基于骨組織Dlx5啟動子甲基化探究補腎中藥復方對去卵巢骨質疏松癥大鼠的療效機制

王劍 劉劍輝 李屹 王實 劉研 豐雪妮 劉永林 劉文艷 宋光熠 鄭洪新

1.遼寧省基礎醫(yī)學研究所，遼寧 沈陽 1101012.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是原發(fā)性骨質疏松Ⅰ型，特征為骨量減少、顯微結構退化、脆性增高，臨床常表現(xiàn)為腰背酸痛、駝背、變矮、易骨折，直接原因是女性絕經后雌激素水平下降導致骨重建失衡，中醫(yī)藥防治療效肯定，但作用機制不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳調控重要組成之一的DNA甲基化通過調控骨質疏松相關基因的表達，影響骨質疏松的發(fā)生、發(fā)展[1]。本研究以成骨細胞分化中起關鍵作用的遠端缺失同源盒5(distal-less homeobox 5，Dlx5)[2]基因啟動子甲基化水平為效應指標，探索基于中醫(yī)“腎主骨”理論指導的補腎中藥復方的療效機理，為中醫(yī)藥防治PMOP提供表觀遺傳學實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雌性(未曾交配)大鼠61只，3月齡，體質量(240±20)g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司(遼寧省實驗動物資源中心)，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。動物飼養(yǎng)于遼寧省基礎醫(yī)學研究所藥理實驗室(國家中醫(yī)藥管理局二級實驗室)，室溫20 ℃～25 ℃，相對濕度35%～65%，喂以大小鼠維持飼料(遼寧長生生物技術股份有限公司)。

1.2 分組與造模

大鼠購進，適應性飼養(yǎng)4 d后，完全隨機分出12只為正常組，余者行雙側卵巢摘除術：3%戊巴比妥鈉腹腔注射(35 mg/kg)麻醉，腹部切口摘除雙側卵巢。術者完全隨機分為模型組12只、補腎中藥復方組18只、仙靈骨葆陽性對照組19只。灌胃期間，仙靈骨葆陽性對照組大鼠死亡1只，取材大鼠共計60只。

1.3 實驗藥品及給藥劑量與方法

1.3.1實驗藥品：補腎中藥復方：馬鹿茸凍干粉(遼寧宏宇生物科技有限公司)、淫羊藿顆粒(規(guī)格：顆粒100 g相當于飲片2 100 g，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司)、納米牡蠣殼微粉(平均粒徑780 nm，長山島大連灣)；陽性對照藥仙靈骨葆膠囊[由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃組成，國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，國藥準字Z20025337，批號180417]。

1.3.2給藥劑量與方法：大鼠等效劑量按成人(體質量60 kg)6.3倍計算，給藥容積：1 mL/100 g。正常組和模型組給生理鹽水；補腎中藥復方組給補腎中藥復方[馬鹿茸凍干粉0.315 g/(kg·d)、淫羊藿顆粒0.15 g/(kg·d)、納米牡蠣殼微粉1.05 g/(kg·d)]；仙靈骨葆陽性對照組給仙靈骨葆膠囊粉0.315 g/(kg·d)。術后6 d開始，每日灌胃1次(每灌6 d，休息1 d不灌)，連續(xù)14周。

1.4 主要儀器

X射線骨密度測定儀(STRATOS DR，Diagnostic Medical System SA，法國)、MassARRAY Nanodispenser(RS1000，SEQUENOM)、S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)、PCR儀(96孔，BIORAD)等。

1.5 主要試劑

QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，51304)、PCR Accessory Set(SEQUENOM，11327)、EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO，D5005)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM，10129.1)、Spectro CHIP?Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM，10117)等。

1.6 指標檢測

1.6.1骨密度(bone mineral density，BMD)：取第1～6腰椎，剔除附著之軟組織，用生理鹽水沖洗，包以生理鹽水浸濕的醫(yī)用紗布，外包錫紙，寫好編號，-80 ℃冰箱凍存。應用X射線骨密度測定儀(STRATOS DR)檢測大鼠離體第1～6腰椎骨密度，精細模式掃描，用儀器附帶的DMS小動物骨密度分析軟件(版本：V4.0.7.1)分析骨密度值，以單位面積的骨礦含量(g/cm2)表示。

