臍紅獼猴桃組培快繁技術(shù)研究

成思瓊，梁彬，顏盟，韓秀清

(1.楊凌新世界組培有限公司，陜西楊凌 712100；2.陜西省果業(yè)研究發(fā)展中心；3.陜西新世界果業(yè)集團(tuán)有限公司)

中華獼猴桃原產(chǎn)中國。中華獼猴桃系中的臍紅獼猴桃是紅陽獼猴桃的芽變優(yōu)系，具有品質(zhì)優(yōu)、結(jié)果早、豐產(chǎn)等特點(diǎn)[1]。果肉黃綠色，果心周圍有放射狀紅色圖案，風(fēng)味甜，具香氣，可溶性固形物含量19.9%，總糖含量12.56%，可滴定酸含量1.14%，每100g鮮果維生素C含量97.2mg[2]。2014年3月通過陜西省果樹品種審定委員會(huì)審定。

獼猴桃為雌雄異株植物，常規(guī)育苗方法是將獼猴桃實(shí)生苗嫁接優(yōu)良品種或枝條扦插繁殖[3]。隨著繁殖技術(shù)的發(fā)展，組織培養(yǎng)無性繁殖周期短、效率高，已成為快速繁育獼猴桃苗的重要方式[4,5]。桂耀林最先進(jìn)行了獼猴桃組織培養(yǎng)的相關(guān)研究，對獼猴桃不同組織器官例如莖段、葉片、根段、頂芽、腋芽、花藥、花粉、胚、胚乳等進(jìn)行了離體培養(yǎng)，并開展了與植物組織培養(yǎng)技術(shù)等方面相關(guān)的基礎(chǔ)理論及應(yīng)用研究[6]。

獼猴桃組織培養(yǎng)常用的外植體材料有葉片、莖尖、莖段等。葉片和莖段培養(yǎng)比較困難，愈傷組織培養(yǎng)次數(shù)過多會(huì)慢慢失去再生能力，而莖尖培養(yǎng)容易褐化[7]。筆者采用臍紅獼猴桃?guī)б秆康那o段為外植體，分別研究了初代培養(yǎng)(即直接從植株取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)，目的是建立良好的外植體)不同激素濃度及配比對外植體誘導(dǎo)的影響；繼代培養(yǎng)(對試管苗進(jìn)行擴(kuò)繁增殖，要在保證不影響正常生長的前提下達(dá)到較高的增殖系數(shù))不同激素濃度及配比對試管苗分化的影響；生根培養(yǎng)，試驗(yàn)不同激素濃度及配比對試管苗生根的影響，為臍紅獼猴桃苗工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試材

以臍紅獼猴桃健壯帶腋芽莖段為試驗(yàn)材料，5月于楊凌新世界組培有限公司種質(zhì)資源圃采集新梢，留葉柄摘除成齡葉片,剪成長3～5cm帶腋芽枝段待用。

生長調(diào)節(jié)劑為玉米素(ZT)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)等。基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS，122℃條件下滅菌20分鐘，培養(yǎng)室內(nèi)溫度24±2℃，光照強(qiáng)度1500～2000Lx，光照時(shí)間每天16小時(shí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 激素濃度和配比對初代培養(yǎng)的影響 外植體消毒，將剪成3～5cm長的獼猴桃新梢莖段用自來水沖洗30～60 分鐘，置于無菌超凈工作臺(tái)上。用75%酒精消毒30秒，無菌水沖洗2次，每次10～15秒。0.1%HgCl2處理8分鐘，無菌水沖洗5～6次。將莖段剪成1.5cm左右的帶腋芽(僅留葉柄)小段，接種在初代培養(yǎng)基上：基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，pH值5.8，添加不同的激素。激素添加設(shè)置18個(gè)處理組合，分別為6-BA(1.0、2.0、3.0mg/L)+NAA(0.05、0.1、0.2mg/L)，以及ZT(0.5、1.0、1.5mg/L)+NAA(0.05、0.1、0.2mg/L)，每個(gè)處理組合接種6瓶，每瓶5個(gè)外植體，即每個(gè)處理組合接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，25天后統(tǒng)計(jì)外植體的誘導(dǎo)成活率。

1.2.2 激素濃度和配比對繼代培養(yǎng)的影響 將初代培養(yǎng)獲得的無菌外植體接種到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)(圖1)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS+蔗糖40g/L+瓊脂6.5g/L，pH值5.8，激素添加量設(shè)置16個(gè)處理組合，分別為6-BA(2.0、3.0、3.5、4.0mg/L)+NAA(0.1、0.2、0.3、0.4mg/L)。每個(gè)處理組合接種6瓶，每瓶放置5個(gè)外植體，即每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，40天后調(diào)查外植體不定芽的生長狀況，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和平均莖干高度。

1.2.3 激素濃度和配比對生根培養(yǎng)的影響 繼代試管苗選擇高度1.5～2.0cm的健壯植株，接種于生根培養(yǎng)基上(圖2)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1/2MS+蔗糖25g/L+瓊脂6.5g/L，pH值5.8，激素添加量設(shè)置12個(gè)處理組合，分別為IBA(0.5、0.6、0.7mg/L)+IAA(0.5、1.0、2.0、3.0mg/L)，每個(gè)處理組合接種6瓶，每瓶放置5株苗，即每個(gè)處理接種30個(gè)繼代苗，重復(fù)3次，20天后統(tǒng)計(jì)試管苗的生根率和生根條數(shù)。

