質(zhì)子泵抑制劑抑制糖酵解和谷氨酰胺代謝影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡機(jī)制的研究*

王卓婷 鄒曉平 陳 敏 沈永華 黃淑玲 顧正宇

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

背景：已有研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)子泵抑制劑(PPI)可抑制空泡型質(zhì)子泵(V-ATPases)表達(dá)、影響胃癌細(xì)胞糖酵解水平。V-ATPases對(duì)腫瘤惡性生物學(xué)行為具有重要意義。目的：探討PPI通過抑制糖酵解和谷氨酰胺代謝作用于胃癌的機(jī)制。方法：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分，對(duì)胃癌細(xì)胞株進(jìn)行PPI加藥處理并沉默相關(guān)分子，以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)mRNA和蛋白表達(dá)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，將裸鼠分為空白對(duì)照組、0.9% NaCl溶液灌胃組、泮托拉唑鈉溶液灌胃組、PKM2干擾組，觀察小鼠體質(zhì)量、攝食行為、腫瘤大小以及腫瘤組織內(nèi)相關(guān)通路分子表達(dá)情況。結(jié)果：PPI可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；PPI可抑制胃癌細(xì)胞糖酵解和谷氨酰胺代謝相關(guān)分子表達(dá)；干擾PKM2或PI3K均可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；沉默V-ATPases可抑制胃癌細(xì)胞糖酵解和谷氨酰胺代謝相關(guān)分子表達(dá)。PPI灌胃治療荷瘤小鼠可延緩腫瘤生長(zhǎng)、緩解小鼠惡病質(zhì)情況。結(jié)論：PPI可抑制V-ATPases和PI3K信號(hào)通路表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞糖酵解和谷氨酰胺代謝水平，影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡水平，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

低氧環(huán)境中腫瘤細(xì)胞依然進(jìn)行糖酵解，消耗葡萄糖，并產(chǎn)生大量乳酸[1]，這些特性被認(rèn)為與腫瘤強(qiáng)大的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)[2]。在酸性環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞仍能保持中性胞內(nèi)環(huán)境，可能與空泡型質(zhì)子泵(V-ATPases)有關(guān)[3]，其由V1和V0兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，V1起酶催化作用，可水解ATP；而V0可轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子，從而降低胞內(nèi)由于糖酵解而產(chǎn)生的高酸水平。胞外pH值酸化可活化胞內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路，活化mTOR，上調(diào)HIF-1α，進(jìn)而促進(jìn)PKM2表達(dá)使糖酵解水平增加。有研究表明，V-ATPases可調(diào)控細(xì)胞中AMPK和mTORC1的激活，同時(shí)參與氨基酸代謝調(diào)控，對(duì)腫瘤細(xì)胞存活、生長(zhǎng)具有極為重要的作用[4]。近年質(zhì)子泵抑制劑(PPI)被用于腫瘤治療的研究中，其抗腫瘤作用可能與抑制V-ATPases相關(guān)[5]。此外，有研究指出PPI可影響腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解[6]，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、自噬水平以及侵襲轉(zhuǎn)移能力[7-11]。隨著靶向糖酵解相關(guān)分子在腫瘤治療研究中地不斷深入，有研究指出單純靶向糖酵解相關(guān)分子并不能達(dá)到理想的抗腫瘤效果，或與代謝回補(bǔ)通路的產(chǎn)生有關(guān)[12-13]。本研究通過以PPI處理胃癌細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡以及相關(guān)蛋白表達(dá)情況，旨在探究PPI是否通過抑制胃癌細(xì)胞糖酵解和谷氨酰胺代謝影響胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及其作用機(jī)制，為胃癌治療研究提供新思路。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

不同分化程度的人胃癌細(xì)胞株SGC7901、BGC823、HGC27和MGC803均由南京鼓樓醫(yī)院消化科凍存。艾司奧美拉唑(阿斯利康制藥有限公司)，注射用泮托拉唑鈉(德國(guó)Nycomed GmbH)。CRISPR CAS9雙載體慢病毒購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)公司，其中LV-EGFP-gRNA的序列(5’--3’)為GGA GAT CCT GTA CTT CGC AC+AGC AGA CAC GTT TAC TCC TC-119。AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)PI3K抗體(Abcam)，PKM2抗體、p-Akt抗體(CST)，HIF-1α抗體(Abcam),β-actin抗體(Bioworld Technology)，ATP6V1A抗體(Abcam)，SLC1A5抗體(Proteintech Group)，p-mTOR抗體(CST)，GLS抗體(Proteintech Group)，GLUT-1抗體(CST)，LDHA抗體(Bioworld Technology)；PKM2 siRNA(南京銳真生物技術(shù)有限公司)，V-ATPases shRNA(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)，BALB/c雄性裸鼠(南京醫(yī)科大學(xué))；CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)，凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù))。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS+1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.加藥：部分細(xì)胞消化、傳代，另一部分吹打混勻后接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁，加入現(xiàn)配的不同濃度的PPI溶液。同時(shí)以鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，酸性環(huán)境pH值為6.5，中性環(huán)境pH值為7.5。