1.6.2Dlx5啟動子甲基化水平：取雙側股骨頭，剔除附著之軟組織，用生理鹽水沖凈血污，無菌吸水紙吸干，裝入對應編號的液氮凍存管，擰緊管蓋，液氮速凍0.5 h后，-80 ℃冰箱凍存。質譜法檢測：①引物設計：檢測片段：Dlx5基因啟動子-470 bp至-4 bp(序列：GCAGGCTGACTGTTGGCTGAGGCGCA GCACAGCCTTGGTTAAATCCTTAATTGCGCGCTTA CGCACAGCGGGGTGGATCGGGTTCCATTGGCCAG GGCCTCGGGAGCAGAGCAACACCCTAACTCGTTC AACTAGTTTTAGCACAACAAAGCATTGCTTAAAA AAGAGAGAGGGGGGGGGCGTACAAGGAGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG AGAGAGAGAGAGAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGAG AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTG TACGTGTTGTTGCCTGTTGGGGGAGGCAGGGTCTC AGTCGATCTGTTTTTAGTGAATAGCTGCTACAAAT CAAGCAGTTCCAGGGCCCAGCTCTGTGCTGTT)，長度467 bp，CpG位點總數(shù)11個，能檢測到10個CpG位點。引物設計使用 Sequenom 公司 Epidesigner(http://www.epidesigner.com)，修飾后的上游引物：aggaagagagGTAGGTTGATTGTTGGTTGAGG，修飾后的下游引物：cagtaatacgactcactatagggagaaggct AACAACACAAAACTAAACCCTAAAA。引物設計完成后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。②DNA提?。菏褂肣IAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)試劑盒提取骨組織DNA。③重亞硫酸鹽處理：使用PCR儀(96孔，BIORAD)、EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO)試劑盒對DNA樣品進行重亞硫酸鹽處理，使未甲基化的C轉變?yōu)閁，甲基化的C不變。PCR儀程序：98 ℃，10 min→64 ℃，2.5 h→4 ℃，forever。④PCR擴增：使用S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)、PCR Accessory Set(SEQUENOM)試劑盒和步驟①設計合成的引物擴增重亞硫酸鹽處理后的樣品。PCR程序：94 ℃，10 min；(94 ℃，45 s；62 ℃，48 s，-0.5 ℃/cycle；72 ℃，1 min)10cycles；(94 ℃，45 s；57 ℃，48 s；72 ℃，1 min)35cycles；72 ℃，3 min；4 ℃，forever。⑤堿性磷酸酶處理(SAP)：使用S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM)試劑盒處理步驟④的PCR產物。PCR儀程序：37 ℃，20 min→85 ℃，5 min→4 ℃，forever。⑥體外轉錄(IVT)和RNase酶切：使用S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)、MassCLEAVE Kit(SEQUENOM)試劑盒將SAP處理后的PCR產物進行體外轉錄和RNase酶切。PCR儀程序：37 ℃，3 h→4 ℃，forever。⑦純化，點樣及質譜：使用Spectro CHIP?Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM)試劑盒。先將酶切產物純化，再用MassARRAY Nanodispenser(RS1000，SEQUENOM)將純化產物點至384格式 Spectro CHIP (SEQUENOM)芯片上，將芯片放入MassARRAY Compact System (SEQUENOM)檢測。Spectro CHIP 芯片使用 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析技術，檢測數(shù)據(jù)用 EpiTYPER 軟件(SEQUENOM)分析并輸出結果。本實驗質譜法檢測甲基化由北京博奧晶典生物技術有限公司完成。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 第1～6腰椎骨密度

與正常組比較，模型組第1～6腰椎骨密度明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，補腎中藥復方組、仙靈骨葆陽性對照組第1～6腰椎骨密度明顯升高(P<0.05)；補腎中藥復方組比仙靈骨葆陽性對照組第1～6腰椎骨密度有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠離體第1～6腰椎骨密度Table 1 BMD of the rat lumbar vertebra 1-6 in each

2.2 骨組織Dlx5啟動子-470 bp至-4 bp甲基化水平

甲基化檢測每組隨機抽取8個樣本送檢，共計32個樣本，補腎中藥復方組有1個樣本PCR失敗了，故31個樣本上質譜分析。Dlx5基因啟動子檢測片段-470 bp至-4 bp含有CpG位點11個，位點4未檢測到，檢測到10個CpG位點，位點11正常組有2個樣本沒分析出來。

與正常組比較，模型組CpG2.3甲基化水平明顯升高(P<0.01)，模型組CpG1、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG10甲基化水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，補腎中藥復方組、仙靈骨葆陽性對照組CpG1甲基化水平明顯降低(P<0.05)，補腎中藥復方組CpG2.3、CpG5、CpG6、CpG7、CpG10、CpG11甲基化水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，仙靈骨葆陽性對照組CpG8、CpG10、CpG11甲基化水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表2。

表2 各組大鼠骨組織Dlx5基因啟動子-470 bp至-4 bp甲基化水平Table 2 Methylation level of Dlx5 gene promoter -470 bp - -4 bp in bone of rats in each

