濃度對(duì)髓鞘堿性蛋白與髓磷脂分子間相互作用的影響研究

張 蕾,丁 琦,王小梅

(西安航空學(xué)院 理學(xué)院，西安 710077)

0 引言

髓鞘是有規(guī)則、分節(jié)段地包裹在神經(jīng)軸突周圍的一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的多層細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)軸突除了具有絕緣保護(hù)作用外，還能提高神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)速度[1-2]。髓鞘堿性蛋白(MBP，相對(duì)分子質(zhì)量為18.5 KDa)位于髓鞘漿膜面上，維持著中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，具有神經(jīng)組織的特異性。當(dāng)腦外傷害引起神經(jīng)組織細(xì)胞的破壞時(shí)，MBP就會(huì)進(jìn)入腦脊液；少部分隨受損的血腦屏障進(jìn)入血液，此時(shí)MBP會(huì)明顯增加，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)被破壞，出現(xiàn)與腦損傷相關(guān)的疾病。因此，檢測(cè)腦脊液和血液中MBP的含量，是反應(yīng)神經(jīng)組織細(xì)胞有無實(shí)質(zhì)性損傷的一個(gè)靈敏而可靠的指標(biāo)[3-6]。

MBP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)成熟髓鞘中的主要蛋白，且是MBP家族在進(jìn)化過程中最保守的蛋白。據(jù)報(bào)道，脊椎動(dòng)物中的MBP含有170個(gè)氨基酸殘基，在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能中起著關(guān)鍵作用[7-8]。MBP與髓鞘膜中具有不同極性頭部基團(tuán)的磷脂分子相互作用，會(huì)促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的融合，形成多層膜結(jié)構(gòu)的主要致密線。MBP吸附到髓鞘脂膜上可以維持髓鞘結(jié)構(gòu)的緊密性和功能的穩(wěn)定性[9-11]。

本文主要研究不同濃度的MBP分別與髓磷脂POPC、POPE、POPS分子發(fā)生相互作用而形成的仿生膜的構(gòu)象變化和物理特性。使用Langmuir-Blodgett(LB)技術(shù)研究了MBP對(duì)髓磷脂膜吸附的壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線，并利用表面損失量分析了混合單層膜的穩(wěn)定性。用原子力顯微鏡(AFM)分別觀察了MBP對(duì)髓磷脂POPC、POPE和POPS單層膜的表面形貌的影響。本文的研究結(jié)論對(duì)探討相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理和治療具有一定的指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

從牛腦中分離制備實(shí)驗(yàn)所用到的MBP，并按照Deibler等人的方法在水溶性溶液中純化[12]。高純度(至少99%)的1-棕櫚?；?2-油?；?甘油-3-磷酸膽堿(POPC，分子量為760.1 g/mol)，1-棕櫚?；?2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(鈉鹽)(POPE，分子量為718.0 g/mol)，1-棕櫚?；?2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸(鈉鹽)(POPS，分子量為784.0 g/mol)購(gòu)買于Avanti Polar Lipids Inc公司，無需進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)中使用的亞相為10 mM Tris-HCL 緩沖液，并將pH值調(diào)節(jié)至7.2。將脂質(zhì)粉末溶解在氯仿/甲醇(3：1，v / v)混合液中，配制最終濃度為1 mg/mL的脂質(zhì)儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)用去離子水由超純水系統(tǒng)制備，其電阻率高于18.2 MΩcm。

1.2 連續(xù)壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線測(cè)定

使用KSV-Minitrough(KSV公司，芬蘭)膜天平測(cè)定了混合單層膜在空氣/亞相界面上的連續(xù)壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線， LB 子的有效面積為273 cm2，容積為240 mL。每次實(shí)驗(yàn)前，先后用無水乙醇溶液和超純水徹底清洗LB槽和滑障。使用微量進(jìn)樣器將適量的脂質(zhì)溶液滴加到含有一定濃度MBP的亞相界面上，靜待15 min，直至有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，表面壓力趨于穩(wěn)定。以10 mm/min的速率對(duì)單層膜進(jìn)行壓縮，得到表面壓力(π)隨平均分子面積(A)變化等溫線。