3.siRNA轉(zhuǎn)染：按照說明書，配制轉(zhuǎn)染體系，即400 μL OPTI MEM+5 μL siRNA+5 μL轉(zhuǎn)染試劑。消化細(xì)胞，用不含雙抗的完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后稀釋至18.75萬/mL(保證每孔30萬細(xì)胞)，每孔取1.6 mL細(xì)胞懸液+410 μL轉(zhuǎn)染體系。視細(xì)胞狀態(tài)，12～24 h后換液。

4.熒光定量PCR(qPCR)法：提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR引物見表1，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。反應(yīng)體積20 μL，內(nèi)含10 μL SYBR、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、7.2 μL DD水、2 μL cDNA模板。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s，60 ℃32～34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因mRNA表達(dá)水平。

表1 各目的基因的PCR引物序列

5.蛋白質(zhì)印跡法：收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，按照BCA試劑說明書進(jìn)行蛋白定量。行電泳后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉2 h，加入稀釋后的一抗溶液(按各抗體說明書推薦濃度稀釋)過夜，洗滌后加入二抗，曝光，顯影，攝片。

6.免疫熒光：各組細(xì)胞接種后孵育36～48 h，置于多聚甲醛中固定10 min，0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗滌，血清封閉30 min，PBS洗滌，加入一抗4 ℃過夜，室溫避光孵二抗2 h，DAPI染核，拍攝熒光照片。

7.雙載體慢病毒轉(zhuǎn)染和單克隆挑?。焊鶕?jù)預(yù)染結(jié)果，MGC803細(xì)胞鋪于6孔板，每孔6萬細(xì)胞。ATP6V1A敲除慢病毒稀釋為45 μL原液+405 μL完全培養(yǎng)基，CAS9慢病毒稀釋為180 μL原液+720 μL完全培養(yǎng)基，空載體組病毒稀釋為5 μL原液+445 μL完全培養(yǎng)基，按照1 600 μL完全培養(yǎng)基+200 μL ATP6V1A敲除/空載體病毒+200 μL CAS9病毒+2 μL poly轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置不處理組作為對(duì)照。嘌呤霉素篩選至熒光強(qiáng)度達(dá)70%～80%時(shí)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光分選，分選后的細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后稀釋至1個(gè)/100 μL，接種于96孔板，14～28 d后觀察熒光強(qiáng)度和生長(zhǎng)情況，轉(zhuǎn)入6孔板繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)qPCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果判斷是否成功敲除基因，選取敲除成功的細(xì)胞凍存。

8.CCK-8實(shí)驗(yàn)：將各組細(xì)胞接種于96孔板，每孔3 000～5 000個(gè)細(xì)胞，每組至少5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48 h后，加入10% CCK-8試劑，上酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖情況。

9.細(xì)胞凋亡情況：按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書處理細(xì)胞，加入熒光液，遮光反應(yīng)5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

10.葡萄糖攝取率、LDH活性和乳酸測(cè)定：使用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)LDH活性，采用比色法檢測(cè)葡萄糖、乳酸水平，具體步驟按說明書步驟操作。

11.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將中分化的人胃癌細(xì)胞株SGC7901接種于BALB/c雄性裸鼠背部皮下，1～2周成瘤成功。將小鼠分為泮托拉唑鈉溶液灌胃組、0.9% NaCl溶液灌胃組、PKM2干擾組(使用慢病毒干擾PKM2表達(dá)的胃癌細(xì)胞成瘤)、陰性對(duì)照組(使用空白慢病毒轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞成瘤)、空白對(duì)照組(正常成瘤，不作處理)。5周后處死小鼠，剝離腫瘤，行后續(xù)研究。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PPI可抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

以不同濃度的艾司奧美拉唑處理SGC7901細(xì)胞24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，10 μg/mL組細(xì)胞增殖率略有上升，20 μg/mL組細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)，而后隨著艾司奧美拉唑濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖1A)。流式細(xì)胞術(shù)顯示不同濃度的艾司奧美拉唑可誘導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡(圖1D)。

