基于免疫組化法研究MMP-2、MMP-14與頸動脈粥樣斑塊易損性的相關性

郭周穎，張淑琴，秦顥誠，于 明，李洪娥

動脈粥樣硬化是缺血性卒中發(fā)生發(fā)展的重要病理和臨床基礎[1，2]，其中易損斑塊的形成以及隨之形成的血栓是腦血管疾病致殘、致死的重要原因，易損斑塊主要以薄的纖維帽和富含脂質(zhì)壞死核心、斑塊內(nèi)出血、活動性炎癥及鈣化為特征[3]，具有偏心性分布、不規(guī)則表面、糜爛、潰瘍等特征。研究表明約有2/3的腦血管事件是由易損斑塊的破裂造成的[4]。因此，研究易損斑塊的形成機制對缺血性卒中的防治尤為重要。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)又稱明膠酶A，它表達廣泛，能夠降解明膠、膠原和多種基底膜成分，對于平滑肌細胞的增殖和遷移起著重要作用。這些作用可能促進了動脈粥樣硬化的形成和進展[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14，MMP-14)是膜型基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，它廣泛存在于基底膜并能降解膠原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和活化MMP-2[6]。相關研究表明MMP-14在巨噬細胞豐富的動脈粥樣硬化斑塊中表達豐富[7]。

鑒此，本研究在獲取頸動脈內(nèi)膜剝脫術(CEA)術后頸動脈斑塊組織后，依據(jù)患者術前相關影像學檢查及斑塊組織形態(tài)學表現(xiàn)，將頸動脈粥樣斑塊分為穩(wěn)定斑塊組與易損斑塊組，運用HE染色及免疫組織化學技術對兩組斑塊中的MMP-2及MMP-14的表達進行分析，探究相關MMP-2和MMP-14影響易損斑塊發(fā)生、發(fā)展的可能機制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 研究對象為2018年1月-2019年6月在連云港市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科行CEA的患者55例，其中男50例，女5例。平均年齡(67±6.9)歲。根據(jù)術前基于頸部血管超聲(carotid doppler ultrasonography，CDU)的多模式影像學檢查、術后斑塊HE染色特征將斑塊組織分為穩(wěn)定斑塊組23例，易損斑塊組32例。

CEA納入標準：根據(jù)北美癥狀性頸動脈內(nèi)膜切除試驗(NASCET)標準[8]，(1)中度狹窄(狹窄程度大于50%)且有癥狀患者；(2)重度狹窄(狹窄程度70%～99%)但無癥狀患者。

CEA排除標準：出血性腦血管疾病、風濕性心臟病、房顫等引起的頸動脈狹窄；放射性頸動脈狹窄，病變位置超過第二頸椎；嚴重肝腎功能不良無法耐受手術等患者。

斑塊組織收集后進行石蠟包埋，以便后續(xù)病理學免疫組化檢測。研究對象術前均簽署知情同意書。

1.1.2 分組標準 CDU評估易損斑塊標準：斑塊內(nèi)部存在大片低回聲、伴或不伴有斑塊形態(tài)不規(guī)則或纖維帽不完整、斑塊內(nèi)見血流信號(潰瘍型斑塊)、斑塊內(nèi)出血。CDU評估穩(wěn)定斑塊標準：斑塊呈中等均質(zhì)回聲，斑塊形態(tài)規(guī)則、纖維帽完整或斑塊呈均質(zhì)中等回聲或強回聲。

病理學評估易損斑塊標準[9]：主要標準(1)活動性炎癥(單核細胞或巨噬細胞有時伴T淋巴細胞浸潤)；(2)薄纖維帽(厚度<65 μm)伴大的脂質(zhì)核心(脂質(zhì)成分>40%)；(3)血管內(nèi)皮細胞脫落伴表面有血小板聚集；(4)存在裂隙或受損傷的斑塊；(5)血管嚴重狹窄>90%。次要標準：(1)斑塊表面結節(jié)性鈣化，(2)內(nèi)鏡下黃色反光；(3)斑塊內(nèi)出血及新生血管形成；(4)內(nèi)皮細胞功能障礙；(5)血管擴張性(正性)重構。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 CEA術后斑塊進行多節(jié)段切面觀察粥樣斑塊形態(tài)學表現(xiàn)，然后用4%多聚甲醛溶液固定，脫鈣、脫水后石蠟包埋，以5 μm層厚進行組織切片HE染色，觀察斑塊纖維帽、脂質(zhì)壞死核心、出血、鈣化等。

2.4 兩組AECOPD患者肺功能檢查結果 兩組AECOPD 患 者 肺 功 能 比 較 ，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC、FEV1%均有統(tǒng)計學差異，患者病情與FEV1/FVC、FEV1%呈負相關，見表4。

