Visfatin基因啟動(dòng)子區(qū)域的遺傳變異與中國北方漢族人群缺血性卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)研究

朱瑞霞，王倩雯，劉 旭，何志義

缺血性卒中(IS)是所有卒中中最常見的類型，占卒中的70%以上[1]，其發(fā)病率、致殘率、死亡率均高，嚴(yán)重影響人類的健康。IS是一種復(fù)雜的疾病，受到遺傳和環(huán)境因素的共同影響[2]。炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，而動(dòng)脈粥樣硬化則是缺血性卒中的主要病因。Visfatin(又稱前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子)是一種在內(nèi)臟脂肪中明顯表達(dá)的新型促炎性脂肪因子[3]。Visfatin是一種分子量為52-55kDa的蛋白質(zhì)，最初發(fā)現(xiàn)它可以作為生長因子，增強(qiáng)干細(xì)胞和白介素7對于前B細(xì)胞分化的作用[4，5]。最近的研究表明，visfatin在炎癥相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化過程中發(fā)揮了重要作用。據(jù)報(bào)道，血清visfatin水平與血清中IL-6和IL-1β及TNF-α的水平呈正相關(guān)，表明循環(huán)的visfatin可能影響了炎癥狀態(tài)[6，7]。Visfatin還被證明其可能對斑塊不穩(wěn)定化有所影響[8]。

有研究表明visfatin啟動(dòng)子多態(tài)性與急性炎癥損傷及慢性輕度炎癥反應(yīng)都有所關(guān)聯(lián)[9，10]。rs61330082單核苷酸多態(tài)性位于visfatin遠(yuǎn)端的啟動(dòng)子區(qū)域，包含了多個(gè)CAAT盒和TATA樣序列以及CCAAT/NF-1，NF-B，NF-IL-6，GR和AP-1的結(jié)合位點(diǎn)，并與visfatin基因表達(dá)和血清脂質(zhì)水平的調(diào)節(jié)相關(guān)[11～13]。在Ooi等的研究中，發(fā)現(xiàn)visfatin及其遺傳變異體的表達(dá)水平在兒童中與肥胖相關(guān)及不良心臟代謝的參數(shù)有關(guān)，如甘油三酯及嚴(yán)重的高血壓等，證明了visfatin在心血管代謝性疾病領(lǐng)域的重要作用[14]。接著他們的團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在分子水平體外實(shí)驗(yàn)中對上述結(jié)論進(jìn)行了補(bǔ)充研究，證明了在肥胖兒童中，在visfatin上游啟動(dòng)子區(qū)域的 rs11977021及 rs61330082的調(diào)節(jié)下，可提高體外轉(zhuǎn)錄的活性，進(jìn)而影響下游蛋白的水平及個(gè)體表型[15]。上述研究闡述了內(nèi)脂素visfatin及其遺傳變異體在血脂水平及炎癥通路中的調(diào)節(jié)作用，并暗示其表達(dá)水平及基因多態(tài)性可能與動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的易感性相關(guān)。據(jù)我們所知，目前尚未發(fā)表有關(guān)rs61330082多態(tài)性與IS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)系的研究，本篇文章旨在探索rs61330082多態(tài)性與缺血性卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本研究納入了年齡、性別相匹配的368例患者和381例健康對照。我們收集了從2011年9月至2012年9月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的患者，根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)檢查和影像學(xué)資料，將首次診斷為急性缺血性卒中的患者定義為符合納入條件的病例組。而短暫性缺血性發(fā)作，腦栓塞，腦外傷，腦血管畸形，凝血功能異常，自身免疫性疾病，腫瘤和慢性感染疾病的患者均被排除在外。另外，我們選擇了來自紅十字會(huì)醫(yī)院未見卒中及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體檢者作為對照組。所有受試者均來自生活在中國北方的漢族人群。兩家醫(yī)院的倫理委員會(huì)均批準(zhǔn)了本項(xiàng)研究，且所有參與者均簽署了書面知情同意書。病例組和對照組的臨床記錄，包括一般狀況(如性別，年齡，種族，吸煙和飲酒史)，既往史，家族史，血壓，空腹血糖，血清甘油三酸酯(TG)和總膽固醇(TC)。此外，患者還需要行頭部CT或MRI，超聲心動(dòng)圖，頸動(dòng)脈超聲，經(jīng)顱多普勒檢查和心電圖檢查。高脂血癥定義為血漿總膽固醇水平>5.72 mmol/L和(或)血漿甘油三酸酯水平> 1.7 mmol/L，或有降血脂藥物治療史。