圖2生根苗

1.2.4 馴化煉苗并移栽 試管苗根長1cm左右，有5～6條側(cè)根時(shí)，將瓶苗置于溫室馴化煉苗，分閉口煉苗和開口煉苗兩個(gè)階段，開口煉苗3天后，當(dāng)試管苗莖干顏色由嫩綠變青綠時(shí)開始移栽，將試管苗根系的培養(yǎng)基小心洗凈，移栽于穴盤中，穴盤下層2/3基質(zhì)、上層1/3蛭石。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素濃度和配比誘導(dǎo)外植體不定芽效果

不同激素處理組合對獼猴桃組培外植體不定芽的誘導(dǎo)效果不同(圖3)。當(dāng)6-BA濃度和ZT濃度一定時(shí)，NAA在0.05～0.2mg/L濃度范圍內(nèi)隨濃度升高，不定芽誘導(dǎo)成活率也升高；當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，不定芽誘導(dǎo)成活率隨6-BA(1.0～3.0mg/L)濃度增加而升高，隨ZT(0.5～1.5mg/L)濃度增加呈先升高后降低趨勢。當(dāng)NAA濃度為0.2mg/L，6-BA 3.0mg/L和ZT 1.0mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)成活率最高，分別為81.2%和83.3%。綜合比較，最佳初代培養(yǎng)基為MS+ZT 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L。

2.2 激素濃度和配比對外植體繼代培養(yǎng)增殖率及莖干高度的影響

不同的激素組合處理對獼猴桃組培外植體芽的分化有影響(圖4)。將初代培養(yǎng)的外植體用不同濃度的6-BA和NAA處理，當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，外植體增殖率和莖干高度隨NAA濃度(0.1～0.4mg/L)的增加而先升高后降低，NAA濃度為0.2mg/L時(shí)，兩項(xiàng)指標(biāo)最佳；NAA濃度一定時(shí)，增殖系數(shù)和莖干高度隨6-BA(2.0～4.0mg/L)濃度的增加也呈先升高后降低趨勢，6-BA最佳濃度為3.5mg/L。因此，臍紅獼猴桃最佳的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.5mg/L+NAA 0.2 mg/L，增殖系數(shù)和莖干高度分別為4.54和2.48cm。

2.3 激素濃度和配比對外植體生根率及生根條數(shù)的影響

由圖5可知，在含有不同激素的培養(yǎng)基上，臍紅獼猴桃生根效果不同。當(dāng)IBA濃度一定時(shí)，生根率和生根條數(shù)隨IAA(0.5～3.0mg/L)濃度增加而增加，當(dāng)IAA濃度一定時(shí)，生根率和生根條數(shù)在IBA濃度為0.6mg/L時(shí)達(dá)到最高。因此，臍紅獼猴桃最佳的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 0.6mg/L+IAA 3.0mg/L，生根率為95.2%，平均生根條數(shù)為4.8條。

2.4 試管苗移栽成活率

試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié)，移栽于不同的基質(zhì)中效果有差別。蛭石的保水性、透氣性好，有利于植株吸收營養(yǎng)和水分；山坯土主要成分是枯枝、葉片等形成的腐殖質(zhì)，透氣保水性均較好；純沙透水透氣性好而保水性差；珍珠巖保水性強(qiáng)而易于積水。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)下層2/3基質(zhì)(商品)、上層1/3蛭石時(shí)，試管苗移栽成活率最高，達(dá)97.6%。

3 小結(jié)與討論

采用臍紅獼猴桃?guī)б秆康那o段為外植體進(jìn)行組培快繁試驗(yàn)，試管苗在各培養(yǎng)階段采用不同配方的培養(yǎng)基能夠培育高質(zhì)量的健壯組培苗[6]。張茜等發(fā)現(xiàn)，紅陽獼猴桃的初代培養(yǎng)中，用6-BA代替ZT 誘導(dǎo)效果更為明顯，且可大大降低成本[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZT和6-BA作用效果相近，而ZT更優(yōu)，作為外植體的建立用量也少，MS+ZT 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L被認(rèn)為是初代培養(yǎng)基的最佳配方。在繼代培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素與植物生長素作用是相互協(xié)同的。生長素對外植體的分化起到了輔助作用，適宜濃度的6-BA和NAA配合使用可促進(jìn)芽苗的主莖伸長，否則，對芽苗主莖伸長有抑制作用[9]。MS+6-BA 3.5mg/L+NAA 0.2mg/L被選定為繼代培養(yǎng)基的最佳配方。當(dāng)激素濃度較低時(shí)，生根速度慢，根系虛弱；激素濃度適當(dāng)升高，生根速度加快，根系較強(qiáng)壯；當(dāng)激素濃度繼續(xù)升高時(shí)，根系生長趨于弱化，這與高濃度的植物激素抑制了對不定芽生根的誘導(dǎo)作用有關(guān)[10]。1/2MS+IBA 0.6mg/L+IAA 3.0mg/L被選定為臍紅獼猴桃生根培養(yǎng)基的最佳配方。