1.2.2 免疫組化 免疫組化檢測穩(wěn)定及易損斑塊組織中MMP-2及MMP-14蛋白的表達。斑塊組織先放入10%福爾馬林溶液中，然后石蠟包埋，以5 μm層厚連續(xù)切片。(1)切片脫蠟水化：將切片置于二甲苯溶液中浸泡5 min，取出后置于100%無水乙醇溶液中浸泡3 min，然后依次浸入70%～90%的各級酒精中3 min，最好用PBS溶液沖洗切片3次，每次3 min；(2)參照一抗說明書進行抗原修復；(3)配制DAB工作液：按每毫升B液(DAB稀釋液)加入1滴C液(DAB原液)的比例配制工作液，避光保存；(4)實驗步驟：①抗原修復后待切片自然冷卻，用PBS溶液沖洗切片三次，每次3 min；②將擦拭干凈的切片置于濕盒中，滴入3%的過氧化氫進行阻斷，然后避光孵育10 min后，用PBS溶液沖洗切片三次，每次3 min，最后將切片擦拭干凈；③滴加100 μL一抗工作液于切片中，孵育60 min后，用PBS溶液沖洗切片3次，每次3 min，并將切片擦拭干凈；④滴加100 μL A工作液，孵育30 min，并用PBS溶液沖洗切3次，每次3 min，將切片擦拭干凈；⑤加入準備好的DAB工作液100 L，孵育切片10 min后，用蒸餾水沖洗，在光鏡下控制顯色效果，必要時用蘇木精復染；⑥用各級酒精(70%～100%)脫水、每級3 min，然后置于二甲苯中，最后封片觀察。

2 結 果

2.1 患者相關危險因素統(tǒng)計 納入分析患者的年齡、性別、一過性黑蒙、短暫性腦缺血發(fā)作、卒中史、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙史、他汀類藥物服用史、血管狹窄率等臨床數(shù)據(jù)(見表1)。表中顯示，易損斑塊的發(fā)生與性別具有相關性，男性相較于女性更容易發(fā)展成易損斑塊。同時具有易損斑塊的患者相較于具有穩(wěn)定斑塊的患者更容易發(fā)生TIA。其他臨床特征和危險因素在兩組斑塊中的差異沒有統(tǒng)計學意義。

表1 患者一般情況及相關危險因素分析

相關檢驗指標的診斷標準如下：高血壓(收縮壓≥160 mmHg)；高脂血癥(總膽固醇≥220 mg/dl)；糖尿病(空腹血糖≥126 mg/dl)；吸煙史(≥15 y)。

2.2 穩(wěn)定斑塊及易損斑塊的CDU和病理學特征 穩(wěn)定斑塊的CDU及HE染色特征(見圖1)；易損斑塊的CDU及HE染色特征(見圖2)。放大的易損斑塊的局部組織學特征(見圖3)。

圖3 易損斑塊的組織學特征 A：可見易損斑塊薄的纖維帽(FC)及較大脂質(zhì)核心(LC)；B：可見易損斑塊內(nèi)豐富的新生血管(NV)

圖2 A：易損斑塊超聲表現(xiàn)為斑塊形態(tài)不規(guī)則，纖維帽不完整，斑塊內(nèi)可見血流信號(藍色箭頭所示)，呈混合不均質(zhì)回聲。B：易損斑塊病理(HE×10)：斑塊纖維帽破裂不連續(xù)、其內(nèi)可見血栓、新生血管、脂質(zhì)核心及較多炎性細胞

圖1 A：穩(wěn)定斑塊超聲表現(xiàn)為斑塊表面光滑，纖維帽完整；B：穩(wěn)定斑塊病理(HE×10)：斑塊纖維帽完整連續(xù)、表面光滑，其內(nèi)纖維成分居多

表2 MMP-2在穩(wěn)定和易損斑塊組中染色程度的統(tǒng)計分析

表3 MMP-14在穩(wěn)定和易損斑塊組中染色程度的統(tǒng)計分析

圖4 MMP-2，MMP-14在穩(wěn)定斑塊組及易損斑塊組的免疫組化結果比較(圖中箭頭表示染色集聚區(qū)域)

3 討 論

動脈粥樣硬化是腦卒中發(fā)生發(fā)展的重要病理和臨床基礎，研究表明，頸動脈粥樣斑塊尤其是易損斑塊與缺血性卒中密切相關[10]。我們研究并收集CEA術后的頸動脈斑塊組織，根據(jù)患者術前相關影像學表現(xiàn)及病理特征分為穩(wěn)定斑塊組、易損斑塊組，穩(wěn)定斑塊一般具備脂核小、纖維帽厚、炎癥反應輕等特點，不易形成急性缺血事件；易損斑塊具有纖維帽薄，脂質(zhì)核心大及炎癥細胞豐富的特點，易損斑塊破裂的概率高，因此形成血栓栓塞的危險性也高[11，12]。

