基酸態(tài)氮的來(lái)源主要是蛋白質(zhì)水解生成蛋白胨、肽、氨基酸等。發(fā)酵前期快速增加，可能與藥曲中酸性蛋白酶水解有關(guān)；發(fā)酵后期微生物數(shù)量減少、蛋白酶活力下降，同時(shí)，氨基酸態(tài)氮參與麩醋中風(fēng)味物質(zhì)的形成，使得氨基酸態(tài)氮含量上升緩慢[22]。

2.1.5 醋醅中還原糖含量的變化

還原糖作為一種重要的碳水化合物，在發(fā)酵過(guò)程主要以葡萄糖和麥芽糖的形式存在，為微生物的代謝活動(dòng)提供碳源和能源，同時(shí)也是形成食醋風(fēng)味的前提物質(zhì)[11]。醋醅中還原糖含量的變化見(jiàn)圖5。

圖5 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

由圖5可知，醋醅中還原糖含量在發(fā)酵前期不斷升高，后期逐漸降低。分析原因可能是發(fā)酵初期，微生物的大量繁殖代謝產(chǎn)生淀粉水解酶，原料中的淀粉被分解成葡萄糖、麥芽糖等還原糖，從而使醋醅中還原糖含量上升；發(fā)酵后期，微生物代謝活動(dòng)利用大量的還原糖，使其含量降低，此外，還原糖還參與食醋風(fēng)味及食醋顏色的形成。

2.1.6 醋醅中淀粉含量的變化

在食醋發(fā)酵過(guò)程中，淀粉作為其酒化階段的物質(zhì)基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)液化、糖化作用，轉(zhuǎn)化成糖類(lèi)等物質(zhì)，為微生物的生長(zhǎng)繁殖、代謝活動(dòng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來(lái)源，使得發(fā)酵得以順利的進(jìn)行，同時(shí)其含量的變化能反映發(fā)酵的進(jìn)度，對(duì)食醋釀造生產(chǎn)工藝具有指導(dǎo)作用[23]。醋醅中淀粉含量的變化見(jiàn)圖6。

由圖6可知，淀粉含量在醋醅發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。分析原因可能是在發(fā)酵前期，微生物代謝活動(dòng)產(chǎn)生各種液化酶、糖化酶等將淀粉迅速降解為還原糖，使其含量下降很快；此后，醋醅發(fā)酵以酒化作用為主，淀粉水解酶誘導(dǎo)作用降低、糖化力減弱，導(dǎo)致淀粉含量下降變得緩慢；發(fā)酵后期，由于酸的大量積累，使各類(lèi)酶的活性受到抑制，同時(shí)，微生物的生長(zhǎng)也受到抑制，淀粉含量變得緩慢。

圖6 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中淀粉含量的變化Fig.6 Changes of starch contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

2.2 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中有機(jī)酸分析

2.2.1 有機(jī)酸標(biāo)品的保留時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

通過(guò)HPLC對(duì)混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，各有機(jī)酸標(biāo)品的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。

表1 各有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Table 1 Standard curves of each organic acid

由表1可知，9種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，說(shuō)明線(xiàn)性關(guān)系良好，可用于各有機(jī)酸的定量。

2.2.2 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅有機(jī)酸組成及含量

采用高效液相色譜法對(duì)四川麩醋發(fā)酵階段的醋醅樣品中的有機(jī)酸組成及含量進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅有機(jī)酸組成及含量分析Table 2 Analysis of organic acid compositions and contents in fermented vinegar grains during fermentation process of Sichuan bran vinegar

由表2可知，從四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)出8種有機(jī)酸，分別為草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。其中丙酮酸含量由發(fā)酵初始階段的0.11 g/100 g干醅上升至發(fā)酵結(jié)束時(shí)的0.38 g/100 g干醅，提高了250%；乙酸含量由1.91 g/100 g干醅上升至5.65 g/100 g干醅，提高了200%；琥珀酸含量從0.21 g/100 g干醅上升至0.44 g/100 g干醅，提高了110%；乳酸含量從2.94 g/100 g干醅上升至4.26 g/100 g干醅，提高了40%；除此之外，其余各種有機(jī)酸均隨著發(fā)酵的進(jìn)行其含量也有不同程度的增長(zhǎng)，但增長(zhǎng)較為緩慢。

2.2.3 麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅有機(jī)酸的變化規(guī)律

麩醋發(fā)酵過(guò)程中含量最高的有機(jī)酸為乳酸和乙酸，其總量占有機(jī)酸總含量的80%以上，因此對(duì)醋醅的總有機(jī)酸以及兩種主要有機(jī)酸（乙酸、乳酸）含量的變化進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中總有機(jī)酸、乙酸及乳酸含量的變化Fig.7 Changes of the total organic acids,acetic acid and lactic acid contents in fermented vinegar grains during fermentation process of Sichuan bran vinegar

由圖7可知，麩醋發(fā)酵過(guò)程中，醋醅中有機(jī)酸總量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，從發(fā)酵初始階段的（5.76±0.56）g/100 g干醅增長(zhǎng)至發(fā)酵結(jié)束時(shí)的（11.55±0.42）g/100 g干醅，增長(zhǎng)了100%；乙酸含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中逐漸增加，而乳酸含量在發(fā)酵前12 d逐漸增加，最高達(dá)到（4.16±0.62）g/100 g干醅，這與發(fā)酵前12 d乳酸菌的大量增殖有密切的關(guān)系；發(fā)酵12 d之后乳酸含量開(kāi)始緩慢下降，這可能是因?yàn)槟承┪⑸锟梢詫⑷樗徂D(zhuǎn)化為其他次級(jí)代謝產(chǎn)物所致。

3 結(jié)論

四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅中的水分含量和還原糖含量呈先升后降的趨勢(shì)，前者在發(fā)酵3 d時(shí)含量最高，達(dá)到63.90%，后者在發(fā)酵9 d時(shí)含量最高，達(dá)到10.13 g/100 g干醅；pH值逐漸降低，但變化緩慢，且始終維持在4.0～4.4之間；淀粉含量不斷減少，這與微生物對(duì)淀粉的不斷降解和生長(zhǎng)繁殖代謝對(duì)還原糖的利用相關(guān)；而總酸含量卻一直處于增長(zhǎng)趨勢(shì)，揮發(fā)酸、不揮發(fā)酸變化趨勢(shì)與總酸大致相同；氨態(tài)酸態(tài)氮含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，且在發(fā)酵前期升高得快，后期相對(duì)緩慢。在麩醋發(fā)酵過(guò)程中，醋醅中的有機(jī)酸總量逐漸升高，從中共檢測(cè)出8種有機(jī)酸，分別為草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量差異較大，但均以乙酸與乳酸的含量最高，是發(fā)酵過(guò)程中的主體有機(jī)酸。