葛根素對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折骨痂血管形成的影響

鮑根強(qiáng) 肖春來(lái) 張國(guó)輝 李華 趙曉亮 王泉

哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院手足外科，河北 衡水 053000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨微結(jié)構(gòu)退化，骨脆性增加為主的一種全身性系統(tǒng)性疾病，骨折風(fēng)險(xiǎn)增高，骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅老年人群的健康和生活質(zhì)量[1]。骨質(zhì)量下降導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，使得骨折愈合的組織學(xué)基礎(chǔ)變差，骨折愈合延遲[2]。因此，OPF的防治和治療已成為醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。中草藥治療OP歷史悠久，具備療效顯著、價(jià)格低、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)葛根素可用于臨床OP的預(yù)防和治療，可促進(jìn)去卵巢大鼠骨折愈合[3]。本研究主要探討葛根素對(duì)OPF骨痂血管形成及骨折愈合的影響，為OPF治療提供臨床應(yīng)用理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

60只SPF級(jí)健康雌性SD大鼠，3月齡，體重(320±30)g，訂購(gòu)于北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(合格證號(hào)SCXK 京2017-002)。葛根素注射液(100 mg/支，陜西安康制藥廠，100 mg/支，批號(hào)：1610053)，柜式X線照片機(jī)購(gòu)置于美國(guó)Hologic公司，ELISA檢測(cè)試劑盒訂購(gòu)于武漢云克隆科技股份有限公司，兔抗鼠VEGF和BMP-2多克隆抗體均購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)：60只SPF級(jí)健康SD大鼠，于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障環(huán)境伺養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為假手術(shù)組、去勢(shì)組、葛根素組，假手術(shù)組僅切除部分脂肪組織，去勢(shì)組、葛根素組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。4周后確認(rèn)骨質(zhì)疏松造模成功后，各組均行左側(cè)股骨干閉合性骨折髓內(nèi)固定術(shù)，于造模成功后第2天給予不同藥物干預(yù)，假手術(shù)組、去勢(shì)組：皮下注射0.9% Nacl 5 mL/kg，1次/d；葛根素組：皮下注射葛根素35 mg/kg，1次/d。連續(xù)用藥6周。各組大鼠分籠飼養(yǎng)。

1.2.2構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨折模型：參照羅靜華等[4]構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型的建立與內(nèi)固定方法，術(shù)后常規(guī)青霉素80萬(wàn)U肌肉注射，預(yù)防感染。造模成功后于術(shù)后第2 天給予各組不同藥物干預(yù)。

1.2.3組織標(biāo)本處理：攝片后急性大失血法處死大鼠，左心室采血3～5 mL，離心，收取血清1～2 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。剝離取出右股骨骨痂組織，10%甲醛固定24 h，10%硝酸脫鈣6周，制作組織切片，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4放射性(X線)檢查：術(shù)后6周進(jìn)行X線攝片，觀察各組大鼠骨折端骨痂生長(zhǎng)和骨折線模糊情況。每組選取20只大鼠，放射學(xué)評(píng)估采用Warden等[5]的X線評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，依據(jù)骨折斷端表現(xiàn)行骨折愈合評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：沒(méi)有愈合：1分；骨痂形成不明顯：2分；骨折部分愈合：3分；骨折線逐漸消失，骨痂逐漸吸收消失：4分；完全愈合：5分。

1.2.5ELISA法檢測(cè)血清濃度：采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清BMP-2和VEGF濃度，參照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，以450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各組的吸光度值(OD值)。

1.2.6HE染色：參照HE染色法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作[6]，光鏡下觀察染色并采集圖片。選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)新生毛細(xì)血管數(shù)，取其平均值。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色法：參照免疫組織化學(xué)染色法步驟進(jìn)行操作[7]。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨折愈合觀察及評(píng)分

假手術(shù)組骨折端骨折線幾乎模糊或消失，骨痂大量生長(zhǎng)，體積較大，骨痂連接包饒骨折斷端周圍及骨皮質(zhì)，連接緊密，并開始重建塑形，斷端髓腔再通；去勢(shì)組骨斷端骨折線依然清晰可見，骨痂未見明顯生長(zhǎng)，斷端骨痂未連接，骨折愈合欠佳；葛根素組骨折線部分模糊或消失，較多骨痂生長(zhǎng)，骨折端有骨痂包繞連接，部分愈合。去勢(shì)組較假手術(shù)組骨折愈合評(píng)分顯著降低(P<0.05)，葛根素組較去勢(shì)組骨折愈合評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 X線觀察骨折愈合情況 A：假手術(shù)組；B：去勢(shì)組；C：葛根素組。Fig.1 X-ray observation of fracture healing. A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表1 各組大鼠骨折愈合評(píng)分比較Table 1 Comparison of fracture healing scores among rats in each group

2.2 血清BMP-2和VEGF濃度

去勢(shì)組較假手術(shù)組血清BMP-2和VEGF濃度均顯著降低(P<0.05)，葛根素組較去勢(shì)組血清BMP-2和VEGF濃度均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清BMP-2和VEGF濃度比較Table 2 Comparison of serum BMP-2 and VEGF concentrations among the groups