越來越多的證據(jù)表明MMPs是降解細胞外基質(zhì)(ECM)導致斑塊破裂的重要影響因子[13]。依據(jù)他們的結構和底物特異性，MMPs分為5類：(1)間質(zhì)膠原酶：MMP-1、8、13、18，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原纖維；(2)明膠酶：MMP-2、MMP-9，主要降解彈性蛋白酶及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原纖維；(3)間質(zhì)溶解素：MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-12，可降解大多數(shù)ECM 的主要成分，包括蛋白多糖、層粘連蛋白等；(4)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-MMP-17、MMP-24、MMP-25，能夠直接降解多種ECM 成分并激活其它MMPs，由于其分布在細胞膜表面，所以被認為在細胞遷移中發(fā)揮著重要作用；(5)其他MMPs[14]。

本研究通過免疫組織化學方法對兩組斑塊組織中的相關因子進行定位分析。我們對斑塊進行連續(xù)組織切片研究MMP-2，MMP-14蛋白在穩(wěn)定和易損斑塊組中的分布。結果顯示：兩組頸動脈斑塊在不同強度下均被MMP-2和MMP-14染色。與穩(wěn)定的斑塊相比，其在易損斑塊組中的染色更明顯更強烈，且在潰瘍型斑塊，斑塊纖維帽破裂等處分布水平較高，而巨噬細胞和泡沫細胞主要分布在斑塊破裂的部位。以上結果均表明：MMP-2、MMP-14的過表達可能參與了斑塊的進展與破裂過程。

MMP-2是明膠酶的一種，其可由中性粒細胞、單核巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等細胞合成并以無活性的酶原形式分泌，MMP-2在體內(nèi)通過纖溶酶等酶的水解而活化，其作用底物包括Ⅳ型膠原纖維等，這些膠原纖維是粥樣斑塊基底膜和纖維帽的重要組成部分。已有研究證實，MMP-2的過度表達在血管重構中發(fā)揮重要作用。MMP-2通過降解細胞外基質(zhì)成分、增大內(nèi)膜面積及細胞核密度等方式，為斑塊的發(fā)展提供必要空間，當這種過程持續(xù)發(fā)展無法阻止時，可誘發(fā)斑塊破裂[15]。已有研究表明，MMP-2在動脈粥樣斑塊以及基底部的血管內(nèi)中膜、粥樣硬化破裂處的平滑肌細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞集聚處顯著表達[16]。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在易損斑塊組的表達要顯著高于穩(wěn)定斑塊組，且在易損斑塊的破裂區(qū)域表達豐富，這同時也是巨噬細胞和泡沫細胞等炎性細胞集聚的部位。以上現(xiàn)象表明斑塊內(nèi)MMP-2的過度表達與斑塊的穩(wěn)定性存在明顯的相關性，MMP-2是形成不穩(wěn)定性斑塊的一個重要促進因素。

最近研究表明，MMP-14通過調(diào)節(jié)ECM環(huán)境，在血管損害、血管壁的細胞遷移、內(nèi)皮細胞生長、新生血管生成的過程中發(fā)揮著重要作用。對小鼠的骨髓移植研究證明巨噬細胞來源的MMP-14在斑塊的穩(wěn)定機制中發(fā)揮著至關重要的作用。同時作為一種膜型金屬基質(zhì)蛋白酶，MMP-14的表達水平同時影響MMP-2的活化與表達[17]。通過免疫組化結果可以發(fā)現(xiàn)MMP-14的分布區(qū)域與MMP-2是一致的，但MMP-14在斑塊的分布則主要粘附于巨噬細胞表面，這也說明了MMP-14作為MMP-2的膜活化分子，對MMP-2在斑塊內(nèi)的表達起著信號傳遞的作用?？傊?，MMP-14不僅作為蛋白酶而且是一種信號分子影響著細胞的病理生理功能[18]。

綜上所述，MMP-2和MMP-14在頸動脈粥樣斑塊中的表達水平與頸動脈易損斑塊存在顯著相關性，是影響斑塊穩(wěn)定性的重要因子。本實驗研究只進行了體內(nèi)斑塊的表達研究，缺乏對斑塊進展的動態(tài)研究，具有一定的局限性。未來可在體外進行相應的細胞水平及動物模型研究，以便更加深入地進行相關因子的干擾調(diào)控或者信號通路的研究，從而為預測及治療易損斑塊尋找更為有效的方法。