七厘散中紅花的顯微定量研究

劉子薇，謝林辰，靳羽含，秦雯，厲妲

(北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京 100094)

七厘散首次出現在清代作者謝元慶撰寫的《良方集腋·損傷門》一書中，又被稱作是神效七厘散，意為治療效果非常好。方中含有紅花、沒藥、朱砂、麝香、血竭、冰片、乳香等中藥。氣香，味辛、苦，有清涼感[1]。紅花(CarthamustinctoriusL.)，菊科植物的干燥花，在活血祛瘀類中藥中使用較為廣泛。其性溫、味辛[2]，歸心、肝經。具有活血通經，祛瘀止痛之效，主要用于治療女性的經期病、胸痛、瘀傷、身體酸痛等病癥[3]。

七厘散既可以口服，也可以外用敷在傷處[4]?，F如今七厘散在傷科中逐漸被廣泛應用，它不僅可以化去瘀癥消去腫塊，也可以止痛止血[5]。臨床上常常用于跌倒損傷、皮外出血。

花粉粒，在紅花粉末中的顯微特征相對明顯和穩(wěn)固，它的優(yōu)點是數目很多，在計算數量上有一定優(yōu)勢，能夠方便于在顯微鏡下進行顯微定量。紅花花粉粒的特點有以下幾方面：顏色上是深黃色，在眾多顯微特征中顏色突出方便查找，形狀上多數是類圓球形、橢圓形或橄欖形，外壁上有短刺和疣狀雕紋，具有3個萌發(fā)孔，孔口的形狀是類圓形或長圓形[6]。

在國家藥品標準中，中成藥的質量是否達標是很重要的一部分，由于中成藥的種類甚多，組成成分相對繁雜，依照現在的統(tǒng)一標準對其質量的評價都不是很全面，范圍仍局限在中成藥中某單味或多味中藥的有效成分的鑒別和檢測。近年來，中成藥顯微定量的研究已增多，逐步成為中成藥質量是否符合標準的參照依據[7]。

中藥顯微定量法是利用中藥中某種顯微特征具有固定常數的特點，對其進行容量或者重量分析，從而得出中藥百分含量的一種中藥鑒定方法[8]。利用顯微特征常數來測定中藥含量的方法具有簡便、快速、精確、成本較低等特點，此法更適用于廣大基層，且近年來已逐步運用到中成藥的質量評價。

1 試驗儀器、試劑與藥品

1.1 儀器 顯微鏡：Olympus顯微攝影系統(tǒng)，包括：BX-51研究級萬能顯微鏡，配備Olympus DP-72顯微鏡數碼相機(日本奧林巴斯株式會社)；電子分析天平(CP225D，德國賽多利斯集團)；TopPette型微量移液器(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(FW80，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑 水合氯醛(天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心，批號：20120321)；甘油(沈陽沈一精細化學品有限公司，批號：20160508)；試驗需要的水合氯醛試液依據《中國藥典》2015年版(四部)通則8002項下配制。

1.3 藥品 本研究所采用的紅花樣品均由北京城市學院厲妲老師鑒定為菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花。七厘散來自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號分別為：2101015、2101027、2101008。

2 方法與結果

2.1 紅花花粉粒的顯微特征常數測定方法條件的優(yōu)選 試驗中干擾紅花粉末樣品混懸效果的重要因素有：X1樣品紅花的重量；X2過篩的目數也叫作粉碎粒度；X3混懸劑甘油的劑量。因此本試驗采用均勻設計的方案來確定紅花花粉粒的顯微特征常數值的檢測條件。考慮幾種因素對試驗結果的影響，本試驗利用U6(63)均勻設計方案[7-10]對其進行考察。

將紅花樣品分為6組，每組對應的樣品重量分別為5.00、9.99、15.01、19.98、25.02、30.03 mg；每組對應的樣品粉碎粒度分別為80、100、100、80、80、100目；每組對應加入的甘油量分別為5.0、8.0、4.0、7.0、3.0、6.0 mL。

取紅花樣品進行粉碎，按照均勻設計表逐一過80目篩、100目篩，讓其全數過篩。精密稱定5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg共6份，將水合氯醛試液依次倒入，經數次研磨后，轉移至25 mL容量瓶中，再依次倒入5.0、8.0、4.0、7.0、3.0、6.0 mL的甘油，最終使用水合氯醛試液進行定容。

裝片所需的體積：經過預試驗發(fā)現，樣品的裝片體積對紅花的花粉粒顯微特征常數無顯著影響，因此可按照試驗需要選擇裝片所需的體積；考慮到被觀察物要鋪滿整個蓋玻片并不能溢出，經反復取樣驗證，最終選擇0.02 mL來裝片，每份溶液平行裝片50張后，放在顯微鏡下觀看紅花的花粉粒并計數。

把50張片子的計數結果隨機化分為5組(每組10張)，計算出每組片子中紅花花粉粒數目的平均值，然后算出5組數據的平均值和其5組數據的RSD值，用每組紅花樣品平均值的RSD值為考查指標，通過SPSS 19.0軟件得出均勻設計的優(yōu)化結果。試驗數據見表1。