測(cè)定壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線：設(shè)定目標(biāo)膜壓為30mN/m，計(jì)算機(jī)自動(dòng)采集混合單層膜的壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線。每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)三次，以檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。所有實(shí)驗(yàn)溫度控制在(22±1)℃。

1.3 原子力顯微鏡觀測(cè)

利用原子力顯微鏡(WET-SPM-9500-J3，日本島津)對(duì)轉(zhuǎn)移至云母基底上的混合單分膜的表面形貌進(jìn)行表征。AFM微懸臂的彈性常數(shù)為0.06 N/m，探針材料為Si3N4，掃描頻率為1Hz，采集像素為512×512。整個(gè)AFM觀測(cè)過程均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 連續(xù)壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線表面損失百分比的定量分析

“滯回”現(xiàn)象是由于壓縮-擴(kuò)張引起的單層構(gòu)象變化而導(dǎo)致的連續(xù)壓縮和擴(kuò)張曲線遵循的不同途徑，該“滯回”現(xiàn)象可用表面損失百分比(Apparent loss(%))進(jìn)行量化分析[13]：

式中， Ac1表示單層膜第一次壓縮時(shí)曲線在固定表面壓力下的平均分子面積， Aci中,i = 1、2、3分別表示循環(huán)中第一、第二和第三次壓縮至相同表面壓力下的平均分子面積。

2.2 空氣/亞相界面MBP與POPC、POPE和POPS分子間相互作用的“滯回”曲線分析

圖1給出了濃度為1.0、2.5、4.0 和5.5 nM的MBP分別吸附到POPC(圖a)、POPE(圖b)和POPS(圖c)單分子層上，表面壓在0-30mN/m之間的連續(xù)壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線。不同濃度的MBP吸附到同一個(gè)脂質(zhì)單層膜所呈現(xiàn)出來的壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線的形狀基本相似，但隨著MBP濃度的增大，曲線整體向分子面積增大的方向移動(dòng)，這說明MBP被吸附到單層膜界面上。隨著MBP濃度的增加，混合單層膜在0～30 mN/m時(shí)的壓縮-擴(kuò)張曲線不再重合，均出現(xiàn)“滯后”的現(xiàn)象，是由于相互作用分子在界面發(fā)生重排導(dǎo)致的。為了進(jìn)一步研究MBP對(duì)POPC、POPE和POPS脂膜穩(wěn)定性的影響，利用方程(1)計(jì)算了表面壓力為10 mN/m時(shí)，混合單層膜的表面損失量。

(a)POPC+MBP

(b)POPE+MBP

(c)POPS+MBP

表1 給出了在10 mN/m的表面壓力下，不同濃度的MBP (CMBP=1.0、2.5、4.0和5.5 nM)與不同脂質(zhì)(POPC、POPE和POPS)相互作用的表面損失量。

表1 各混合單層膜的表面損失量

數(shù)據(jù)分析可得，各單層膜的表面損失量會(huì)因MBP濃度增加而上升，其中MBP/POPE混合單層膜的表面損失量相對(duì)較小，這說明MBP與POPE分子間的相互作用較強(qiáng)，MBP嵌入到POPE單層膜中，從而提高了單層膜的穩(wěn)定性。對(duì)于MBP/POPC和MBP/POPS混合單層膜，壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線的“滯后”現(xiàn)象比較明顯，這是由于MBP/POPC和MBP/POPS結(jié)合物在壓縮過程中被擠入亞相中，使得混合單層膜的表面損失量變大。然而，MBP/POPE和MBP/POPS混合單層膜在CMBP=4.0 nM和CMBP=5.5 nM時(shí)，表面損失量稍有減小，均在標(biāo)準(zhǔn)誤差范圍內(nèi)。對(duì)于MBP/POPC脂膜在CMBP=1.0 nM 表面損失量為 6.2±1.3%，意味著在壓縮過程中，POPC分子被擠入亞相，并在單層膜的下方，但由于分子間的相互作用力比較弱，當(dāng)MBP的濃度為2.5 nM，MBP被吸附到界面上，使得表面損失量減小。當(dāng)繼續(xù)增大MBP濃度，相對(duì)分子質(zhì)量較大的MBP攜帶POPC分子進(jìn)入到單層膜下方，進(jìn)一步導(dǎo)致表面損失量變大。

