血清25-(OH)D水平及VDR基因多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的關(guān)系探討

魏巍 張偉 吳國(guó)志 陳榮

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，570311

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是以炎性滑膜炎反應(yīng)為主的系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，常可在發(fā)病2年內(nèi)出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)破壞，導(dǎo)致患者殘疾，嚴(yán)重影響日常生活[1]。維生素D是一種類固醇衍生物，其通過與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)相結(jié)合，可參與機(jī)體鈣磷代謝及骨鹽沉積，并可作用于機(jī)體免疫系統(tǒng)，影響多種細(xì)胞增殖及分化，參與免疫調(diào)節(jié)[2]。25-羥維生素D[25-(OH)D]是維生素D中間代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是反映維生素D水平的一個(gè)最可靠指標(biāo)[3]。VDR廣泛分布于機(jī)體各組織細(xì)胞中，其可參與骨代謝及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，參與骨代謝的VDR基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)主要為FokI、BsmI及ApaI等。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。有研究表明[5]，維生素D缺乏可加速類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生及惡化。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于維生素D水平及其受體基因多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕關(guān)系的研究尚少，基于此，本研究通過檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平及VDR基因多態(tài)性，并分析其與骨侵蝕的相關(guān)性，以期為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將本院2014年7月至2018年6月收治的94例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者設(shè)為研究組，另將85例同期體檢健康者設(shè)為健康組。其中研究組男35例，女59例，漢族，年齡34～62歲，平均(46.28±7.21)歲，病程4～32個(gè)月，平均(20.12±3.34)個(gè)月，受累關(guān)節(jié)數(shù)5～23個(gè)，平均(14.26±2.13)個(gè)，改良28關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)性評(píng)分(DAS28)[6]3.89～5.96分，平均(5.35±0.38)分；健康組男34例，女51例，漢族，年齡32～65歲，平均(47.93±7.45)歲。2組受試者在民族、性別及年齡方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：研究組均符合類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，均經(jīng)X線檢查；近3個(gè)月內(nèi)均未接受維生素D類似物治療；所有受試者均知情同意，且均為漢族。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并骨質(zhì)疏松以及其他與骨侵蝕有關(guān)疾病者；腫瘤、感染等引起關(guān)節(jié)疼痛者；不能正常飲食或不能接受戶外陽(yáng)光照射者；存在血緣關(guān)系者。

1.2 方法

1.2.1血清25-(OH)D水平檢測(cè)：均抽取受試者清晨空腹靜脈血3 mL，離心，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清25-(OH)D水平(試劑盒購(gòu)于英國(guó)艾迪斯公司)，所有步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.2.2VDR基因多態(tài)性檢測(cè)：⑴血樣DNA提?。翰杉茉囌哽o脈血4 mL，根據(jù)Wizard Genonic DNA purification Kit(Promega公司)試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取DNA并經(jīng)分光光度計(jì)定量及瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢；⑵引物設(shè)計(jì)與合成：選擇3個(gè)VDR基因SNPs位點(diǎn)，即FokI(rs2228570)位點(diǎn)、BsmI(rs154410)位點(diǎn)、ApaI(rs7975232)位點(diǎn)，參照Mosaad等[9]設(shè)計(jì)的用于VDR基因擴(kuò)增引物，由北京奧科生物公司合成；⑶基因型檢測(cè)：采用MassARRAY分子量陣列技術(shù)平臺(tái)，通過引物延伸或切割反應(yīng)與MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，而對(duì)所選VDR基因SNPs位點(diǎn)分型進(jìn)行檢測(cè)，獲得分型結(jié)果。

1.2.3骨侵蝕分期：根據(jù)經(jīng)雙手X線片檢查分期(任意一個(gè)受累關(guān)節(jié))[8]，Ⅰ期：無骨質(zhì)破壞性改變或關(guān)節(jié)端骨質(zhì)疏松；Ⅱ期：骨質(zhì)疏松、可有輕度軟骨破壞、伴或不伴輕度軟骨下骨質(zhì)破壞，可伴有關(guān)節(jié)活動(dòng)受限但無關(guān)節(jié)畸形等；Ⅲ期：骨質(zhì)疏松伴軟骨破壞，明顯關(guān)節(jié)軟骨下囊樣破壞，關(guān)節(jié)半脫位，關(guān)節(jié)間隙狹窄等；Ⅳ期：除了包含Ⅱ、Ⅲ期內(nèi)容外，且有纖維性或骨性強(qiáng)直；其中Ⅰ期與Ⅱ期歸為無骨侵蝕(25例)，Ⅲ期與Ⅳ期歸為有骨侵蝕(69例)。

