人尿激肽原酶通過調(diào)控NLRP3炎性小體對小鼠腦缺血/再灌注損傷的影響

韓 冬，溫璐璐，王 玨，高 巖，馮 娟

卒中是導(dǎo)致成年人死亡及長期殘疾的主要原因，其中缺血性卒中占絕大多數(shù)[1]。缺血性卒中是由血栓或栓塞阻塞大腦主要動脈造成的，導(dǎo)致局部血流阻斷隨后組織壞死。腦缺血再灌注損傷通常伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)元損傷，進一步造成神經(jīng)障礙和記憶障礙。人尿激肽原酶是自人尿液中提取得到的蛋白水解酶，是目前應(yīng)用于臨床治療腦梗死I類新藥，具有舒張血管，抑制血小板聚集等功能[2]。本論文主要研究人尿激肽原酶調(diào)控nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3(NLRP3)炎性小體改善小鼠腦缺血/再灌注損傷的作用及初步機制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料 雄性成年C57BL/6小鼠(22～25 g)，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0001。人尿激肽原酶(Human Urinary Kallindinogenase，UK)購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司(規(guī)格：0.15PNA單位/瓶，批號：311711021，商品名：尤瑞克林)。小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real time PCR擴增試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；NLRP3、ASC抗體購自愛博泰克生物科技有限公司；Casepase-1抗體購自abcam公司。

1.2 動物分組及給藥 雄性C57/BL6小鼠60只，于造模前隨機分為4組，分別為假手術(shù)組(Sham)，模型組(MCAO/R)，人尿激肽原酶高劑量組(UK-H，35×10-3PNAU/kg)、人尿激肽原酶低劑量組(UK-L，17.5×10-3PNAU/kg)。各組分別于復(fù)灌后0.5 h靜脈給藥，給藥容積0.1 ml/10 g，假手術(shù)組與模型組分別靜脈給予生理鹽水溶液。

1.3 模型制備 線栓法制備小鼠大腦中動脈閉塞再灌注(MCAO/R)模型[3]：將小鼠用2%水合氯醛腹腔注射(i. p)麻醉后，解剖分離暴露頸部血管，于頸外動脈主干剪一小口，將硅膠直徑為(0.22±0.01)mm的特制線栓由剪口向頸內(nèi)動脈入顱方向慢慢插入，至頸總動脈分支約10 mm左右時稍有阻力，阻斷了大腦中動脈的血流供應(yīng)。1 h后，拔出線栓，完成復(fù)灌。假手術(shù)組的小鼠麻醉后，如其他組一般分離暴露血管，但不使用線栓堵塞大腦中動脈。

1.4 神經(jīng)行為學評分及腦梗死面積測定 小鼠于MCAO/R后24 h，按Bederson報道方法[4]對動物的神經(jīng)功能缺陷進行分級評分。脫頸處死后取出全腦，做冠狀切片，每片厚度為2 mm。1%TTC染色，數(shù)碼相機拍照，ImageJ軟件進行分析，計算梗死面積如下：梗死面積(%)=(缺血對側(cè)面積-缺血側(cè)正常面積)/缺血對側(cè)面積×100%

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測缺血腦組織和血清中炎癥因子釋放 小鼠于MCAO/R后24 h，摘眼球取血，室溫血液自然凝固20 min，4℃ 2500 r/min離心20 min，取上清。脫頸處死后取腦，分離缺血側(cè)半腦，按質(zhì)量體積比1∶10的量加入預(yù)冷PBS，冰上勻漿，4 ℃ 2500 r/min離心20 min，取上清。根據(jù)不同ELISA試劑盒的說明書進行操作，分別檢測血清和腦組織中的IL-1β、IL-18。

1.6 Real Time PCR、Western blot法檢測NLRP3炎癥小體mRNA及蛋白表達 小鼠于MCAO/R后24 h，脫頸處死后取腦，分離缺血側(cè)半腦。Real time PCR：Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄參照試劑盒說明書操作，然后進行實時定量PCR實驗。引物序列如下：NLRP3 forward：ATGCTGCTTCGACATCTCCT，reverse：AACCAATGCGAGATCCTGAC；ASC forward：GAAGCTGCTGACAGTGCAAC，reverse：GCCACAGCTCCAGACTCTTC；caspase-1 forward：AGATGGCACATTTCCAGGAC，reverse：GATCCTCCAGCAGCAACTTC；β-actin forward：AGAGGGAAATCGTGCGTGAC，reverse：CAATAGTGATGACCTGGCCGT。以β-actin作為內(nèi)參基因，2-△△CT計算目的基因相對表達量。

Western blot：收集腦組織勻漿，RIPA裂解細胞，BCA法測定蛋白含量，煮沸變性，-80 ℃保存。凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉-TBST溶液封閉非特異性蛋白，加一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育90 min，ECL發(fā)光液顯色，曝光成像，ImageJ軟件分析照片。