綜上所述，表面損失量的參數(shù)值的大小表明，MBP/POPE混合單層膜最為穩(wěn)定，其次為MBP/POPC混合單層膜，最后為MBP/POPS混合單層膜。

2.3 原子力顯微鏡觀測(cè)

為了進(jìn)一步探究MBP的濃度對(duì)混合單層膜影響的內(nèi)在微觀結(jié)構(gòu)變化，采用AFM (接觸模式)對(duì)混合單層膜的表面形貌進(jìn)行了表征。當(dāng)亞相中MBP的濃度為1 nM時(shí)，對(duì)POPC、POPE以及POPS單層膜影響的AFM圖像如圖2所示。

(a)POPC+MBP(0 nM)

(b)POPC+MBP(1 nM)

(c)POPE+MBP(0 nM)

(d)POPE+MBP(1 nM)

(e)POPS+MBP(0 nM)

(f)POPS+MBP(1 nM)

顯然，MBP的加入對(duì)POPE單層膜的表面形貌影響不大， MBP/POPE混合單層膜表面分子排列較為緊密，單層膜較穩(wěn)定，并且可以看到表面附有大量的MBP顆粒，這說明MBP嵌入到POPE單層膜上，增加了膜的穩(wěn)定性； MBP/POPC脂膜表面出現(xiàn)“凹陷洞洞”狀，說明相對(duì)分子大的MBP攜帶一部分POPC分子進(jìn)入亞相，使得表面出現(xiàn)“孔洞”；MBP/POPS脂膜表面出現(xiàn)“樹杈狀”，表明POPS單分子層不穩(wěn)定，很容易受到MBP的影響，因此出現(xiàn)“樹杈狀”的形貌圖。總體而言，對(duì)于MBP/POPC和MBP/POPS混合單層膜的表面形貌，MBP的加入對(duì)脂膜表面形貌的影響比較大，并且脂膜表面變得稀疏，進(jìn)而界面分子的損失量也隨之增大，和前面分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

研究了不同濃度的MBP對(duì)不同磷脂POPC、POPE和POPS單分子層的影響。結(jié)果表明：(1)隨著亞相中MBP濃度的增大，混合單層膜的壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線均向平均分子面積增大的方向移動(dòng)， 意味著MBP分子吸附到了單層膜的界面上。(2)連續(xù)壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線的數(shù)據(jù)分析表明不同濃度MBP與不同磷脂分子之間相互作用時(shí)，表面損失量的大小排序?yàn)椋篗BP/POPE < MBP/POPC < MBP/POPS，說明MBP/POPE混合單層膜較為穩(wěn)定，MBP對(duì)POPE單層膜界面分子的二維排列影響也較小，而MBP/POPS混合單層膜則不穩(wěn)定，MBP對(duì)POPS單層膜界面分子的二維排列影響更加顯著。(3)從AFM圖像可以看出，MBP與不同的脂質(zhì)分子間均會(huì)發(fā)生相互作用，并且MBP不但會(huì)嵌入到POPE單層膜，并在界面形成很多聚集體，還會(huì)引起POPC和POPS脂質(zhì)單層膜的構(gòu)象發(fā)生改變，相對(duì)分子較大的MBP分子會(huì)攜帶POPC和POPS分子進(jìn)入亞相，導(dǎo)致界面分子排列疏松。

綜上所述，根據(jù)連續(xù)壓縮-擴(kuò)張循環(huán)曲線來計(jì)算不同濃度的MBP與不同頭部基團(tuán)的不飽和髓磷脂相互作用的表面損失量，這對(duì)理解MBP維持髓鞘穩(wěn)定性和緊密性提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。