1.3 觀察指標(biāo)

研究組與健康組血清25-(OH)D水平：其中<20 ng/mL記為缺乏，≥20 ng/mL且<30 ng/mL記為不足，≥30 ng/mL且≤100 ng/mL記為正常。研究組骨侵蝕者與無骨侵蝕者血清25-(OH)D水平。研究組與健康組基因型、等位基因分布：缺乏內(nèi)切酶FokI、BsmI、ApaI酶切位點(diǎn)用F、A、B表示，存在酶切位點(diǎn)用f、a、b表示。研究組骨侵蝕者與無骨侵蝕者基因型、等位基因分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩樣本計(jì)量資料與計(jì)數(shù)資料分別采用t檢與χ2檢驗(yàn)，血清25-(OH)D水平、VDR基因多態(tài)性與骨侵蝕關(guān)系探討采用Logistic多元逐步回歸模型進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組與健康組血清25-(OH)D水平比較

研究組血清25-(OH)D水平明顯低于健康組(P<0.05)，見表1。

2.2 研究組骨侵蝕與無骨侵蝕者血清25-(OH)D水平比較

研究組骨侵蝕患者血清25-(OH)D水平明顯低于無骨侵蝕者(P<0.05)，見表2。

表1 研究組與健康組血清25-(OH)D水平對(duì)比

表2 研究組骨侵蝕與無骨侵蝕者血清25-(OH)D水平對(duì)比

2.3 研究組與健康組基因型、等位基因分布比較

研究組BsmI位點(diǎn)基因型頻率及等位基因B頻率與健康組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究組FokI位點(diǎn)基因型FF、Ff及等位基因F占比均明顯高于健康組(P<0.05)，研究組FokI位點(diǎn)基因型ff占比明顯低于健康組(P<0.05)，研究組ApaI位點(diǎn)基因型AA、Aa及等位基因A占比均明顯高于健康組(P<0.05)，研究組ApaI位點(diǎn)基因型aa占比明顯低于健康組(P<0.05)，見表3。

表3 各位點(diǎn)基因型和等位基因分布Table 3 Genotype and allele distribution of each locus

續(xù)表3 各位點(diǎn)基因型和等位基因分布

2.4 研究組骨侵蝕與無骨侵蝕者基因型、等位基因分布比較

研究組骨侵蝕患者FokI位點(diǎn)、ApaI位點(diǎn)、BsmI位點(diǎn)基因型出現(xiàn)頻率與無骨侵蝕患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究組骨侵蝕患者FokI位點(diǎn)、ApaI位點(diǎn)、BsmI位點(diǎn)的等位基因F、B、A出現(xiàn)頻率與無骨侵蝕患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 骨侵蝕與無骨侵蝕者各位點(diǎn)基因型和等位基因分布

續(xù)表4 骨侵蝕與無骨侵蝕者各位點(diǎn)基因型和等位基因分布

2.5 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點(diǎn)基因型與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

經(jīng)Logistic多元逐步回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，血清25-(OH)D<30 ng/mL、FokI位點(diǎn)基因型FF及Ff、ApaI位點(diǎn)基因型AA及Aa均是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的危險(xiǎn)因素(OR=5.149、4.267、3.013、5.234、5.097，P<0.05)，BsmI位點(diǎn)基因型BB及Bb與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病無明顯關(guān)系(OR=1.006、1.002，P>0.05)，見表5。

表5 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點(diǎn)基因型與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

2.6 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點(diǎn)基因型與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的關(guān)系

經(jīng)Logistic多元逐步回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，血清25-(OH)D<20 ng/mL是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的危險(xiǎn)因素(OR=3.987，P<0.05)，F(xiàn)okI位點(diǎn)基因型FF及Ff、BsmI位點(diǎn)基因型BB及Bb、ApaI位點(diǎn)基因型AA及Aa均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕無明顯關(guān)系(OR=1.007、1.009、1.003、1.001、1.011、1.012，P>0.05)，見表6。