2 結(jié) 果

2.1 尤瑞克林降低腦缺血再灌注小鼠腦梗死面積 由圖1可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的腦梗死率顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，人尿激肽原酶高、低劑量組均能極顯著降低MCAO/R后小鼠腦梗死面積(P<0.01)。

(A) TTC染色各組代表圖片 ；(B) 腦梗死面積柱狀圖；與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

2.2 人尿激肽原酶改善腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)行為學損傷 由圖2可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠神經(jīng)行為學評分極顯著性升高(P<0.01)。與模型對照組比較，人尿激肽原酶高劑量組能極顯著降低MCAO/R后小鼠神經(jīng)行為學評分(P<0.01)。

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

2.3 人尿激肽原酶抑制腦缺血再灌注小鼠血清和腦組織中IL-1β和IL-18表達 由圖3可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清和腦組織中IL-1β和IL-18含量極顯著性升高(P<0.01)。與模型組比較，人尿激肽原酶高、低劑量組均能不同程度降低小鼠血清中和腦組織中IL-1β含量(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，人尿激肽原酶高劑量組能顯著降低小鼠血清中和腦組織中IL-18含量(P<0.05)。

2.4 人尿激肽原酶下調(diào)腦缺血再灌注小鼠腦組織NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達 由圖4可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA含量顯著性升高(P<0.05)。與模型組比較，人尿激肽原酶高、低劑量組均能顯著降低小鼠腦組織中NLRP3和ASC mRNA含量(P<0.05)；與模型組比較，人尿激肽原酶高劑量組能顯著降低小鼠腦組織中caspase-1 mRNA含量(P<0.05)。

2.5 人尿激肽原酶抑制缺血再灌注小鼠腦組織NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達 由圖5可見，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平不同程度升高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，人尿激肽原酶高劑量組能極顯著降低小鼠腦組織中NLRP3蛋白表達水平(P<0.01)；與模型組比較，人尿激肽原酶高劑量組能顯著降低小鼠腦組織中ASC和caspase-1蛋白表達水平(P<0.05)。

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

與假手術(shù)組比較#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

人尿激肽原酶能夠促進激肽原中具有血管活性激肽的釋放，選擇性擴張腦組織小動脈，增加缺血腦組織的血流量[5]，改善神經(jīng)功能缺失。目前已證實缺血性卒中患者應(yīng)用人尿激肽原酶的臨床療效[6]，改善缺血腦組織血流灌注[7]。本文主要研究其對小鼠腦缺血/再灌注損傷的治療作用及其可能機制。實驗結(jié)果表明，人尿激肽原酶治療給藥可顯著減輕小鼠腦缺血/再灌注損傷后的梗死面積及其神經(jīng)行為學評分，顯示了較好的抗腦缺血作用。

腦缺血再灌注后，缺血腦組織內(nèi)有大量炎癥因子產(chǎn)生，以及炎癥細胞的激活、浸潤，繼而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)加重腦組織損傷，使腦組織由缺血性損傷轉(zhuǎn)向炎癥性損傷，炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷中起重要作用[8，9]。而炎癥小體是炎癥免疫反應(yīng)的核心，目前研究最多的是NLRP3炎癥小體。NLRP3炎性小體是屬于NLRs家族中重要成員之一的細胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白復(fù)合體，可以識別多種病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)。在受到刺激后可發(fā)生寡聚化反應(yīng)，N-末端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域用于募集ASC以活化caspase-1前體，進而可水解切割pro-IL-1β、pro-IL-18為成熟形式的IL-1β、IL-18，釋放到細胞外參與局部或全身炎癥反應(yīng)[10]。實驗動物及人缺血腦組織當中NLRP3小體蛋白以及IL-1β、IL-18表達量均升高[11]，而給予NLRP3拮抗劑能夠起到神經(jīng)保護作用[12]。因此，NLRP3是治療腦缺血/再灌注損傷藥物研究的重要靶點。本實驗研究結(jié)果表明，小鼠腦缺血/再灌注損傷后，NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA及蛋白表達明顯上調(diào)，進一步介導(dǎo)血清及腦組織中IL-1β、IL-18表達增加，加劇腦缺血后炎癥反應(yīng)。人尿激肽原酶治療給藥可顯著抑制IL-1β、IL-18表達，下調(diào)NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA及蛋白表達。有文獻報道，人尿激肽原酶在缺血性腦損傷中具有抗炎作用[13，14]，但是人尿激肽原酶通過干預(yù)NLPR3炎癥小體來抑制炎癥反應(yīng)尚未見報道。

因此，人尿激肽原酶可能通過抑制小鼠腦缺血/再灌注后NLRP3炎性小體表達，進而抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦缺血損傷。在以后的工作中，我們還將繼續(xù)通過體外細胞實驗、NLRP3敲除小鼠及應(yīng)用NLRP3特異性拮抗劑等方法進一步研究人尿激肽原酶抗腦缺血損傷的靶細胞及其分子機制。