1.2 DNA提取和基因分型 采用DNA純化試劑盒(Promega，Madison，USA)提取200 μL EDTA抗凝外周血的基因組DNA，并用分光光度法測量DNA純度，并將DNA樣品置于-80℃冰箱中保存。使用聚合酶鏈反應(yīng)-連接檢測反應(yīng)(PCR-LDR)方法對基因組DNA進(jìn)行基因分型。表1列出了用于PCR的引物序列。PCR擴(kuò)增體系的總體積為10 μl，包括1×GC-I緩沖液(Takara)，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U熱啟動(dòng)Taq聚合酶(Qiagen Inc)，1 μl基因組DNA和每個(gè)對應(yīng)的1 μl引物。循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72℃延伸90 s，共11個(gè)循環(huán)；在94 ℃下持續(xù)20 s，59 ℃下持續(xù)30 s，72 ℃下持續(xù)90 s，共24個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸2 min。LDR的探針在表1中列出。每個(gè)PCR產(chǎn)物的連接檢測反應(yīng)的體積為10 μl，其中包含1 μl 10×連接緩沖液，2 μl PCR產(chǎn)物，6 μl雙蒸餾水，0.4 μl每個(gè)區(qū)分探針和0.25 μl Taq DNA連接酶(New England Biolabs，USA)。LDR參數(shù)如下：94 ℃ 60 s，56 ℃ min，共38個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后，將5 μl LDR反應(yīng)產(chǎn)物與9 μl Hi-Di ROX(Applied Biosystems，USA)及0.5 μl的上樣緩沖液混合，然后在95 ℃下變性5 min。最后用ABI Prism 3730XL DNA測序儀(Applied Biosystems，USA)分析混合物。

表1 Primer sequences and the probes for LDR

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組和對照組的基本臨床特征見表2。年齡和性別在病例組和對照組分布無明顯差異，然而，病例組中患有高血壓、糖尿病及高脂血癥，以及吸煙者、飲酒者的個(gè)體比例顯著高于對照組。

表2 病例組與對照組臨床資料比較

表3和表4分別列出了病例組和對照組rs61330082的基因型和等位基因頻率。SNP rs61330082在病例組及對照組人群中的基因型的頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳定律，說明本研究納入的人群具有群體代表性。(病例組，P=0.630；對照組，P=0.139)。實(shí)驗(yàn)組中，AA，AG和GG基因型頻率分別為27.99%，48.64%和23.37%，其在對照組中依次為25.99%，46.19%和27.82%。與(AA+AG)相比，GG基因型的個(gè)體罹患卒中的風(fēng)險(xiǎn)并沒有增加，缺血性卒中的患者同對照組相比，其等位基因分布也沒有顯著差異(P=0.163)。而分別在男性及女性的卒中患者同對照組進(jìn)行性別特異性分析中，仍未見明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.159；P= 0.684)。

表4 男性及女性病例組與對照組rs61330082位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

我們使用Logistic回歸模型去計(jì)算visfatin基因型與缺血性卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性(見表5)。即使校正了其他可能的混雜因素，包括年齡，性別，吸煙，飲酒，高血壓，糖尿病，高脂血癥，仍未在病例組及對照組人群中觀察到顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(OR=1.378；95%CI=0.971～1.955；P=0.073)。

表5 rs61330082位點(diǎn)Logistic回歸結(jié)果

3 討 論

據(jù)我們所知，這是第一篇評估visfatin基因變異體與缺血性卒中發(fā)病之間相關(guān)性的研究。本研究中，我們未能在中國北方漢族人群中觀察到visfatin單核苷酸多態(tài)性rs61330082與缺血性卒中間發(fā)病存在顯著的相關(guān)性。此外，當(dāng)我們根據(jù)性別進(jìn)行亞組分析后，仍未觀察到visfatin SNP rs61330082與IS疾病之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Visfatin可能在斑塊不穩(wěn)定過程中發(fā)揮作用，而不穩(wěn)定斑塊是缺血性卒中的主要病因之一。Dahl發(fā)現(xiàn)visfatin是一種定位于不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中泡沫細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)的炎性介質(zhì)[8]。Visfatin能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的產(chǎn)生[16]，提示其在血管炎癥的病理過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。此外，Kim等[17]證明visfatin是一種血管炎性分子，可通過內(nèi)皮細(xì)胞中ROS依賴性NF-κB激活途徑來增加炎性因子CAM，ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。