表1 紅花中花粉粒顯微特征常數均勻設計試驗結果

均勻設計軟件算出的結果:Y=9.428-0.221X1；R2=0.976；F=162.779；Ymin=2.798(即2.80%)。

X1項為負，所以X1要取最大值；X2、X3沒有進入方程式，說明X2、X3對試驗的結果影響可以不用考慮，X2、X3的值可根據實際情況進行條件選擇。

即紅花樣品的優(yōu)化條件為X1樣品的重量:30.0 mg；X2粉碎的粒度:100目;X3加入的甘油量:6 mL。

驗證均勻設計試驗：紅花樣品粉末3份(每份30.0 mg并過100目篩)，精確稱定后通過水合氯醛試液進行數次研磨，到轉移到25 mL容量瓶中，倒入甘油6 mL，最終通過水合氯醛試液進行定容，完全搖勻后精確吸取0.02 mL所配的紅花樣品溶液，平行制片50張，于顯微鏡下查看紅花的花粉粒并計數，將所得數據隨機化分為5組，算出每一組數據的RSD值。

驗證成果中，3份紅花的花粉粒特征常數平均值分別為：60.50、59.84、60.36 個/mg，優(yōu)化條件給出的最小RSD是2.80%，各樣品的RSD各自為2.74%、2.54%、2.72%，每一份樣品的RSD都不超過優(yōu)化條件列出的最小RSD(2.80%)，說明本均勻試驗設計方案合理。下文紅花中花粉粒顯微常數測定試驗都根據均勻設計給出的優(yōu)化成果來操作。

2.2 紅花花粉粒顯微特征常數值測定 30.0 mg精確稱取紅花重量后根據均勻設計方法，察看并記錄每張片子中紅花花粉粒的數量。取其數目平均值，根據公式1計算紅花花粉粒顯微特征常數值。結果見表2。

表2 紅花樣品花粉粒顯微特征常數值測定結果

公式1：顯微特征常數P=(X×V)/(V′×W)，這當中，P 表示定量藥物的顯微特征常數，單位是(個/mg)；X 表示每片蓋玻片下藥物的顯微特征數；V 表示定量藥物混懸液的總體積，單位是(mL)；V′ 表示蓋玻片下藥物混懸液的體積，單位是(mL)；W 表示藥物的重量，單位是(mg，以干燥品計)。

根據公式1，依照均勻設計驗證試驗的成果可計算出紅花花粉粒的顯微特征常數值為2 807.19個/mg。

2.3 七厘散中紅花的含量檢測 中成藥前處理：將七厘散粉碎后直到全部過100目篩，備用。

為防止結果出現誤差，用于顯微定量的藥材及中成藥應按干燥品計算。七厘散樣品按照《中國藥典》2015年版中的烘干法[1]來測定：取經過粉碎后的七厘散粉末 2～5 g，平鋪在干燥且重量恒定的稱量瓶中，厚度不大于 5 mm，精確稱取后，移放至烘箱中，打開瓶蓋，溫度設置 80 ℃干燥 5 h，將瓶蓋蓋好，冷卻 30 min，精確稱取重量后，再用上述溫度干燥 1 h，冷卻，稱重，直到接連兩次重量的差異少于5 mg 為止。依照減失的重量，算出供試品中的含水量(%)。具體含量見表3。

表3 3種七厘散樣品水分測定

將七厘散粉碎后直至完全過100目篩，精確稱取干燥后的中成藥的粉末200 mg各3份，按照均勻設計方法制片，記錄花粉粒顯微特征數，按照公式2算出紅花百分含量，試驗結果見表4。

表4 七厘散中紅花花粉粒的顯微定量測定

公式2：樣品含量%=(X×V)/(V′×W×P)×100%

X表示每片蓋玻片下藥物顯微特征常數；V 表示定量藥物混懸液總體積(mL)；V′表示蓋玻片下藥物混懸液體積(mL)；W表示藥物重量(mg，按干燥品計)；P表示定量藥物顯微特征常數(個/mg)。

3 討論與結論

相較于其他鑒別方法來說，顯微鑒別具有所需費用低、執(zhí)行方法簡單、易于操作且普及效果明顯等特點[11]。目前我國顯微測定技術發(fā)展較為成熟，從20世紀80年代起就已經有了顯微研究的相關報道，但對于中藥材應用尤其是含有紅花的中成藥方面的顯微定量研究少之又少，且試驗設計較為凌亂，沒有一套準確可行的完整步驟，目前使用較廣的非參比物顯微定量法在傳統(tǒng)顯微操作方法的基礎上加以改革創(chuàng)新，建立起了一套符合中藥材鑒別特點的顯微方法與思路，可有效檢測有效成分不明的中藥材。本試驗應用均勻試驗設計顯微檢測方法，有著高度的可推廣性與相對準確性。

本次試驗將紅花作為參照對象，紅花由于粉碎后過100目篩，有的花粉粒較完整，有的已破碎。觀察時對完整的花粉粒計為一個單位；破碎的花粉粒大于1/2計為一個單位；其他情況忽略不計[12]。對七厘散中的紅花含量進行有效性檢測。檢測結果表明，收集的七厘散中紅花的含量符合《中國藥典》的標準。應用此檢測方法可以為含有紅花其他中成藥質量評價提供新的技術，簡便、迅速地判斷是否含有相應中藥材且含量是否充足，可為七厘散及含有紅花的中成藥質量評價提供新的研究思路和方法。