土槿皮乙酸與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用于體外抗白念珠菌活性研究

李 貞，殷紅梅，陳偉琴，薛贏俊，胡 駿，諸 斌，胡曉波

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

念珠菌是引起醫(yī)院獲得性血液感染的第四常見致病菌，嚴重威脅患者的生命健康，其感染的病死率為40%～50%[1-3]。盡管非白念珠菌的感染率逐年升高，白念珠菌仍是目前臨床分離率最高的致病性念珠菌，在血流、尿道及陰道念珠菌感染中均占有較高比例，感染率分別為48.1%、58.7%及67%[2，4-5]。有研究結(jié)果表明，對臨床常用唑類抗真菌藥物耐藥的白念珠菌逐漸增多，增加了治愈難度[6]。

土槿皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）是一種二萜酸，具有抗真菌、抗病毒及抗腫瘤的功效，為我國傳統(tǒng)抗真菌藥物土槿皮的主要活性成分。土槿皮酊被用于治療真菌所致的皮膚癬癥[7-9]。

聯(lián)合用藥是臨床應(yīng)對耐藥加劇的常用方法，在增強抗真菌藥物療效的同時，也可減少藥物的不良反應(yīng)。有些中藥的天然活性成分可以顯著增強耐藥真菌對抗真菌藥物的敏感性[10]。PAB單獨作用抑制念珠菌的作用已得到證實。本研究擬探討PAB聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫囊志Ч?，為臨床抗真菌治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集臨床分離的白念珠菌33株，包括氟康唑耐藥菌株12株和敏感菌株21株。質(zhì)控菌株白念珠菌（ATCC 22019）由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院饋贈。

1.2 藥物與試劑

PAB（純度>98%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司），氟康唑、沙保弱瓊脂培養(yǎng)基（上海源聚生物科技有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國賽默飛公司） ，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和4-嗎啉丙磺酸（上海碧云天公司）。

1.3 微量稀釋法測定各單藥最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）

參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M27-A3文件[11]，采用微量稀釋法測定PAB及氟康唑?qū)Ω骶甑腗IC。藥物以DMSO溶解后，經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)液倍比稀釋，DMSO含量均低于1%。菌液調(diào)至103CFU/mL。反應(yīng)在無菌96孔平底微量培養(yǎng)板中進行，每孔加103CFU/mL菌液100 μL，加不同濃度藥物100 μL，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。PAB的終濃度為0.5～256 μg/mL，氟康唑的終濃度為0.25～1 024 μg/mL。設(shè)置陰性對照（培養(yǎng)液200 μL）及陽性對照（菌液100 μL+培養(yǎng)液100 μL）。

1.4 棋盤式微量稀釋法檢測PAB與氟康唑聯(lián)用的抑菌效果

藥物用RPMI 1640培養(yǎng)液倍比稀釋，菌液調(diào)至103CFU/mL。于96孔板中加入100 μL菌液，加入PAB及氟康唑各50 μL。其中2種藥物以二維棋盤的縱、橫2個方向分別以2倍比稀釋濃度加入。橫向1～11孔加入不同濃度的氟康唑50 μL，縱向A～H孔加入不同濃度的PAB 50 μL。PAB的終濃度為0.125～16 μg/mL，氟康唑的終濃度為0.031 25～32 μg/mL。每板均設(shè)陰性對照、陽性對照，置于37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。藥物體外相互作用方式以部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI） 判定。當(dāng)FICI≤0.5 時，表明2種藥物聯(lián)用的抑菌效果為協(xié)同作用；0.54 時，為拮抗作用。

1.5 時間-殺菌曲線試驗動態(tài)監(jiān)測2種藥物聯(lián)用的抑菌效果

根據(jù)棋盤式微量稀釋法的結(jié)果，采用時間-殺菌曲線試驗動態(tài)監(jiān)測2種藥物聯(lián)用對菌株A的抑菌效果。菌液初始濃度為103CFU/mL，藥物濃度選擇2種藥物聯(lián)用時的MIC。設(shè)置對照組（僅含菌液）、PAB組（菌液+2 μg/mL PAB）、氟康唑組（菌液+16 μg/mL氟康唑）、兩藥聯(lián)用組（菌液+16 μg/mL氟康唑+2 μg/mL PAB）。37 ℃、120 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)12、24和48 h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液進行10倍系列稀釋，取一定量菌液涂布于沙保弱平板，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)。同時于培養(yǎng)48 h時取原倍菌液20 μL充池快速計數(shù)板，高倍鏡下觀察菌株生長狀態(tài)。以lg CFU/mL為縱坐標(biāo)、時間為橫坐標(biāo)，繪制時間-殺菌曲線（CFU=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）。藥物作用24 h時，與2種藥物中單用抗真菌活性最強者相比，若2種藥物聯(lián)用后抗真菌活性的增強≥2 lg CFU/mL，則確認2種藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAB與氟康唑單獨使用的抑菌效果

根據(jù)CLSI M27-A3文件，采用微量稀釋法檢測PAB及氟康唑單獨使用時對白念珠菌的抑菌情況。結(jié)果表明，33株白念珠菌中，12株對氟康唑耐藥，MIC為128～512 μg/mL；PAB單獨作用時，對氟康唑耐藥及敏感白念珠菌有類似的抑菌效果，MIC為4～32 μg/mL。見表1。