2.3 骨痂組織學(xué)觀察

假手術(shù)組骨痂組織可見大量骨小梁生長(zhǎng)旺盛，排列致密有序，互相交錯(cuò)網(wǎng)狀，大量成骨細(xì)胞及新生小血管等成熟骨組織；去勢(shì)組骨痂組織可見少量骨小梁，生長(zhǎng)稀疏，排列紊亂，大量纖維軟骨細(xì)胞等纖維組織，成骨細(xì)胞及新生小血管少見；葛根素組骨痂組織可見較多骨小梁，骨小梁生長(zhǎng)較旺盛，排列有序，可見較多成熟的骨細(xì)胞，新生小血管較多。去勢(shì)組血管數(shù)顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，葛根素組血管數(shù)顯著高于去勢(shì)組(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 觀察骨痂組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200) A：假手術(shù)組；B：去勢(shì)組；C：葛根素組。Fig.2 Observation of the morphological changes of the epiphysis (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表3 各組大鼠骨痂組織血管計(jì)數(shù)比較Table 3 Comparison of blood vessel counts of osteophytes among each group

2.4 骨痂BMP-2和VECF表達(dá)

BMP-2定位于成骨細(xì)胞胞漿及骨小梁的邊緣，VEGF定位于成骨細(xì)胞胞質(zhì)及少量成熟軟骨細(xì)胞，陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色。去勢(shì)組較假手術(shù)組BMP-2和VEGF陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，葛根素組較去勢(shì)組BMP-2和VEGF陽(yáng)性表達(dá)均顯著增高(P<0.05)。見圖3、圖4和表4。

圖3 觀察骨痂組織BMP-2表達(dá)(×200) A：假手術(shù)組；B：去勢(shì)組；C：葛根素組。Fig.3 Observation of the expression of BMP-2 in osteophyte (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

圖4 觀察骨痂組織VEGF表達(dá)(×200) A：假手術(shù)組；B：去勢(shì)組；C：葛根素組。Fig.4 Observation of the expressions of VEGF in osteophytes (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表4 各組大鼠骨痂組織BMP-2和VECF表達(dá)比較Table 4 Comparison of expressions of BMP-2 and VEGF in osteophytes among rats in each group

3 討論

OP是中老年人的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害老年人的健康[8]。OPF作為OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥，因其治療較正常骨折困難，且易于發(fā)生二次骨折，是臨床骨科的一大難題[9]。隨著我國(guó)人口的老齡化的加劇，OP和OPF的發(fā)病率逐漸上升，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。

婦女絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降是引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要原因，雌激素代替療法(ERT)可預(yù)防治療OP[10]。雌激素可促進(jìn)骨小梁生成和加速骨折的愈合，但是長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素卻能帶來(lái)很多不良反應(yīng)(如子宮內(nèi)膜癌、血栓栓塞性疾病)[11]。葛根素是一種異黃酮衍生物，屬于植物雌激素，其結(jié)構(gòu)類似雌二醇，具有某些雌激素樣作用，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病等[12]。葛根素通過(guò)與雌激素受體(ER)結(jié)合能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化功能，增加骨密度和骨強(qiáng)度，具有抗骨吸收、促進(jìn)骨形成[13-15]。同時(shí)有研究表明也葛根素可以調(diào)節(jié)去卵巢大鼠OPF骨代謝，促進(jìn)骨形成，加快骨折愈合[16]。

血管生成在骨發(fā)育、骨折愈合中起著重要作用。血管生成能提供骨愈合所需要的營(yíng)養(yǎng)及各種成骨細(xì)胞成分，新生血管系統(tǒng)在骨發(fā)育、重塑、骨折修復(fù)和穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)目前作為最重要的促血管生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成[17]。VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、滲透等方面起著重要調(diào)節(jié)作用，其誘導(dǎo)血管生成可促進(jìn)骨再生與修復(fù)[18]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是最強(qiáng)有力的骨誘導(dǎo)劑，BMP能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，促進(jìn)新骨形成，其中尤以BMP-2作用最顯著，BMP-2通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活其下游信號(hào)分子促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)成骨的能力。

本研究表明去勢(shì)組較假手術(shù)組骨折愈合評(píng)分、血清BMP-2和VEGF濃度、骨痂BMP-2和VEGF表達(dá)、微血管數(shù)均顯著降低(P<0.05)，葛根素組較去勢(shì)組上述指標(biāo)均顯著增高(P<0.05)。去勢(shì)組骨痂組織可見少量骨小梁，生長(zhǎng)稀疏，排列紊亂，間隙增寬，大量纖維軟骨細(xì)胞等纖維組織，成骨細(xì)胞及新生小血管少見；葛根素組骨痂組織為大量成熟骨組織，骨小梁生長(zhǎng)旺盛，互相交錯(cuò)網(wǎng)狀，排列致密有序，較多成骨細(xì)胞，新生小血管較多。說(shuō)明葛根素通過(guò)促進(jìn)去卵巢大鼠OPF骨痂組織BMP-2和VEGF表達(dá)，促進(jìn)骨痂血管形成，進(jìn)而加快骨折愈合。周雪明等[19]研究發(fā)現(xiàn)葛根素能改善骨折后的骨和骨骼肌的血流量。田發(fā)明等[20]研究發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆可促進(jìn)去卵巢大鼠OPF血管形成，促進(jìn)骨折早期愈合。

綜上所述，葛根素通過(guò)介導(dǎo)去卵巢大鼠OPF骨痂BMP-2和VEGF表達(dá)，促進(jìn)骨痂血管形成，改善骨組織形態(tài)學(xué)，加快骨折愈合。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)研究?jī)H是初步結(jié)果，但其具體作用機(jī)制目前尚未完全清楚，還有待于進(jìn)一步研究。因此，探討中西結(jié)合防治OP是未來(lái)研究的重點(diǎn)，同時(shí)也為中草藥的應(yīng)用開辟了新的途徑。