A-C：不同細(xì)胞增殖情況(CCK-8法)；D-F：不同細(xì)胞凋亡情況(流式細(xì)胞術(shù))圖1 PPI可抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

同時(shí)，在酸性環(huán)境中，較低濃度(20 μg/mL)組短時(shí)間內(nèi)HGC27細(xì)胞增殖水平略有上升，可能是藥物刺激性地一過性上升，而當(dāng)藥物作用加強(qiáng)(濃度升高或作用時(shí)間增加)，細(xì)胞增殖水平開始逐漸下降；在中性環(huán)境中，隨著藥物濃度增加，HGC27細(xì)胞增殖水平下降(P<0.05;圖1B)。此外，酸性環(huán)境中泮托拉唑鈉可顯著抑制MGC803細(xì)胞增殖(P<0.05)；而在中性環(huán)境中，泮托拉唑鈉總體可下調(diào)MGC803細(xì)胞增殖水平，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。在酸性和中性環(huán)境中，高濃度泮托拉唑鈉(100 μg/mL)可明顯促進(jìn)胃癌HGC27細(xì)胞凋亡(P<0.05;圖1E)，而泮托拉唑鈉在較低濃度時(shí)即可誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡(P<0.05；圖1F)?？傮w而言，PPI可抑制胃癌細(xì)胞增殖能力，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞早期凋亡，酸性環(huán)境或可增強(qiáng)PPI這一作用。

二、PPI可影響胃癌細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、HIF-1α和PKM2表達(dá)

qPCR法顯示，在酸性環(huán)境中，20 μg/mL艾司奧美拉唑即可抑制SGC7901細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt、mTOR、HIF-1α和PKM2 mRNA表達(dá)(P<0.05)，且呈濃度依賴性(圖2A)；而艾司奧美拉唑濃度為40 μg/mL時(shí)，上述指標(biāo)的蛋白表達(dá)受到明顯抑制，呈濃度依賴性(圖2B)。免疫熒光法結(jié)果顯示艾司奧美拉唑(40 μg/mL)可使胃癌SGC7901細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt、mTOR、HIF-1α和PKM2表達(dá)減少(圖2C)。

A：mRNA表達(dá)(qPCR法)；B：蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；C：蛋白表達(dá)(免疫熒光法，×200)圖2 PPI可影響胃癌SGC7901細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR、HIF-1α和PKM2的表達(dá)

三、PI3K特異性抑制劑LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

以不同濃度的LY294002處理胃癌HGC27、MGC803細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且均呈濃度依賴性(P<0.05；圖3)。

A-B：細(xì)胞增殖(CCK-8法)；C-D：細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù))圖3 PI3K特異性抑制劑LY294002對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

四、PI3K特異性抑制劑LY294002對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及其下游HIF-1α和PKM2蛋白表達(dá)的影響

與未處理組和DMSO對(duì)照組相比，10 μmol/L LY294002可明顯抑制BGC823細(xì)胞內(nèi)Akt、mTOR蛋白表達(dá)(P<0.05)；20 μmol/L組HIF-1α表達(dá)受到明顯抑制(P<0.05)；50 μmol/L組可顯著抑制PKM2表達(dá)(P<0.05)；抑制作用均呈濃度依賴性(P<0.05；圖4)。表明LY294002在低濃度時(shí)就能抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號(hào)通路活化，但較高濃度時(shí)才能對(duì)PKM2產(chǎn)生抑制作用。

圖4 不同濃度LY294002對(duì)BGC823細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及其下游HIF-1α和PKM2蛋白表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

五、敲減PKM2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞糖酵解，影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡

以siRNA轉(zhuǎn)染胃癌HGC27、MGC803細(xì)胞后，PKM2蛋白表達(dá)明顯降低(圖5A)。與對(duì)照組相比，PKM2 siRNA轉(zhuǎn)染組可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖能力(圖5B)，且細(xì)胞早期凋亡水平明顯升高(圖5C)。

蛋白質(zhì)印跡法顯示，PKM2 siRNA組GLUT-1、LDHA蛋白表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組和空載體組明顯降低，細(xì)胞葡萄糖攝取率、乳酸產(chǎn)量、LDH活性明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖5D-5G)。

A：PKM2蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；B：細(xì)胞增殖情況(CCK-8法)；C：細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù))；D：GLUT-1、LDHA蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；E：葡萄糖相對(duì)攝取率；F：乳酸相對(duì)產(chǎn)量；G：LDH相對(duì)活性圖5 敲減PKM2表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞糖酵解，影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡水平