表1 PAB與氟康唑體外抗白念珠菌活性（24 h）

2.2 PAB與氟康唑聯(lián)用的抑菌效果

采用棋盤式微量稀釋法檢測PAB與氟康唑聯(lián)用的抑菌效果，并計算FICI，評估藥物體外相互作用的方式（表1）。結(jié)果表明，PAB與氟康唑聯(lián)合使用較單獨使用有較好的抑菌效果，尤其是對氟康唑耐藥的白念珠菌。藥物單獨作用時，氟康唑及PAB對菌株A的MIC分別為256和16 μg/mL；聯(lián)合用藥時，16 μg/mL氟康唑+2 μg/mL PAB同時使用可以達到很好的抑菌效果。FICI結(jié)果表明，2種藥物聯(lián)用對氟康唑耐藥的12株白念珠菌均表現(xiàn)出協(xié)同抑菌的效果（FICI為0.035～0.188）；而21株氟康唑敏感菌株中，10株（47.62%）有協(xié)同抑菌效果（FICI為0.188～0.375），11株無相互作用。敏感組及耐藥組有協(xié)同作用的菌株所占比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）。

2.3 時間-殺菌曲線試驗動態(tài)監(jiān)測2種藥物聯(lián)用的抑菌效果

采用時間-殺菌曲線試驗驗證藥物對白念珠菌的協(xié)同抑菌效果，結(jié)果與FICI一致，PAB與氟康唑聯(lián)用對耐藥的白念珠菌有較好的殺菌效果，見圖1。PAB在較低的濃度時對白念珠菌的抑菌作用并不明顯，但可顯著增強氟康唑的抑菌活性。在初始接種量為103CFU/mL的情況下，與單獨使用16 μg/mL氟康唑相比，聯(lián)合PAB（2 μg/mL PAB）可使菌株A的24 h lg CFU/mL降低3.64。菌株培養(yǎng)至48 h，高倍鏡下觀察可見2種藥物聯(lián)用時，不僅菌株的繁殖數(shù)量明顯下降，而且菌絲的形成及孢子的萌發(fā)也受到抑制，見圖2。

圖1 時間-殺菌曲線

圖2 培養(yǎng)48 h高倍鏡下的白念珠菌生長情況

3 討論

土槿皮也稱土荊皮，是生長于我國南方的松科植物金錢松的根皮和近根樹皮。早在清代，趙學(xué)敏所著《本草綱目拾遺》中就有關(guān)于土槿皮藥用價值的記載，其性辛、溫，可止癢殺蟲，用于治療真菌所致的皮膚癬癥。目前，從土槿皮中提取出的二萜類化合物約20種，其中PAB具有相對較強的抗真菌活性[7，12]。

本研究同時納入了對氟康唑敏感及耐藥的白念珠菌，以檢測PAB對其的抑菌效果。本研究發(fā)現(xiàn)，PAB單獨使用時，對氟康唑敏感及耐藥白念珠菌具有相似的抑菌效果，MIC為4～32 μg/mL。目前，PAB的抑菌機制尚未被闡明，但其對敏感及耐藥白念珠菌均有較強的抑菌作用，可能是因為PAB具有與氟康唑不同的作用位點或作用機制。氟康唑為廣譜三唑類抗真菌藥物，可特異性干擾真菌細胞色素P450的活性，抑制細胞膜上麥角固醇的合成，能破壞細胞壁完整性，進而抑制真菌生長繁殖。

由于念珠菌對臨床常用唑類抗真菌藥物的耐藥性不斷增強，越來越多的研究開始關(guān)注藥物的聯(lián)合應(yīng)用。但多種抗真菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用因較高的成本及嚴重的副作用而受到一定的限制[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥活性成分（如黃連堿、藥根堿、小檗堿等），不僅本身有抑制真菌生長的作用，與氟康唑聯(lián)用時也有較好的協(xié)同抑菌效果[10，13]。本研究結(jié)果也顯示，PAB與氟康唑聯(lián)用對抑制白念珠菌有協(xié)同作用，尤其對耐氟康唑的菌株，可以使其對氟康唑的MIC由單獨使用時的128～512 μg/mL降至聯(lián)合用藥時的1～16 μg/mL，PAB的MIC也降至0.5～2 μg/mL。表明2種藥物聯(lián)用時，PAB僅需較低的藥物濃度就可以達到較好的抑菌效果。

不同于YAN等[14]的研究（僅含耐藥念珠菌），本研究同時納入對氟康唑敏感及耐藥的菌株，更全面地評估PAB的抑菌效果。結(jié)果表明，PAB與氟康唑聯(lián)用對耐藥菌株的協(xié)同抑菌效果較敏感菌株更為明顯。這與黃連堿、藥根堿、黃藤素與氟康唑的聯(lián)用結(jié)果類似。汪承英等[10]證實這3種生物堿與氟康唑聯(lián)用對氟康唑敏感白念珠菌無協(xié)同抗菌活性，但對耐藥白念珠菌臨床分離株均有顯著的協(xié)同抗菌作用。原因可能與中藥成分的作用機制有關(guān)，如小檗堿聯(lián)用氟康唑可降低念珠菌耐藥基因CDR1、CDR2及MDR1的表達[15]，從而對耐藥的菌株有更為明顯的抑菌效果。

綜上所述，PAB不僅自身能抑制白念珠菌的生長，與氟康唑聯(lián)用還有較好的協(xié)同抑菌效果，尤其對耐氟康唑的菌株，較低的藥物濃度就可以達到較好的抑菌效果。但2種藥物協(xié)同抑菌的機制尚不明確，有待進一步的研究。本研究結(jié)論可為臨床抗真菌感染及新型抗真菌藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。