表6 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點(diǎn)基因型與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的關(guān)系

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病可能與遺傳、多種免疫因素等有關(guān)，其病理變化主要為間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜襯里細(xì)胞增生以及骨和軟骨組織破壞等[10]。骨侵蝕患者的骨關(guān)節(jié)損傷不可逆，故早期診斷及干預(yù)極其重要。X線檢查是臨床診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的常用手段，但經(jīng)X線檢查顯示異常者多已出現(xiàn)不可逆骨關(guān)節(jié)破壞，嚴(yán)重影響疾病恢復(fù)[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，研究組血清25-(OH)D水平低于健康組(P<0.05)，且骨侵蝕患者低于無骨侵蝕者(P<0.05)。另分析發(fā)現(xiàn)血清25-(OH)D<30 ng/mL是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的危險(xiǎn)因素，血清25-(OH)D<20 ng/mL是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的危險(xiǎn)因素，提示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平降低，且在伴骨侵蝕患者中降低更加明顯，血清25-(OH)D水平缺乏可增加骨侵蝕發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。維生素D是骨正常鈣化及礦物質(zhì)代謝所必需的，可促進(jìn)骨形成，而血清25-(OH)D是維生素D的活性形式，其水平的降低表明維生素D減少[11]。有研究顯示[12]，T、B淋巴細(xì)胞以及其相關(guān)細(xì)胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。維生素D是抑制胸腺基質(zhì)樹突狀細(xì)胞分化成熟的主要因子，可直接作用于Th1、Th2及Th17細(xì)胞，減少炎性細(xì)胞因子分泌，并促進(jìn)抗炎細(xì)胞合成[14]。因此，維生素D既可改善關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞，亦具有免疫抑制作用。當(dāng)25-(OH)D水平降低，則維生素D調(diào)節(jié)骨骼及鈣磷代謝作用減弱，影響關(guān)節(jié)骨質(zhì)破損的修復(fù)，且免疫抑制功能下降，炎性反應(yīng)加重，則病情進(jìn)一步發(fā)展，關(guān)節(jié)損傷程度加重[15]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平越低，其關(guān)節(jié)破壞程度越嚴(yán)重，此與本研究結(jié)果相符合。因此，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平減低，且其缺乏可增加骨侵蝕發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，研究組FokI位點(diǎn)基因型FF、Ff與等位基因F以及ApaI位點(diǎn)基因型AA、Aa與等位基因A頻率均明顯高于健康組(P<0.05)，研究組基因型ff、aa占比均明顯低于健康組(P<0.05)，且分析發(fā)現(xiàn)FokI位點(diǎn)基因型FF及Ff、ApaI位點(diǎn)基因型AA及Aa均是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的危險(xiǎn)因素，提示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病可能與VDR基因FokI位點(diǎn)等位基因F、ApaI位點(diǎn)等位基因A有關(guān)?；蚨鄳B(tài)性可改變VDR mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上影響VDR蛋白表達(dá)，促使VDR蛋白在數(shù)量及活力上出現(xiàn)不同，影響維生素D發(fā)揮效應(yīng)[17]。VDR是糖皮質(zhì)激素、甲狀腺激素等受體基因超家族成員，存在多個(gè)SNPs位點(diǎn)，不同基因型的VDR可對(duì)維生素D產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)[18]。本研究還發(fā)現(xiàn)，研究組骨侵蝕患者FokI位點(diǎn)、ApaI位點(diǎn)、BsmI位點(diǎn)基因型等級(jí)分布及等位基因出現(xiàn)頻率均與無骨侵蝕患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且分析發(fā)現(xiàn)其均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕無明顯關(guān)系，提示VDR基因多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。

綜上，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平降低，且其缺乏可增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，另VDR基因FokI位點(diǎn)等位基因F及ApaI位點(diǎn)等位基因A雖可增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但與骨侵蝕無關(guān)。臨床工作者需及早監(jiān)測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平并適時(shí)補(bǔ)充維生素D，另需提高對(duì)含VDR基因FokI位點(diǎn)等位基因F及ApaI位點(diǎn)等位基因A者的警惕。但本研究樣本量較小，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行相關(guān)性研究。