六、PPI通過V-ATPases表達(dá)影響胃癌細(xì)胞谷氨酰胺代謝

在酸性環(huán)境中，泮托拉唑鈉可明顯下調(diào)胃癌HGC27、MGC803細(xì)胞中V-ATPases、SLC1A5表達(dá)，且這種抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)(圖6A)。然而，在中性環(huán)境中，泮托拉唑鈉不能發(fā)揮此抑制作用(圖6B)。在酸性環(huán)境中，較低濃度的PPI(25 μg/mL)可抑制MGC803細(xì)胞中GLS表達(dá)，且呈濃度依賴性(圖6C)。

以ATP6V1A敲除的CRISPR CAS9雙載體慢病毒轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞后，GLS和SLC1A5表達(dá)均下調(diào)(圖6D)，細(xì)胞增殖受到輕度抑制(圖6E)，細(xì)胞凋亡無明顯變化(圖6F)。

A：酸性環(huán)境中V-ATPases、SLC1A5表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；B：中性環(huán)境中V-ATPases、SLC1A5表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；C：酸性環(huán)境中GLS表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)；D：敲除ATP6V1A對(duì)SLC1A5、GLS蛋白表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)；E：敲除ATP6V1A對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響(CCK-8法)；F：敲除ATP6V1A對(duì)MGC803細(xì)胞凋亡的影響(流式細(xì)胞術(shù))圖6 PPI通過V-ATPases表達(dá)影響胃癌細(xì)胞谷氨酰胺代謝

七、PI3K信號(hào)通路與V-ATPases之間的相互作用

以shRNA干擾SGC7901細(xì)胞中V-ATPases表達(dá)后，可抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號(hào)通路和PKM2蛋白表達(dá)(圖7A)。而以siRNA干擾PKM2表達(dá)后，胃癌HGC27、MGC803細(xì)胞中ATP6V1A和SLC1A5蛋白表達(dá)無明顯差異(圖7B)。以LY294002抑制PI3K表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中ATP6V1A和SLC1A5蛋白表達(dá)無明顯差異(圖7C)。

A：shRNA干擾SGC7901細(xì)胞V-ATPases表達(dá)后對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；B：siRNA PKM2對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；C：不同濃度LY294002對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響圖7 PI3K信號(hào)通路與V-ATPases之間的相互作用(蛋白質(zhì)印跡法)

八、PPI治療減緩荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)，改善癌性惡病質(zhì)情況

與空白對(duì)照組和0.9% NaCl溶液灌胃組相比，泮托拉唑鈉溶液灌胃組裸鼠瘤體最小(圖8A)，腫瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.05；圖8B)，體質(zhì)量明顯升高(P<0.05；圖8D)。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，PKM2干擾組裸鼠瘤體明顯減小，腫瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.05；圖8C)，體質(zhì)量明顯升高(P<0.05；圖8E)。

此外，與空白對(duì)照組和0.9% NaCl溶液灌胃組相比，泮托拉唑鈉溶液灌胃組小鼠日均攝水量和日均攝食量呈下降趨勢(shì)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖8F-8G)。

A：瘤體體積；B-C：腫瘤質(zhì)量；D-E：裸小鼠體質(zhì)量；F：日均攝水量；G：日均攝食量圖8 PPI治療可減緩荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)，改善惡病質(zhì)情況

九、PPI治療影響瘤體PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號(hào)通路表達(dá)

與空白對(duì)照組和0.9% NaCl溶液灌胃組相比，泮托拉唑鈉溶液灌胃組裸鼠腫瘤組織中PI3K、mTOR表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而Akt、HIF-1α、PKM2無明顯差異(圖9)。

A：mRNA表達(dá)(qRCR法)；B：蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)圖9 PPI治療影響瘤體PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號(hào)通路表達(dá)