3 討論

表觀遺傳是研究基因序列不發(fā)生改變的情況下，產生基因表達的可遺傳變化。表觀遺傳修飾是一種重要的基因表達調控機制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾(甲基化、乙?；?、磷酸化等)、非編碼RNA和微小RNA(microRNA)、染色質重塑等。近年研究表明，DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNA可調控多種成骨、破骨相關基因的表達，從而影響成骨細胞和破骨細胞的分化和活性，參與骨質疏松的發(fā)生發(fā)展[3]。DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一，在DNA甲基轉移酶的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)為甲基供體，將其活性甲基轉移到5’-CpG-3’二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上，是可逆的DNA自然化學修飾方式。啟動子序列DNA甲基化抑制基因表達[2]，甲基化DNA與甲基化胞嘧啶結合蛋白(methylcytosine binding proteins，MeCP)結合，誘導染色質組蛋白脫乙?；?，構象改變，抑制基因轉錄[4]。第1外顯子甲基化沉默轉錄[5]，可能因為第1外顯子甲基化阻礙轉錄起始。基因體甲基化與基因表達水平呈正相關，可能因為基因體DNA甲基化抑制基因內啟動子啟動的假轉錄，從而實現(xiàn)5’基因啟動子啟動的有效轉錄[2]。Delgado-Calle等[6]研究骨質疏松性髖部骨折和髖關節(jié)炎患者骨全基因組甲基化譜，發(fā)現(xiàn)兩組患者中：甲基化與基因表達之間存在全基因組負相關；甲基化差異顯著的CpG位點共241個，分布于228個基因中，差異甲基化基因多為與細胞分化和成骨相關的基因，例如同源盒(homeobox，Hox)家族的基因，說明骨質疏松發(fā)病可能與這些基因甲基化改變相關。

同源盒超家族基因不僅在胚胎發(fā)生過程中對骨骼結構起重要作用，而且還影響成骨細胞的分化和活性[6]。Dlx5屬于同源盒基因家族，通過調控靶基因Runx2、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、I型膠原轉錄，促進成骨細胞分化，礦化骨基質[7-10]，對防治骨質疏松癥意義重大。張志恒等[11]研究表明，健骨顆粒能明顯升高去卵巢小鼠骨組織Dlx5 mRNA和蛋白表達，有效防治骨質疏松。本課題組前期研究表明，去卵巢骨質疏松癥大鼠骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達明顯降低，補腎壯骨中藥復方可明顯上調之，有效防治絕經后骨質疏松[12]。Zhang等[13]研究表明，DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)上調Dlx5表達，說明Dlx5 DNA甲基化負調控其表達。Novakovic等[14]研究表明，妊娠期間Dlx5甲基化與其mRNA表達負相關。那么，去卵巢導致的骨組織Dlx5表達下降是否與其異常甲基化有關，補腎中藥是否通過調節(jié)其甲基化而上調其表達，Dlx5異常甲基化是否與絕經后骨質疏松癥的發(fā)病有關呢？

本研究基于中醫(yī)“腎主骨”理論，依據(jù)PMOP“腎虛”的根本病機[12]，組補腎中藥復方(鹿茸為君，壯腎益精、強筋健骨；淫羊藿為臣，補腎陽、強筋骨；佐以牡蠣，補腎、強骨節(jié)、潛陽補陰)，補腎以健骨，以臨床治療骨質疏松癥療效確切的同濟堂仙靈骨葆膠囊(由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃組成，功效滋補肝腎、接骨續(xù)筋、強身健骨)為陽性對照藥，以骨組織Dlx5基因啟動子-470 bp至-4 bp甲基化水平為效應指標，探究PMOP的發(fā)病機制以及補腎中藥復方的療效機理。本研究采用經典方法切除雌性大鼠雙側卵巢建立PMOP動物模型[15]。結果顯示，模型組大鼠第1～6腰椎骨密度比正常組明顯降低，骨組織Dlx5啟動子-470 bp至-4 bp CpG2.3甲基化水平比正常組明顯升高。說明PMOP模型建立成功，去卵巢造成骨組織Dlx5啟動子高甲基化，甲基化DNA與甲基化胞嘧啶結合蛋白結合，誘導染色質組蛋白脫乙?；?，構象改變，抑制其轉錄，下調其表達，進而下調其靶基因Runx2、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、I型膠原的表達，抑制成骨細胞分化和成骨，導致骨質疏松。補腎中藥復方組、仙靈骨葆陽性對照組第1～6腰椎骨密度比模型組明顯升高，骨組織Dlx5 啟動子-470 bp至-4 bp CpG1甲基化水平比模型組明顯降低。說明本研究補腎中藥復方和仙靈骨葆可有效防治PMOP，通過降低去卵巢骨質疏松大鼠骨組織Dlx5啟動子甲基化水平，降低甲基化DNA與甲基化胞嘧啶結合蛋白結合，染色質組蛋白乙?；?，賴氨酸殘基掉正電荷，降低組蛋白與帶負電荷的DNA的結合，促進其轉錄，上調其表達，進而上調其靶基因Runx2、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、I型膠原的表達，促進成骨細胞分化和成骨，有效防治PMOP。從而證明絕經后骨質疏松癥的發(fā)病機制之一可能是骨組織Dlx5啟動子甲基化水平升高；補腎中藥復方可能通過降低骨組織Dlx5 啟動子甲基化水平，有效防治該病。