Vander等指出[18]，visfatin可以有助于血管平滑肌細(xì)胞(SMC)穩(wěn)定、成熟表型的形成，并可以通過調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生物合成來增加平滑肌細(xì)胞生成血管的能力。Leander及其同事證明了在visfatin基因啟動(dòng)子區(qū)域中罕見的SNP rs1319501可能與45～60歲女性的首次罹患心肌梗死有關(guān)[19]。Wang等提出rs61330082多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈疾病患者血漿中炎癥標(biāo)志物水平降低有關(guān)[20]。在Yan等[21]研究中指出，rs61330082基因多態(tài)性與降低發(fā)生冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，尤其是在年輕，男性受試者和非吸煙者中。劉等[22]也有報(bào)道指出血漿visfatin水平與CAD顯著相關(guān)，并獨(dú)立于其他傳統(tǒng)的CAD危險(xiǎn)因素。Jin及其團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，血清visfatin的水平在實(shí)驗(yàn)組即冠狀動(dòng)脈鈣化患者中，明顯高于對照組，證明其與疾病的發(fā)展相關(guān)，對于其基因多態(tài)性rs61330082，其等位基因C(C>T)的頻率在中重度患者組中明顯高于對照組及輕度患者組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明T基因可能對冠脈鈣化的患者具有保護(hù)作用[23]。因此，我們假設(shè)rs61330082多態(tài)性可能與缺血性卒中的易感性相關(guān)。

在我們的研究中，病例組患糖尿病和高血壓以及吸煙者，飲酒者，高血脂個(gè)體明顯多于對照組，提示吸煙、糖尿病、高血壓、飲酒和高血脂為缺血性腦卒中發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素。rs61330082位點(diǎn)在共顯性、顯性、隱性和等位基因模型病例組與對照組之間無明顯差異，提示visfatin rs61330082多態(tài)性與缺血性卒中發(fā)病無關(guān)。此外，當(dāng)我們根據(jù)性別對患者進(jìn)行分層分析時(shí)，在男性及女性患者組我們?nèi)詻]有觀察到visfatin rs61330082多態(tài)性與IS疾病之間的關(guān)聯(lián)。

盡管我們先前的功能性研究證明了visfatin在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中的重要作用，并且早前的遺傳學(xué)研究支持visfatin多態(tài)性在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病中發(fā)揮作用，但我們目前的結(jié)果表明visfatin在缺血性卒中中并未起到顯著的作用。本研究在中國北方漢族人群中缺乏關(guān)聯(lián)的原因可能有以下幾種：(1)缺血性卒中是由不同實(shí)體組成的異質(zhì)性表型，因此CAD和缺血性卒中之間存在遺傳效應(yīng)的差異并不罕見。(2)我們的研究僅在中國北方漢族人群中進(jìn)行，他們在世界范圍內(nèi)擁有自己獨(dú)特的基因背景。(3)我們選擇的人群的樣本量太小，未來更大規(guī)模、多種族的研究可能會(huì)豐富我們的結(jié)果。(4)其他可能的原因可能由于種族、地域的差異，研究設(shè)計(jì)，檢測方法及選擇偏倚等。盡管當(dāng)前研究中提供的數(shù)據(jù)并不能夠表明visfatin rs61330082與IS相關(guān)，但在先前的研究中，大量呈現(xiàn)了其與動(dòng)脈粥樣硬化樣血管疾病及肥胖、血脂等指標(biāo)的相關(guān)性，因此我們不能完全排除visfatin及其他基因多態(tài)性對缺血性腦卒中疾病易感性的潛在影響，而應(yīng)該多方面考慮并謹(jǐn)慎解釋這一結(jié)果。

綜上，我們的實(shí)驗(yàn)證明了rs61330082單核苷酸多態(tài)性可能與中國北方漢族人群中缺血性卒中的易感性無關(guān)。但是，未來仍需要進(jìn)行更大范圍和種族人群多樣化的進(jìn)一步研究，以更好地了解rs61330082多態(tài)性與IS的關(guān)聯(lián)。