討 論

PPI作為新興的腫瘤治療藥物，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制尚未闡明，可能為PPI通過抑制胃癌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α/PKM2信號(hào)通路來影響糖酵解，同時(shí)在酸性環(huán)境中可能通過抑制V-ATPases表達(dá)來影響谷氨酰胺代謝，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，通過加藥實(shí)驗(yàn)以及分別沉默信號(hào)通路上游、下游分子的方法，驗(yàn)證了在酸性環(huán)境中，PPI可通過抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α/PKM2信號(hào)通路的表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞糖酵解水平，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡水平。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用皮下成瘤的方法成功建立了SGC7901荷瘤模型和PKM2敲除的SGC7901荷瘤模型，結(jié)果顯示PPI灌胃可抑制小鼠皮下瘤體生長(zhǎng)且使小鼠體質(zhì)量減輕放緩，干擾PKM2表達(dá)細(xì)胞成瘤組的小鼠腫瘤生長(zhǎng)亦放緩，惡病質(zhì)較輕；PPI灌胃治療后，小鼠腫瘤組織中PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號(hào)通路中的上游、下游分子表達(dá)亦有所下調(diào)。進(jìn)一步說明PPI可通過抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號(hào)通路起抑制腫瘤生長(zhǎng)、緩解惡病質(zhì)的作用。然而，與對(duì)照組相比，PPI和PKM2干擾組的小鼠攝食、攝水行為并無明顯改善，且本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)未驗(yàn)證腫瘤的病理變化，故尚不能完全證實(shí)PPI是通過PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號(hào)通路起抗腫瘤的作用。

有研究指出，PPI對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用很大程度上依賴對(duì)V-ATPases的抑制作用，V-ATPases與多個(gè)細(xì)胞代謝通路有關(guān)[14]，其不僅參與MAPK等通路的調(diào)控，同時(shí)可調(diào)控氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)分子，從而對(duì)谷氨酰胺代謝產(chǎn)生影響。本研究中，在胃癌細(xì)胞中，PPI可下調(diào)V-ATPases表達(dá)，并下調(diào)谷氨酰胺關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運(yùn)分子SLC1A5和谷氨酰胺代謝酶GLS表達(dá)。表明PPI不僅可影響糖酵解水平，而且同時(shí)影響胃癌細(xì)胞谷氨酰胺代謝。本研究對(duì)V-ATPases的重要亞基ATP6V1A基因[15]進(jìn)行敲除，結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞中SLC1A5、GLS表達(dá)明顯降低，表明抑制V-ATPases表達(dá)可下調(diào)SLC1A5和GLS表達(dá)，PPI可能通過調(diào)控V-ATPases表達(dá)來影響谷氨酰胺代謝。PKM2是PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號(hào)通路的下游分子，是腫瘤細(xì)胞糖酵解的關(guān)鍵分子。本研究還發(fā)現(xiàn)，干擾PI3K、PKM2表達(dá)對(duì)ATP6V1A和相關(guān)分子并無明顯影響，而敲除V-ATPases后，胃癌細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α/PKM2信號(hào)通路受到明顯抑制。

綜上所述，PPI對(duì)V-ATPases的抑制作用可明顯影響胃癌細(xì)胞，V-ATPases不僅調(diào)控谷氨酰胺代謝，還在一定程度上影響胃癌糖酵解水平。但敲除V-ATPases的胃癌細(xì)胞凋亡并無明顯變化，增殖水平僅輕度下調(diào)，這可能是由于敲除基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞基因組發(fā)生有利于細(xì)胞存活的改變，從而幫助細(xì)胞存活，也可能是由于基因敲除后的細(xì)胞產(chǎn)生了某些代謝回補(bǔ)通路幫助細(xì)胞躲避V-ATPases敲除后的凋亡和生長(zhǎng)抑制作用。值得注意的是，shRNA抑制V-ATPases表達(dá)后，胃癌細(xì)胞Akt表達(dá)明顯下調(diào)，說明干擾V-ATPases對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。

有研究證實(shí)，單純靶向糖酵解并不能取得良好的抗腫瘤效果[12]，這或許是由于腫瘤細(xì)胞存在抵抗機(jī)制和回補(bǔ)通路。已有研究[13]證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中針對(duì)糖酵解和谷氨酰胺代謝的聯(lián)合靶向治療可取得良好的治療效果，共靶向mTORC1和LDHA可起有良好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。在本研究中，靶向V-ATPases可能也存在回補(bǔ)通路的影響，因而聯(lián)合治療或許可取得較好的治療效果，而PPI可影響糖酵解和谷氨酰胺代謝，具有良好的抗腫瘤效果，故聯(lián)合靶向治療是腫瘤治療的大勢(shì)所趨。

總之，本研究證實(shí)PPI可通過抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α/PKM2通路和V-ATPases/SLC1A5、GLS表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞糖酵解和谷氨酰胺代謝，達(dá)到抗腫瘤的作用，V-ATPases或許可作為胃癌治療的良好靶點(diǎn)。然而，對(duì)于靶向V-ATPases的療效和腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向V-ATPases的抵抗機(jī)制以及腫瘤細(xì)胞中各代謝通路之間的作用機(jī)制，仍需行更多的研究進(jìn)一步探討。